Hóa chất dùng trong thí nghiệm

1. 4T ng quan về một số phương pháp sinh học phân tử sử ụng trong

2.1.3Hóa chất dùng trong thí nghiệm

Hóa chất pha dung dịch yếm khí: Dung dịch yếm hí được pha với tỉ lệ: 1 L hoáng đa lượng trộn với 1 mL hoáng vi lượng, 0,1 mL dung dịch vitamin, 4 mL hỗn hợp acid hữu cơ (acid pyruvic, acetic, butyric, propionic) và 1mL chất chỉ thị

22

yếm khí rezazurine. Thành phần các hoáng đa, trung, vi lượng và acid hữu cơ bao gồm các chất được trình bày trong phụ chương 2, 3 và 4.

Hóa chất sử dụng để trích và lọc Chlorpyrifos ethyl: Sử dụngcác loại dung môi có độ tinh khiết cao như ac ton (99,8%), tolu n (99,9%), h xan và DCM (99,7%) của hãng J.T.Baker.

Hóa chất trích DNA vi khuẩn từ đất: DNA trong các mẫu ủ được trích bằng Bộ PowerSoilTM DNA Kit của hãng MO Bio.

Hóa chất thực hiện phản ứng PCR: 5X buffer, MgCl2, dNTPs, Taq 5U, đoạn mồi chuyên biệt cho nhóm Chloroflexi 338F/1101R (10µM) và đoạn mồi t ng quát 341FGC/534R (10µM).

Hóa chất chuẩn bị chạy điện di gel Agarose: Agarose 1,5% (Merck), TAE buffer 0,5X, chất chỉ thị màu 6X loading buffer, thang chuẩn DNA 100 bp plus và 100 bp (Fermentas), Ethidium Bromide (chất chỉ thị huỳnh quang).

Hóa chất chuẩn bị chạy điện di biến tính tăng cấp DGGE: Các hóa chất cần thiết để chạy điện di biến tính tăng cấp như: 100% DS (chất gây biến tính), 40% PAGE, 50xTAE, ammonium persulfate (APS), TEMED, hỗn hợp stac ing,…

2.2 Phương há

2.2.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng h n hủy Chlor yri os thyl

Thí nghiệm nhằm khảo sát khả năng phân hủy yếm khí Chlorpyrifos ethyl được thực hiện trên hai loại đất phù sa ngọt (Cai Lậy-Tiền Giang) và đất phèn (Phụng Hiệp-Hậu Giang). Mẫu đất sau khi mang về được nuôi ủ trong lọ pi thể tích 50 mL. Mỗi lọ ủ b sung Chlorpyrifos ethyl nồng độ 35 ppm, 10 g đất và 30 mL dung dịch yếm khí (gồm các hoáng đa, trung, vi lượng). T ng thể tích đất và dung dịch yếm khí là 40 mL. Trước khi cho đất vào mỗi lọ, Chlorpyry os thyl được b sung bằng cách hòa tan vào dung môi và cấy sẵn lên 1 g đất khô nghiền mịn. Dung dịch yếm khí dùng cho các nghiệm thức (NT) như NT3, NT5 không b sung thêm nguồn hữu cơ nào hác ngoài Chlorpyri os thyl nhằm thúc đẩy khả năng vi khuẩn tận dụng thuốc như nguồn carbon duy nhất. Ở NT3 không b sung thêm thuốc mà chỉ có nguồn vi khuẩn nhằm làm đối chứng DNA cho NT5. Dung dịch yếm khí dùng cho nghiệm thức NT2, NT4 có đầy đủ các vitamin thiết yếu và hỗn hợp acid hữu cơ như pyruvic, propionic, ac tic, butyric aci đóng vai trò là chất cho điện tử cho các hoạt động của vi khuẩn khử chlor yếm khí. Trong đó, NT2 không b sung thêm Chlorpyrifos ethyl mà chỉ có vi khuẩn để làm đối chứng DNA cho NT4. Hỗn hợp acid hữu cơ nồng độ 250 mM được b sung mỗi tháng cho các nghiệm thức khử chlor (NT2, NT4). Ngoài ra, thí nghiệm còn bố trí thêm nghiệm thức đối chứng tiệt trùng (NT1) chỉ có Chlorpyri os thyl để khảo sát khả năng phân hủy

23

Chlorpyrifos ethyl ở các NT4 và NT5. Để tạo môi trường yếm khí, các lọ ủ đều được sục với khí N2 và hút chân không. Đồng thời, môi trường nuôi có sử dụng thêm chất chỉ thị r zazurin để biết được tình trạng yếm khí của các lọ ủ sau khi thiết kế (Hình 2.1).

