3.1.3.1.Kiểm tra độ tinh khiết
Các hợp chất tạo thành đƣợc kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng, riêng pioglitazone còn đƣợc kiểm tra bằng cách đo nhiệt độ nóng chảy.
Sắc ký lớp mỏng (SKLM)
Tiến hành trên bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel 60 F254. Đối với mỗi phản ứng, sản phẩm đƣợc hòa tan vào dung môi ethylacetat, chạy sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi n-hexan: ethylacetat= 2:1hoặc ethylacetat: ethanol= 1:1. Sau khi chạy sắc ký, soi bản mỏng dƣới đèn tử ngoại có bƣớc sóng 254 nm, nhận thấy các chất đều cho một vết gọn, rõ. Giá trị Rf của các sản phẩm trung gian và pioglitazone khi khai triển với hệ dung môi trên đƣợc tổng kết ở bảng 3 dƣới đây:
Bảng 3:Giá trị Rf của các sản phẩm trung gian trong quy trình và pioglitazon
TT Ký hiệu Công thức cấu tạo Rf Hệ dung môi
1 3 0,51 n-hexan: EtOAc=
2:1
2 4 0,48 n-hexan: EtOAc=
3 5 0,49 EtOAc:EtOH=1:1
4 1 0,54 EtOAc: EtOH=
1:1
Ghi chú: Rf là hệ số lƣu giữ
Từ giá trị Rf của các hợp chất, ta thấy các chất đƣợc tổng hợp đều có giá trị Rf nằm trong khoảng từ 0,2-0,8. Từ sắc ký đồ khi chạy SKLM, có thể sơ bộ kết luận các chất này là tinh khiết và đủ điều kiện để tiến hành đo phổ.
Đo nhiệt độ nóng chảy
Pioglitazon đƣợc tiến hành đo nhiệt độ nóng chảy. Kết quả cho thấy sản phẩm thu đƣợc có giá trị điểm chảy rõ ràng: từ 172-175oC, phù hợp với nhiệt độ nóng chảy công bố trong một số tài liệu tham khảo [9]. Từ giá trị điểm chảy, có thể kết luận pioglitazon thu đƣợc sau 4 phản ứng là tinh khiết, có nhiệt độ nóng chảy nằm trong khoảng nhiệt độ nóng chảy đã đƣợc công bố trƣớc đó.
3.1.3.2. Khẳng định cấu trúc
(1)Phổ khối lượng (MS)
Hợp chất pioglitazon tổng hợp đƣợc đƣợc ghi phổ khối lƣợng theo phƣơng pháp phun mù điện tử (ESI-MS) trên máy LC-MSD-Trap-SL tại Viện Hóa học các hợp chất tự nhiên- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Hình ảnh phổ đƣợc thể hiện ở hình 4 dƣới đây. Từ kết quả phổ MS, cho thấy pic phân tử m/z 357,1 ([M+H]+) phù hợp với CTPT dự kiến.
Hình 4:Phổ MS của pioglitazon
(2)Phổ hồng ngoại IR
Phổ hồng ngoại của pioglitazon đƣợc ghi trên máy Perkin Elmer tại Viện Hóa học- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Kết quả phân tích số liệu phổ hồng ngoại đƣợc ghi ở bảng 4 dƣới đây:
Bảng 4: Dữ liệu phổ IR của pioglitazon Phổ IR (KBr), cm-1 NH (carbamid) CH (vòng thơm) C=O (vòng 5 cạnh) C=C (nhân thơm) C-O-C (ether) 3468 2965 1704, 1739 1517,1608 1254
Ghi chú: là dao động hóa trị.
