hexan từ rễ củ Thổ phục linh
2.2.2.Thử hoạt tính ức chếenzym α- glucosidase của các chất phân lập được
(thử in vitro)
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1.Phương pháp chiết
Phương pháp chiết rắn-lỏng: Sử dụng dung môi hữu cơ có diện hoà tan rộng để chiết các chất hữu cơ có trong mẫu cần phân tích. Dùng kỹ thuật chiết ngâm dần kết hợp với phương pháp siêu âm để rút ngắn thời gian chiết.
Phương pháp chiết lỏng-lỏng: Sử dụng để chiết cao alcol thô ban đầu chứa các hợp chất hữu cơ từ phân cực đến không phân cực thành các phân đoạn có tính phân cực khác nhau. Sự chiết dựa trên sự hoà tan của các chất có độ phân cực khác nhau trong các dung môi khác nhau, chất phân cực mạnh tan tốt trong dung môi phân cực mạnh;chất kém phân cực tan tốt trong dung môi kém phân cực.
2.3.2. Các phương pháp sắc ký
- Sắc ký cột (CC): Sau khi lựa chọn hệ dung môi thích hợp bằng sắc ký lớp mỏng, sử dụng sắc ký cột để tách chất.
-Sắc ký lớp mỏng (TLC): Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254, RP18 F254s. Phát hiện vết bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 365nm. Thuốc thử hiện màu là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, đốt từ từ đến khi hiện màu. Sắc ký lớp mỏng được dùng để khảo sát, lựa chọn dung môi thích hợp cho sắc ký cột.
-Sắc ký lớp mỏng điều chế: được thực hiện trên bản mỏng tráng silicagel 60G F254 (Merck). Phát hiện vết bằng đèn tử ngoại, có thể cắt 1 phần bản mỏng, nhúng vào dung dịch H2SO4 10%, đốt đến khi hiện màu để phát hiện vết. Cạo lớp silicagel có chất cần bắt rồi giải hấp thụ bằng dung môi thích hợp.
2.3.3. Các phương pháp phân tích cấu trúc bằng phổ
Cấu trúc của các chất đã phân lập được xác định dựa trên dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, chất nội chuần là tetramethylsilane.
2.3.4. Phương pháp thử hoạt tính ức chế α-glucosidase [11]
Hoạt tính ức chế enzym -glucosidase được thực hiện dựa vào phản ứng thủy phân p-nitrophenyl--D-glucopyranoside thành đường glucose và p- nitrophenol, hợp chất có màu vàng, dưới xúc tác của enzym -glucosidase.
p-nitrophenyl-α-D-Glucopyranosidep-ntrophenol +α-D-Glucopyranoside
Khi mẫu thử có hoạt tính ức chế enzymα-glucosidase, sự tạo thành hợp chất p-nitrophenol sẽ giảm, do vậy mật độ quang đo được cũng sẽ giảm. Mật độ quang của p-nitrophenol sinh ra sau phản ứng được đo trên máy ELISA ở bước sóng 405 nm.
Giá trị mật độ quang được dùng để tính tỷ lệ phần trăm ức chế ở mỗi nồng độ thử. Từ đó tính ra giá trị IC50 là nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốctự do,tế bào hoặc enzym. Giá trị IC50 càng thấp thì mẫu có hoạt tính càng cao vàngược lại, giá trị IC50 càng cao thì mẫu có hoạt tính càng thấp
2.3.5. Phương pháp xử lí số liệu
Giá trị IC50 được tính toán bằng phần mềm Excel dựa trên đồ thị thể hiện mối tương quan giữa nồng độ và % ức chế của mẫu thử ở 5 nồng độ khác nhau.
Kết quả được biểu thị bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD) từ kết quả của 3 thí nghiệm lặp lại.
Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Phân lập các hợp chất
Sơ đồ 3.1.1.Các phân đoạn dịch chiết Ethanol của cây Thổ phục linh (Smilax glabra Wall. ex Roxb.)
Chiết EtOH 90%, 3 lần
Bổ sung 1L nước
Chiết với n-hexan 0,5L x3 lần
CC, gradient H-A (100:0-0:100, v/v) CC, YMC RP-18 aceton- nước 5/1, v/v F5.1 F5.2 Chất (1) 6.1mg Cặn EtOH (115g) Lớp nước Cặn n-hexan (7.5g) F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7
Bột rễSmilax glabra Roxb 900g
1.CC, pha đảo RP-18
methanol-nước 5/1, v/v 2. CC,silicagel (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Rễ Thổ phục linh thu hái về rửa sạch, phơi khô, rồi xay nhỏ.