Thí nghiệm được thực hiện với các mẫu đất PH01, PH02, CL01 và CL02. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên bao gồm 5 NT, mỗi NT có 3 lần lặp lại như sau:

- NT1: Đối chứng tiệt trùng, sử dụng 10 g đất, 35 ppm Chlorpyrifos ethyl, vitamin và hỗn hợp acid hữu cơ;

- NT2: Đối chứng không tiệt trùng, sử dụng 10g đất, không cấy thuốc, có vitamin và hỗn hợp acid hữu cơ;

- NT3: Đối chứng không tiệt trùng, sử dụng 10 g đất, không cấy thuốc, không b sung vitamin và hỗn hợp acid hữu cơ;

- NT4: có vi khuẩn, sử dụng 10 g đất, 35 ppm Chlorpyrifos ethyl, vitamin và hỗn hợp acid hữu cơ;

- NT5: có vi khuẩn, sử dụng 10 g đất, 35 ppm Chlorpyrifos ethyl, không b sung vitamin và hỗn hợp acid hữu cơ.

Hình 2.1. Bố trí thí nghiệm yếm hí: (a) Các lọ ủ được trữ để lấy chỉ tiêu mỗi 60 ngày, (b)

Mẫu được ủ trong lọ pi 50 mL, (c) Lấy chỉ tiêu hóa học và sinh học, (d) Dung ịch yếm hí có màu xanh hoặc xanh tím

(a) (b)

24

B sung thêm thuốc sau 330 ng y ủ: Sau 330 ngày, các lọ ủ được b sung thêm thuốc để làm giàu mật số vi huẩn. Nồng độ thuốc b sung vào tương đương với nồng độ thuốc ban đầu là 34 ppm. Trước hi thêm thuốc cần thêm một lượng ung ịch yếm hí để đưa lọ ủ về thể tích ban đầu (40mL). Để thêm thuốc, ùng bơm tiêm y tế 3 mL tiêm 1 mL Chlorpyri os thyl nồng độ 1.400 ppm vào cho các NT1, NT4 và NT5, hông b sung thuốc cho các nghiệm thức đối chứng sống.

Chỉ tiêu theo dõi: Lấy mẫu phân tích chỉ tiêu hóa học thời điểm 60, 120, 180, 300, 330, 350 và 450 ngày để kiểm tra ư lượng Chlorpyrifos ethyl và các sản phẩm con.

Cách lấy mẫu: Lắc thật đều lọ ủ, dùng bơm tiêm y tế tiệt trùng lấy t lọ ủ 1 mL cho vào lọ pi 10 mL. Bơm tiêm phải được th i với khí nitơ để đẩy hết O2 trước khi lấy mẫu. Trong quá tình lấy mẫu, nên lắc nhẹ lọ ủ để mẫu được đều và chính xác hơn.

Phương há h n tích hóa học Chlorpyrifos ethyl: Quy trình trích mẫu được thực hiện qua 3 lần trích. Lần thứ nhất lấy 1 mL mẫu cần phân tích t các lọ 40 mL đã bố trí cho vào lọ pi sau đó thêm 3 mL hỗn hợp toluene: acetone (2:1), vort x trong 2 phút và đặt trên máy lắc ngang trong 24 h với tốc độ 250 vòng/phút. Sau 24 h, vortex các lọ pi trong 2 phút rồi li tâm với tốc độ 3.000 vòng trong 2 phút 30 giây. Dùng pipet thủy tinh hút hết phần dung môi bên trên có chứa Chlorpyrifos ethyl sang các lọ pi mới. Lần trích thứ 2 thực hiện tương tự lần thứ nhất nhưng chỉ sử dụng 2 mL hỗn hợp dung môi. Lần thứ 3 tương tự lần trích thứ 2 nhưng chỉ sử dụng 1 mL ung môi và hông để mẫu lắc 24 h. Sau khi trích cho mẫu bay hơi tự nhiên trong tủ hút cho đến hi đạt thể tích 1 mL để tiếp tục quy trình lọc.