(3)Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton và 13C đƣợc ghi trong dung môi thích hợp (CDCl3 hoặc DMSO- d6) trên máy AVANCE Spectrometer AV500 (BRUKER, Đức), Viện hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Kết quả phân tích số liệu phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C- NMR của các hợp chất 3,4,5,1 đƣợc ghi ở các bảng 5,6 dƣới đây:
Bảng 5: Số liệu phổ 1H-NMR của pioglitazon và các sản phẩm trung gian Ký
hiệu Công thức cấu tạo Dung môi 1 H-NMR(500MHz) ; (ppm), J(Hz)) 3 CDCl3 1,23 (t, J = 7,5 Hz, 3H); 2,62 (q, J = 7,5 Hz, 2H); 2,89 (s, 3H), 3,18 (t, J = 6,5 Hz, 2H); 4,62 (t, J = 6,5 Hz, 2H); 7,13 (d, J = 8,0 Hz, 1H); 7,47 (dd, J = 8,0 Hz, J = 2,5 Hz, 1H);8,38 (d, J = 2,5 Hz, 1H). 4 CDCl3 1,23 (t, J = 7,5 Hz, 3H); 2,62 (q, J = 7,5 Hz, 2H); 3,25 (t, J = 6,5 Hz, 2H); 4,43 (t, J = 6,5 Hz, 2H); 7,00 (dd, J = 7,0 Hz, J = 1,5 Hz, 2H); 7,18 (d, J = 8,0 Hz, 1H);7,45 (dd, J = 8,0 Hz, J = 2,5 Hz, 1H); 7,47 (dd, J = 7,0 Hz, J= 1,5 Hz, 2H); 8,39 (d, J = 2,5 Hz, 1H); 9,85 (s, 1H). 5 DMSO-d6 1,17 (t, J = 7,5 Hz, 3H); 2,59 (q, J = 7,5 Hz, 2H); 3,16 (t, J = 6,5 Hz, 2H); 4,41 (t, J = 6,5 Hz,
2H);7,08 (d, J = 7,0 Hz, 2H); 7,27 (d, J = 8,0 Hz, 1H);7,52 (d, J = 8,0 Hz, 1H); 7,56 (dd, J = 8,0 Hz, J = 2,0 Hz, 2H); 7,73 (s, 1H); 8,36 (d, J = 1,5 Hz, 1H). 1 DMSO-d6 1,16 (t, J = 7,5 Hz, 3H); 2,58 (q, J = 7,5 Hz, 2H); 3,03 (dd, J = 9,0 Hz, J = 14,0 Hz, 1H); 3,12 (t, J = 6,5 Hz, 2H); 3,03 (dd, J = 4,0 Hz, J = 14,0 Hz, 1H); 4,29 (t, J = 6,5 Hz, 2H); 4,83 (dd, J = 4,0 Hz, J = 9,0 Hz, 1H); 7,00 (d, J = 7,0 Hz, J = 1,5 Hz, 2H); 7,18 (d, J = 8,0 Hz, 1H);7,47 (dd, J = 8,0 Hz, J = 2,5 Hz, 2H); 7,80 (dd, J = 7,0 Hz, J = 1,5 Hz, 2H); 8,39 (d, J = 2,0 Hz, 1H).
Ghi chú: J là hằng số tƣơng tác (Hz), là độ dịch chuyển hóa học (ppm).
Bảng 6: Số liệu phổ 13C-NMR của pioglitazon và các sản phẩm trung gian Ký
hiệu Công thức cấu tạo Dung môi 13 C-NMR (125 MHz) δ(ppm) 3 CDCl3 15,2; 25,7; 37,0; 37,2; 69,2; 123,5; 136,2; 137,7; 150,0; 153,6. 4 CDCl3 15,2; 25,7; 37,2; 67,6; 114,8; 123,3; 129,9; 131,9; 135,9; 137,2; 149,0; 155,0; 163,9; 190,7.
5 DMSO-d6 15,3; 24,9; 36,5; 67,2; 115,3; 120,3; 123,0; 125,4; 131,7; 132,0; 135,7; 136,7; 148,5; 155,1; 160,1; 167,4; 167,9. 1 DMSO-d6 15,8; 25,4; 36,8; 37,2; 53,5; 67,2; 114,8; 123,5; 129,1; 130,8; 136,1; 137,1; 149,0; 155,9; 157,9; 172,2; 176,3.