Bột rễ khô của cây Thổ phục linh (900g) được chiếtsiêu âm vớiethanol 90% ở nhiệt độ 500C trong 30 phút,tiến hành 3 lần mỗi lần 2 lítethanol. Gộp các dịch chiết, đem loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được 115g cặn ethanol.
Phân tán cặnethanol trong 1 lít nước, thêm 0,5 lít n-hexan, sau đó lắc cho 2 lớp dung dịch phân tán đều vào nhau, để phân lớp trong phễu chiết 2 giờ, thu riêng phần nước và n-hexan. Phần nước chiết lặp lại với n-hexan 2 lần, mỗi lần 0,5 lít. Gom dịch chiết n-hexan, cô quay dưới áp suất giảm thu được 7,5g cặnn-hexan.
Cặn n-hexan được phân tách trên cột sắc ký pha thường với hệ dung môi
n-hexan-aceton có gradient nồng độaceton từ 0 đến 100% thể tích,thu được 7 phân đoạn nhỏ từ F1-F7.
Phân đoạn F5 tiếp tục chạy sắc ký cột pha đảo RP18, hệ dung môi aceton- nước tỷ lệ 5/1v/v. Khảo sát các phân đoạn thu được bằng SKLM, các phân đoạn giống nhau gộp chung lại, thu được 2 phân đoạn nhỏ là F5.1 và F5.2.
Phân lập phân đoạn F5.2 trên cộtsắc ký pha đảo RP-18 với hệ dung môi rửa giảiaceton-nước 5/1v/v, sau đó tiếp tục làm sạch trênsắc ký cột pha thường với hệ dung môi n-hexan- aceton 3/1v/v, thu được chất tinh khiết (1). 3.2. Xác định cấu trúc Dữ liệu phổ NMR của chất(1): -1HNMR (500 MHz, CDCl3): δ 0,69 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-5); 0,75 (3H, br s, H-24), 0,82 (3H, br s, H-25), 0,93 (3H, br s, H-26), 0,96 (3H, br s, H-23), 0,97 (3H, br s, H-27), 1,69 (3H, br s, H-30), 3,00 (1H, m, J = 5,0 Hz, H-18), 3,19 (1H, dd, J =11,5, 5,0 Hz, H-3), 4,61 (1H, s, H-29b), 4,74 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-29a).
- 13CNMR (125 MHz, CDCl (C-4), 55,3 (C-5), 18,3 (C 20,8 (C-11), 25,5 (C-12), 38,7 (C 56,3 (C-17), 46,9 (C-18), 49,3 (C 28,0 (C-23), 15,3 (C-24), 16,0 (C 109,7 (C-29), 19,3 (C-30) Hợp chất (1) thu đượ Trên phổ 1HNMR cho th
vùng trường cao tại δH0,75 (3H, br s, H br s, H-26), 0,96 (3H, br s, H
30) ppm, một nối đôi ngo hiệu proton tại δH4,61 (1H, s, H tín hiệu của một proton nhóm ox δH3,19 (1H, dd, J =11,5, 5,0 Hz, H của nhóm methylen trong vùng trư
Hình 3. NMR (125 MHz, CDCl3): 38,8 (C-1); 27,4 (C-2), 79,0 (C 5), 18,3 (C-6), 34,3 (C-7), 40,7 (C-8), 50,5 (C-9), 37,2 (C 12), 38,7 (C-13), 42,4 (C-14), 30,5 (C-15), 32,1 (C 18), 49,3 (C-19), 150,4 (C-20), 29,7 (C-21), 37,0 (C 24), 16,0 (C-25), 16,1 (C-26), 14,7 (C-27), 180,2 (C 30) ợc dưới dạng bột màu trắng.
HNMR cho thấy sự có mặt của 6 nhóm methyl ở 0,75 (3H, br s, H-24), 0,82 (3H, br s, H-
26), 0,96 (3H, br s, H-23), 0,97 (3H, br s, H-27) và 1,69 (3H, br s, H i đôi ngoại vòng dạng H2C=C< được xác nhậ
4,61 (1H, s, H-29b), 4,74 (1H, d, J = 1,5 Hz, H t proton nhóm oxy metin do có giá trị cao hơn b
=11,5, 5,0 Hz, H-3). Ngoài ra còn xuất hiện 10 píc tín len trong vùng trường δH 1,1 – 2,38.