Chlorpyrifos ethyl trong dung dịch trích được làm sạch bằng cách lọc qua cột alumina. Trước khi lọc alumina được bất hoạt bằng cách nung ở 550oC (ít nhất 24 h) sau đó chuyển sang tủ sấy 250oC trong 30 phút. Tiếp tục chuyển sang bình hút ẩm để làm nguội sau đó b sung nước hử hoáng (3% lượng alumina) rồi lắc mạnh trong 30 phút. Na2SO4 và gòn thủy tinh được nung ở 250oC trong 2h. Quy trình lọc chi tiết như sau: nhồi một ít gòn thủy tinh vào cột, lắp cột lên giá. Dùng giấy nhôm cân 1 g alumina cho vào cột, thêm hoảng 1-2 cm Na2SO4 lên bề mặt. Gõ nhẹ cột để alumina chặt lại. Rửa cột với 1,3 mL hỗn hợp DCM:Hexan (2:1) sau đó tiếp tục rửa ngay bằng 4 mL Hexan khi mực ung môi cũ v a chạm đến mặt trên của lớp Na2SO4, tránh để hô cột. Cho mẫu vào đầu trên của cột, sau hi mẫu đi hết qua cột sẽ thu được phần ung môi có chứa Chlorpyri os thyl đã loại bỏ tạp chất. Tráng lọ pi hai lần với H xan, mỗi lần 2 mL. Để mẫu bay hơi tự nhiên đến thể tích 1 mL. Nồng độ thuốc được xác định trên HPLC và các sản phẩm chuyển hóa được xác định trên GCMS.

25

Hình 2.2. Trích và làm sạch ịch trích bằng cột Alumina

Phương há xác định Chlorpyrifos ethyl trên HPLC: Máy HPLC sử dụng cột C18 với chiều dài 25 cm, đường kính trong 4,6 mm, tỷ lệ pha động M tanol: Nước là 80:20, bước sóng 230 nm và tốc độ dòng là 1 mL.

Phương há xác định sản phẩm trung gian trên GCMS: Các sản phẩm chuyển hóa của Chlorpyri os thyl được xác định bằng cách scan trên GCMS. Máy sử dụng cột sắc ký Rxi 5SilMS 30m x 0.32mm; film 0.25μm. Nhiệt độ buồng bơm mẫu 250oC, điểm giao tiếp GC và MS 250oC, bộ nguồn ion 200oC. Thể tích mẫu bơm 1μL với chế độ không chia dòng.

2.2.2 Kiểm tra tính đa dạng của hệ vi khuẩn khử chlor yếm khí trong đất

Các mẫu đất của cộng đồng PH01 thời điểm 60 ngày ủ được sử dụng để trích DNA, chạy PCR và DGGE để phân tích sự đa ạng di truyền của hệ vi khuẩn

Trích DNA từ trong đất

Dùng 0,25 g mẫu đất để trích DNA th o quy trình trích DNA t đất của hãng PowerSoil(R) Isolation. Mẫu sau hi trích ùng để thực hiện phản ứng chuỗi polym ras và điện di biến tính tăng cấp DGGE để xác định sự đa ạng của hệ vi khuẩn phân hủy thuốc.

Hình 2.3. Trích DNA bằng bộ Kit Pow rSoil(R) DNA Isolation

Phương há thực hiện phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)

Một số tài liệu nghiên cứu cho biết, có nhiều loài vi khuẩn khử chlor thuộc nhóm Chloroflexi, ví dụ như loài Dehalococoides trong khử chlor dioxins (Hiraishi,

26

2003; Dwyer et al., 1999 và Armenguad et al., 1998 trích dẫn bởi Nguyễn Vũ Bằng, 2012). Sự đa ạng về cấu trúc của nhóm Chloroflexi được phân tích có thể cho thấy sự đa ạng về cấu trúc của nhóm vi khuẩn khử chlor trong mẫu ủ. Do đó, phản ứng chuỗi polymerase trong thí nghiệm sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho nhóm Chloroflexi

338F/1101R nhắm vào g n 16S rRNA để xác định vi khuẩn khử chlor yếm khí. Do mật số của hệ vi khuẩn khử chlor trong giai đoạn đầu bố trí thí nghiệm thường thấp nên kỹ thuật PCR thông thường sẽ hó quan sát được hệ vi khuẩn phân hủy thuốc. Vì vậy, thí nghiệm thực hiện phản ứng PCR kép bằng cách sử dụng sản phẩm PCR của mồi 338F/1101R và tiếp tục chạy với cặp mồi t ng quát 341F-GC/534R. Sau khi khuếch đại lần thứ hai, sản phẩm PCR này được ùng để kiểm tra trên gel agarose và phân tích sự đa ạng của hệ vi khuẩn bằng kỹ thuật điện di biến tính tăng cấp DGGE.