Ghi chú: là độ dịch chuyển hóa học (ppm).
3.2. Bàn luận
Pioglitazonđƣợc tổng hợp từ trái qua phải theo 4 bƣớc trong sơ đồ sau:
Sơ đồ 8: Quy trình tổng hợp pioglitazon theo 4 bƣớc
Quá trình đi từ hợp chất ban đầu là 2. Đầu tiên, nhóm alcol trong chất2 đƣợc hoạt hóa bởi methansulfonyl clorid để phản ứng tạo hợp chất ether 4 của alcol bậc 1 (2) và hợp chất phenol (p-hydroxy benzaldehyd) có thể xảy ra. Hợp chất ether 4 sau khi tạo thành sẽ đƣợc phản ứng với thiazolidin để tạo ra alken 5.
Alken này sau khi đƣợc khử liên kết đôi sẽ thu đƣợc sản phẩm cuối cùng là pioglitazone1. 3.2.1. Về phản ứng tổng hợpchất 2-(5-ethylpyridin-2-yl)ethyl methansulfonat (3) 3.2.1.1.Về tổng hợp hóa học Sơ đồ 9: Phản ứng tổng hợp chất 3
Hợp chất mesylat 3 đƣợc tạo thành nhờ phản ứng gắn nhóm mesyl vào chất
2 trong môi trƣờng base và dung môi thích hợp. Phản ứng đƣợc thực hiện ở nhiệt
độ phòng do methyl sulfonylclorid là một tác nhân ái nhân tốt nên phản ứng xảy ra dễ dàng với hiệu suất cao.Hiệu suất của phản ứng này đạt 76%.
Phản ứng này diễn ra theo cơ chế thế ái nhân SN[36], với tác nhân ái nhân là nhóm mesyl:
Hình 6: Các cơ chế trong phản ứng tạo thành chất (3)
Trong phản ứng này, nhóm OH của chất 2 cần phải đƣợc hoạt hóa nhờ các tác nhân thích hợp bởi phản ứng tạo thành hợp chất ether giữa alcol 2 và dẫn chất
phenol rất khó xảy ra. Tác nhân có thể lựa chọn để hoạt hóa nhóm OH của dẫn chất ethanol có thể là mesyl, tosyltrong môi trƣờng kiềm.
Đối với tác nhân tosyl hóa, Meguro K. và cộng sự đã tiến hành phản ứng trong điều kiện benzyl tert-butyl amoniclorid (BTBAC) và dung môi
dicloromethan[24].
Sơ đồ 13: Phản ứng hoạt hóa nhóm OH sử dụng tác nhân p-tosyl
Trong môi trƣờng kiềm, phản ứng còn có thể xảy ra theo cơ chế tách loại E, cơ chế này cạnh tranh với cơ chế thế ái nhân SN, cũng là nguyên nhân làm giảm hiệu suất phản ứng và tạo ra sản phẩm phụ. Để hạn chế phản ứng xảy ra theo cơ chế tách loại, thay vì lựa chọn base NaOH và dung môi phân cực (dicloromethan), chúng tôi lựa chọn base yếu hơn là TEA và dung môi không phân cực (toluen khan) và tiến hànhphản ứng ở nhiệt độ thấp (từ 0-5oC). 3.2.1.2. Về xác định cấu trúc
Hợp chất 3 đƣợc tạo thành sau khi tinh chế bằng sắc ký cột đƣợc tiến hành ghi phổ cộng hƣởng từ hạt nhân trong dung môi CDCl31H-NMR và 13C-NMR.