Hình 3.1. Phổ 1HNMR của hợp chất (1) 2), 79,0 (C-3), 38,4 9), 37,2 (C-10), 15), 32,1 (C-16), 21), 37,0 (C-22), 27), 180,2 (C-28), dạng singlet ở -25), 0,93 (3H, 27) và 1,69 (3H, br s, H- ận bằng các tín = 1,5 Hz, H-29a) và một cao hơn bình thường tại n 10 píc tín hiệu
Trên phổ 13CNMR xuất hiện 30 tín hiệu carbon, kết hợp với phổ DEPT cho thấy hợp chất 1 gồm 6 nhóm methyl tại δC28,0 (C-23), 15,3 (C-24), 16,0 (C-25), 16,1 (C-26), 14,7 (C-27), và 19,3 (C-30); 11 nhóm methylen trong vùng trường δC38,8 (C-1), 27,4 (C-2), 18,3 (C-6), 34,3 (C-7), 20,8 (C-11), 25,5 (C-12), 30,5 (C-15), 32,1 (C-16), 29,7 (C-21), 37,0 (C-22) và một nhóm methylen cao hơn hẳn với các nhóm khác do nhóm này thuộc liên kết đôi tại tín hiệu δC 105,9 (C-29); 6 nhóm methyl xuất hiện những tín hiệu tại δC55,3 (C-5), 50,5 (C-9), 38,7 (C-13), 46,9 (C-18), 49,3 (C-19), trong đó có một nhóm có giá trị cao hơn bình thường tại δC 76,1 và 7 nhóm carbon không chứa hiđro tại δC38,4 (C-4), 40,7 (C-8), 37,2 (C-10), 42,4 (C-14), 56,3 (C-17), trong đó có một tín hiệu có giá trị cao thuộc nhóm carboxyl tại δC177,1 (C- 28) và một nhóm thuộc liên kết đôi tại δC 150,4 (C-20).
Hình 3.3. Phổ DEPT của hợp chất (1)
Qua những phân tích này cho thấy hợp chất (1) thuộc nhóm chất triterpen có khung lupan.
Dựa vào dữ kiện phổ trên và kết hợp với tài liệu tham khảo[15] ta xác định hợp chất (1) là axit betulinic, có công thức phân tử là C30H48O3.
COOH HO 2 3 4 5 6 7 8 9 10 15 19 21 22 24 25 26 28 29 30 1 23 12 27 11 14 17 13 16 18 20
3.3. Thử hoạt tính ức chế enzymα-glucosidase[11]
Hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase được thử trên dịch chiết ethanol, dịch chiết n-hexan, acid betunilic (1), acarbose, hỗn hợp gồm acid betunilic và acarbose (tỉ lệ 1/1).
Phản ứng enzym được thực hiện bằng cách sử dụngp-NPG làm cơ chất trong đệm phosphat0,1M; pH = 7,0.
3.3.1. Quá trình tiến hành
Mẫu thử được pha trong DMSO rồi pha loãng ở các nồng độ thích hợp trong đệm phosphat (0.1M, pH7). Tra vào phiến 96 giếng 5μL mẫu cùng với 45 μL enzym α-glucosidase (10 U/mL) và 5µL đệm phosphat 0.1M (pH=7) rồi ủ ở 37oC trong 5 phút. Sau đó bổ sung 45 μL p-NPG (5 mM pha trong đệm phosphat 0.1M, pH=7) vào mỗi giếng, rồi tiếp tục ủ hỗn hợp trong 30 phút ở 37°C.
Sử dụng acarbose làm chất đối chứng.
Hoạt động của enzym được định lượng bằng cách đo độ hấp thụ của sản phẩm p-nitrophenol ở bước sóng 405 nm.
Thực hiện 3 lần mỗi nồng độ thử, và thử ở 5 nồng độ khác nhau. Hoạt tính ức chế được tính theo công thức:
% Ức chế = (C − A)/(B − A) × 100%. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trong đó:
A: Mật độ quang trung bình của mẫu đối chứng (không có chất nghiên cứu, có enzymα-glucosidase và p-NPG)
B: Mật độ quang trung bình của mẫu trắng (chỉ có dung dịch p-NPG) C: Mật độ quang trung bình của mẫu thử.
3.3.2. Kết quả
Kết quả sàng lọc các dịch chiết cho thấy dịch chiết cồn có tác dụng ức chế 32% ở nồng độ thử 100 µg/mL, trong khi đó dịch chiết phân đoạn n-hexan có
tác dụng mạnh hơn (41%). Dựa theo kết quả này, chúng tôi lựa chọn phân đoạn n-hexan để nghiên cứu sâu hơn nhằm phát hiện hoạt chất có tác dụng ức chế enzym α-glucosidase.
Bằng các phương pháp sắc ký kết hợp, hợp chất sạch acid betulinic đã được phân lập và xác định cấu trúc. Hợp chất này thể hiện tác dụng ức chế enzym α-glucosidase rất mạnh, với giá trị IC50 là 72,1% µg/mL, mạnh hơn nhiều so với chứng acarbose (Bảng 3.2).
Bảng 3.1. Kết quả tỷ lệ phần trăm ức chế enzym α-glucosidase của cao chiết và chất sạch ở nồng độ 100 µg/mL Mẫu thử %Ức chế enzym Dịch chiết Ethanol 32.6 Dịch chiết n-hexan 41.7 Acid betulinic 55,6 Acarbose 14.1
Bảng 3.2.Giá trị IC50 của acid betulinic và acarbose (µg/mL)
Mẫu thử IC50 (µg/mL)
Acid betulinic (1) 72.1 ± 7.79 (157.8 M) Acarbose 478.6 ± 38.66 (742.0 M)
Hình 3.4. Đồ thị tỷ lệ phần trăm ức chế enzym α-glucosidase của cao chiết và chất sạch ở nồng độ 100 µg/mL
Nhậnxét:
Cả bốn mẫu thử đều có hoạt tính ức chế enzymα-glucosidase. Trong đó, hoạt tính ức chế enzym của chất sạch (acid betulinic) là cao nhất, của acarbose là thấp nhất.
Giá trị IC50 của acid betulinic thấp hơn so với của acarbose, bằng khoảng 1/5 giátrị IC50 của acarbose. Điều đó chứng tỏ acid betulinic có khả năng ức chế enzymα-glucosidase tốt hơn đáng kể so với acarbose.
Bảng 3.3. Kết quảtỷ lệ phần trăm ức chế enzymα-glucosidase khi dùng kết hợp acarbose và acid betulinic (tỷ lệ 1/1)
Nồng độ kết hợp (µg/mL) %Ức chế 1+1 4.9 5+5 27.4 10+10 54.3 100+100 79.8 0 10 20 30 40 50 60
Dịch chiết Ethanol Dịch chiết n-hecxan Acid Betulinic Acarbose
Hình 3.5. Đồ thị tỷ lệ ph độc và dùng
(1) 10 g/mL acid betulinic; (2) 100 g/mL acarbose;
(3) 10 g/mL acid betulinic + 10
(4)100 µg/mL acid betulinic + 100 µg/mL acarbose
Nhận xét:
Khả năng ức chế enzym so với acarbose: % ức ch dùng 100µg/mL acarbose là
Khi dùng kết hợp hai ho tăng lên đáng kể so với ức chế lên tới hơn 50% lên 100 µg/mL mỗi chấ tăng nồng độ kết hợp thì kh 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1 % Ức chế
phần trăm ức chế enzymα-glucosidase khi dùng dùng kết hợp acarbose và acid betulinic.
g/mL acid betulinic; g/mL acarbose;
g/mL acid betulinic + 10 g/mL acarbose; 4)100 µg/mL acid betulinic + 100 µg/mL acarbose
enzymα-glucosidase của acid betulinic cao hơn đáng k c chế khi dùng 10µg/mL acid betulinic kho
acarbose là14%. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
p hai hoạt chất này với tỉ lệ 1/1thì hoạt tính i khi dùng đơn độc từng hoạt chất này. Tỷ i hơn 50% ở nồng độ 10µg/mL mỗi chất.Tăng nồ
ất, tỷ lệ phần trăm ức chế tăng lên 80%. p thì khả năng ức chế enzym tăng.
2 3 4
glucosidase khi dùng đơn p acarbose và acid betulinic.
etulinic cao hơn đáng kể acid betulinic khoảng 35%, khi
t tính ức chế enzym ỷ lệ phần trăm ồng độ kết hợp tăng lên 80%. Như vậy, khi
BÀN LUẬN
Trước khi tiến hành nghiên cứu này, chúng tôi đã sơ bộ thử hoạt tính ức chế enzym α- glucosidase trên nhiều phân đoạn, kết quả chỉ ra ở phân đoạn dịch chiết n-hexan hoạt tính này cao hơn hẳn so với các phân đoạn khác. Chính vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung nghiên cứu trên phân đoạn n-hexan.