(1)Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR
Phổ 1H- NMR cho thấy các tín hiệu đặc trƣng của các proton trong sản phẩm dự kiến, thông qua các số liệu về độ dịch chuyển hóa học, độ bội, hằng số tƣơng tác J và cƣờng độ của các pic, đã đƣợc trình bày trong bảng 5 phía trên. Số tín hiệu proton xuất hiện trong phổ 1H- NMR tƣơng ứng với số nguyên tử hydro trong công thức hóa học dự kiến của sản phẩm.
Trên phổ đồ của hợp chất 3 cho thấy:
- Vòng pyridin có tín hiệu proton ở7,13 ppm (d, J = 8,0 Hz, J = 2.5 Hz, 1H); 7,47 ppm (dd, J = 8,0 Hz, J = 2,5 Hz, 1H); 8,38 ppm (d, J = 2,5 Hz, 1H). - Các proton trong nhóm ethyl xuất hiện với độ dịch chuyển hóa học: 1,23
ppm (t, J = 7,5 Hz, 3H) và 2,62 ppm (q, J = 7,5 Hz, 2H). - Tín hiệu của proton nhóm mesyl ở2,89 ppm.
- Các tín hiệu của proton các nhóm CH2 xuất hiện ở3,18 ppm(t, J = 6,5 Hz, 2H) và 4,62 ppm (t, J = 6,5 Hz, 2H).
(2)Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR
Hợp chất 3 đã đƣợc ghi phổ 13C-NMR. Kết quả phân tích phổ đƣợc trình bày ở bảng 6 cho thấy hợp chất có số nguyên tử carbon và độ dich chuyển hóa học của các vị trí carbon trong công thức phân tử phù hợp với công thức dự kiến.
Phổ đồ còn cho thấy số lƣợng nguyên tử carbon và độ dịch chuyển hóa học đặc trƣng của carbon nhân thơm.
- Tín hiệu của C trong các nhóm methyl, ethyl nằm trong khoảng từ 0- 40ppm.
- Tín hiệu của C trong dị vòng thơm nằm từ 123,5- 153,6 ppm.
Từ các dữ liệu phổ thu đƣợc, có thể khẳng định hợp chất 3 đã tổng hợp
đƣợc là tinh khiết và đúng nhƣ dự kiến.
3.2.2. Về phản ứng tổng hợp 4-(2-(5-ethylpyridin-2-yl)ethoxy) benzaldehyd (4)
3.2.2.1. Về tổng hợp hóa học
Sơ đồ 10: Phản ứng tổng hợp chất4
Liên kết ether C-O trong hợp chất 4 đƣợc tạo thành nhờ phản ứng tổng hợp ether[6]. Phản ứng tạo ether của hợp chất phenol diễn ra rất khó khăn, vì thế không thể trực tiếp cho chất 2 phản ứng với 4-hydroxybenzaldehyd để tạo ra chất 4 . Do đó, từ phản ứng trƣớc, nhóm thế mesyl đã đƣợc sử dụng với vai trò leaving group để hoạt hóa dẫn chất ethanol 2, làm cho phản ứng tổng hợp ether có khả năng xảy ra dễ dàng hơn. Base sử dụng trong phản ứng này có thể là kali hydroxid [8], kali- tert-butoxid[13] hoặc kali carbonat. Kali carbonat đƣợc lựa chọn vì tính an toàn và phổ biến,cũng nhƣ mức độ tinh khiết của sản phẩm tạo ra sau phản ứng. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh phản ứng này diễn ra tốt nhất
trong môi trƣờng toluen-ethanol hoặc isopropanol-toluen-nƣớc ở 77-800
C[11, 28].
Hiệu suất của phản ứng đạt 70%.
Có thể tiến hành lần lƣợt 2 phản ứng tạo dẫn xuất mesylat và phản ứng tổng hợp ether trong cùng 1 bƣớc, vì điều kiện của chúng khá giống nhau. Tuy nhiên, kết quả tiến hành 2 phản ứng này trong 1 giai đoạn lại gây khó khăn cho quá trình thu sản phẩm, làm giảm hiệu suất tinh chế.