Từ phân đoạn dịch chiết n-hexan rễ củ Thổ phục linh (Smilax glabra
Roxb), phân lập được 1 hợp chất là acid betulinic. Betunilic là hợp chất có nhiều tác dụng đã được chứng minh như: ức chế sự phát triển của khối u ác tính và tế bào ung thư (ung thư phổi[8], ung thư gan, ung thư vú[7], ung thư buồng trứng...), chống viêm... Nghiên cứu này tiếp tục chứng minh tác dụng sinh học hạ đường huyết của Thổ phục linh có liên quan đến tác dụng của acid betulinic do ức chế enzym α-glucosidase ở ruột non.
ĐTĐ là một căn bệnh có tỷ lệ gia tăng cao ở Việt Nam, trở thành gánh nặng đối với gia đình và xã hội. Xuất phát từ tình hình dịch tễ bệnh ĐTĐ ở Việt Nam và nhu cầu của xã hội trong việc điều trị bệnh ĐTĐ, từ cácnghiên cứu trước về Thổ phục linh đã chứng minh được tác dụng hạ đường huyết của vị thuốc này, chúng tôi đã tiến hành thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase
in vitro của acid betulinic, hợp chất phân lập được từ phân đoạn dịch chiết n- hexan rễ củ Thổ phục linh (Smilax glabra Wall. ex Roxb.). Kết quả cho thấy acid betulinic có tác dụng ức chế enzymα-glucosidase. Đem so sánh với khả năng ức chế enzymα-glucosidase của acarbose, là một thuốc điều trị ĐTĐ type 2 khá phổ biến hiện nay, thì tác dụng này cao hơn đáng kể, điều đó thể hiện qua chỉ số tỷ lệ %Ức chế và IC50: IC50 của acarbose cao gấp 5 lần so với của acid betulinic; khi thử ở nồng độ 10 µg/mL, acarbose gần như không có tác dụng ức chế enzym, ở nồng độ 100 µg/mL khả năng ức chế cũng không đáng kể (chỉ ức chế khoảng 14%); trong khi đó acid betulinic khi ở nồng độ10
µg/mL đã có hoạt tính ức chế enzym (tỷ lệ %Ức chế khoảng 35%), ở nồng độ 50 µg/mLtỷ lệ phần trăm ức chế đã lên tới hơn 50%.
Theo kết quả nêu trên, để có tác dụng ức chế kiểm soát đường huyết thì liều acarbose phải dùng tương đối cao, trong khi bệnh nhân lại phải dùng thuốc liên tục cả đời, vì thế nên khả năng cao gặp nhiều tác dụng không mong muốn. Chính vì vậy chúng tôi lại tiếp tục thử hoạt tính ức chế enzymα- glucosidase khi dùng phối hợp hai hoạt chất này, với mong muốn tìm phương pháp để giảm liều acarbose mà vẫn đảm bảo tác dụng điều trị. Kết quả thu được nằm ngoài mong đợi, khi phối hợp hai hoạt chất với tỉ lệ 1/1 này ở nồng độ 10 µg/mL mỗi chất thì khả năng ức chế enzym α-glucosidase tăng lên đáng kể so với khi dùng đơn độc (tỷ lệ phần trăm ức chế hơn 50%),ở nồng độ 100 µg/mL thì tỷ lệ phần trăm ức chế lên tới 80%, điều này chứng tỏ khi tăng nồng độ thì tỷ lệ phần trăm ức chế enzym cũng tăng lên. Đây là kết quả rất có ý nghĩa trong việc điều trị tiểu đường, từ đó có thể định hướng tới việc sử dụng kết hợp hai hoạt chất này để điều trị tiểu đường, hoặc sản xuất ra một loại thực phẩm chức năng từ các dược liệu chứa acid betulinicdùng cùng acarbose để hỗ trợ điều trị tiểu đường. Điều này sẽ giúp giảm đáng kể liều dùng của acarbose nên sẽ giảm tác dụng không mong muốn khi điều trị liên tục dài ngày, và có thể giảm được chi phí điều trị.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
1. Kết luận
Sau quá trình thực hiện đề tài “Nghiên cứu thành phần hoá học và tác dụng ức chế α-glucosidase của phân đoạn n-hexan từ rễ củ Thổ phục linh (Smilax glabra Roxb)”, chúng tôi đã thu được những kết quả sau:
Về thành phần hoá học: từ phân đoạn n-hexan, phân lập được 1 chất là