3.2.2.2. Về xác định cấu trúc
Hợp chất 4 tạo thành sau khi tinh chế bằng sắc ký cột đƣợc tiến hành ghi phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR trong dung môi CDCl3.
(1)Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR
Phổ 1H- NMR cho thấy các tín hiệu đặc trƣng của các proton trong sản phẩm dự kiến, thông qua các số liệu về độ dịch chuyển hóa học, độ bội, hằng số tƣơng tác J và cƣờng độ của các pic, đã đƣợc trình bày trong bảng 5 phía trên. Số tín hiệu proton xuất hiện trong phổ 1H- NMR tƣơng ứng với số nguyên tử hydro trong công thức hóa học dự kiến của sản phẩm.
Trên phồ đồ của hợp chất 4 cho thấy: - Không còn tín hiệu của nhóm mesyl.
- Xuất hiện thêm 1 vòng thơm nữa ở 7,00 ppm(dd, J = 7,0 Hz, J= 1,5 Hz, 2H), 7,47 ppm (dd, J = 8,0 Hz, J = 2,5 Hz, 2H).
- Xuất hiện tín hiệu của aldehyd ở 9,85 ppm.
(2)Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR
Hợp chất 4 đã đƣợc ghi phổ 13C-NMR. Kết quả phân tích phổ đƣợc trình bày ở bảng 6cho thấy hợp chất có số nguyên tử carbon và độ dịch chuyển hóa học của các vị trí carbon trong công thức phân tử phù hợp với công thức dự kiến.
Trên phổ đồ của hợp chất 4 cho thấy:
- Tín hiệu của nhóm aldehyd ở 190,7 ppm.
Từ các dữ liệu phổ thu đƣợc, có thể khẳng định hợp chất 4 thu đƣợc là tinh khiết và đúng nhƣ dự kiến.
3.2.3. Về phản ứng tổng hợp 5-(4-(2-(5-ethylpyridin-2-yl)ethoxy) benzyliden thiazolidin-2,4-dion (5)
3.2.3.1. Về tổng hợp hóa học
Sơ đồ 11:Phản ứng tạo thành chất5
Hợp chất 5 đƣợc tạo thành nhờ phản ứng ngƣng tụ Knoevenagel. Trong phản ứng này, piperidin là base xúc tác cho phản ứng, hợp chất thiazolidindion là chất chứa nhóm CH2 linh động. Dung môi có thể sử dụng cả MeOH hoặc EtOH, trong môi trƣờng MeOH, sản phẩm có thể tinh khiết đến 99% sau vài lần kết tinh nhƣng vì độc tính của MeOH mà phản ứng đã đƣợc tiến hành trong dung môi EtOH. Sau phản ứng, liên kết C=C đƣợc hình thành tạo ra chất 5 có thể là hỗn hợp các đồng phân hình học nhƣ hình 6: đồng phân E(E-isomer) và đồng phân
Z(Z-isomer). Phản ứng đạt hiệu suất 71%, chất 5 thu đƣợc sau tinh chế có thể
tinh khiết đến 99% và quá trình tinh chế này khá đơn giản.
Hình 7:Hai đồng phân hình học của chất5
Mặt khác, dung môi sử dụng trong phản ứng cũng ảnh hƣởng đến cấu trúc hình học của chất 5 thu đƣợc. Nếu tiến hành phản ứng trong dung môi
ethylacetat thì sẽ thu đƣợc đồng phân Zlà chủ yếu, còn nếu tiến hành phản ứng trong hỗn hợp dung môi DCM - ethanol thì lại thu đƣợc đồng phân E là chủ yếu[35].
Phản ứng này là một phản ứng thuận nghịch, vì thế cần chú ý loại nƣớc để phản ứng xảy ra với hiệu suất cao hơn.Khi tiến hành thực nghiệm, ban đầu các chất đầu đƣợc sử dụng với tỷ lệ mol chất (4): thiazolidindion =1: 1,2 nhƣ trong tài liệu tham khảo[28]. Tuy nhiên, sau khi tiến hành phản ứng và theo dõi trong 13 giờ thì nhận thấy chất đầu vẫn không hết nên đã tiến hành phản ứng lại với tỷ lệ 1:2 thì sau 3 giờ, qua theo dõi phản ứng bằng TLC thấy hỗn hợp sản phẩm không còn chất đầu. Do đó, trong quá trình phản ứng, cần chú ý đến tỷ lệ mol các chất tham gia phản ứng để phản ứng xảy ra hoàn toàn. Mặt khác, từ thực nghiệm cho thấy, sản phẩm 5 của phản ứng khi để lâu có thể biến đổi, do vậy nên tiến hành phản ứng tiếp theo ngay khi thu đƣợc chất 5 hoặc bảo quản trong điều kiện thích hợp.
3.2.3.2. Về xác định cấu trúc
Hợp chất 5 tạo thành sau khi tinh chế đƣợc tiến hành ghi phổ cộng hƣởng từ hạt nhân1H-NMR và 13C-NMR trong dung môi DMSO-d6.
(1)Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR
Phổ 1H- NMR cho thấy các tín hiệu đặc trƣng của các proton trong sản phẩm dự kiến, thông qua các số liệu về độ dịch chuyển hóa học, độ bội, hằng số tƣơng tác J và cƣờng độ của các pic, đã đƣợc trình bày trong bảng 5. Số tín hiệu proton xuất hiện trong phổ 1H- NMR tƣơng ứng với số nguyên tử hydro trong công thức hóa học dự kiến của sản phẩm.
Trên phổ đồ củachất 5 cho thấy:
- Không còn tín hiệu của proton nhóm aldehyd.
- Tín hiệu của proton trong vòng thơm nằm trong khoảng 7,08-8,36 ppm. - Tín hiệu của proton trong liên kết đôi mới đƣợc tạo thành xuất hiện ở
7,73ppm (s, 1H), cho thấy alken 5 tạo thành sau phản ứng tồn tại chủ yếu ở dạng đồng phân Z[35].
(2)Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR
Hợp chất 5 đã đƣợc ghi phổ 13C-NMR. Kết quả phân tích phổ đƣợc trình bày ở bảng 6cho thấy hợp chất có số nguyên tử carbon và độ dich chuyển hóa học của các vị trí carbon trong công thức phân tử phù hợp với công thức dự kiến.
Phổ đồ còn cho thấy số lƣợng nguyên tử carbon và độ dịch chuyển hóa học đặc trƣng của carbon nhân thơm.
Tín hiệu của nguyên tử C trong liên kết đôi tạo thành ở 148,5ppm.
Tín hiệu của các nhóm C=O trong vòng thiazolidin ở khoảng 160ppm (167,4 và 167,9 ppm).
Từ các dữ liệu phổ thu đƣợc, có thể khẳng định hợp chất 5 thu đƣợc là tinh khiết và có công thức cấu tạo đúng nhƣ dự kiến.
3.2.4. Về phản ứng tổng hợp pioglitazon(1)
3.2.4.1. Về tổng hợp hóa học
Sơ đồ12:Phản ứng tạo thành pioglitazon
Pioglitazon đƣợc tạo thành từ hợp chất 5 nhờ phản ứng khử liên kết đôi đƣợc tạo thành trong phản ứng trƣớc đó. Do 5 kém tan trong các dung môi thông
thƣờng nhƣ methanol, ethanol nên phản ứng khử để tổng hợp pioglitazone này có khá nhiều bất lợi.
Nếu tiến hành phản ứng trong điều kiện Pd/C trong DMF, THF hay dioxan thì cần phải có một lƣợng lớn chất xúc tác ở nhiệt độ và áp suất cao, trong khi đó giá thành cho xúc tác Pd lại lớn, không tái tạo sau phản ứng nên cho dù hiệu suất