Để thực hiện phản ứng PCR mỗi mẫu DNA (0,75 µL) được trộn đều với 0,5 µL mồi xuôi 10 µM, 0,5 µL mồi ngược 10 µM, 10,75 µL nước và 12,5 µL hỗn hợp gồm 5X buffer, MgCl2, dNTPs, Taq 5U. Quy trình nhiệt gồm có 35 chu kì, mỗi chu kì gồm 6 bước phản ứng như sau: Bước 1: 94oC trong 3 phút, Bước 2: 94oC trong 20 giây, Bước 3: 55oC trong 45 giây, Bước 4: 72oCtrong 45 giây, Bước 5: lặp lại 30 lần t bước 2 đến bước 4, Bước 6: 72oC trong 7 phút.

Trình tự nucl oti của cặp mồi 338F/1101R: + 338: ACT CCT ACG GG AGG CAG CAG

+ Chlo1101-1126R: CTC GCK AGAAMATK TAA CTA GC AAC Trình tự nucl oti của mồi thông ụng 341F/534R:

+ 341F-GC: CGC CCG CCG CGC GC GGC GGG CGG GGC GG GGG CAC GG GGG CAC GGG GGG C…

+ 534R: ATT ACC GCG GCT GC TGG

Phương há điện di gel Agarose kiểm tra sản phẩm PCR

Sau khi thực hiện phản ứng PCR, sản phẩm được kiểm tra bằng phương pháp điện di gel Agarose 1,5%. Quy trình gồm có 3 bước cơ bản:

- Bước 1: Chuẩn bị gel agarose 1,5%

Đặt khay nơi bằng phẳng, để huôn vào hay, đặt lược vào khuôn, kiểm tra sự cân bằng của khay bằng miếng bọt khí. Cân 0,15 g agarose cho vào bình nắp xanh 100 mL, thêm 100 mL dung dịch TAE 1X đối với gel 20 giếng, lắc nhẹ sau đó đun nóng trong lò vi sóng trong 4 phút cho agarose hòa tan hoàn toàn. Lấy bình agarose

27

ra khỏi lò vi sóng, để nguội khoảng 50oC, b sung 1 μL Ethidium Bromide và lắc đều. Sau đó, đ nhẹ dung dịch vào huôn đã chuẩn bị sẵn, tránh bọt hí, để nguội 60 phút cho g l đặc lại, lấy lược ra khỏi khuôn sau đó lấy gel ra khỏi khay.

- Bước 2: Chạy điện di trên gel agarose

Đặt gel vào bể điện di TAE buffer 1X cho ngập giếng. Nạp vào mỗi giếng 4 μL dung dịch sản phẩm và 4 μL thang chuẩn vào giếng còn lại. Bật nguồn điện, cho thiết bị chạy ở 130 V trong 45 phút. Quan sát khi thấy chất chỉ thị màu di chuyển đến gần cuối gel (khoảng 1-1,5 cm), tắt nguồn điện, lấy gel ra khỏi thiết bị điện di.

- Bước 3: Chụp hình g l đã chạy điện di

Sau khi chạy điện di sản phẩm phản ứng PCR, nhuộm gel 15 phút với EtBr (0,5 mg/l). Quan sát kết quả các băng DNA xuất hiện trên gel bằng hệ thống chụp hình gel Gel Logic 1500 Imaging System của Ko a để kiểm tra chất lượng quá trình ly trích DNA của vi khuẩn.

Phương há điện di biến tính tăng cấp (DGGE): Sau khi khuếch đại mẫu DNA và kiểm tra bằng phương pháp điện di gel Agarose, thực hiện điện di biến tính tăng cấp để xác định sự đa ạng của hệ vi khuẩn phân hủy thuốc. Quy trình chi tiết được trình bày ở phụ chương 5

2.2.3 Phương há thống kê xử lí số liệu

Số liệu thí nghiệm được tính toán trên phần mềm Excel. Thống kê bằng phần mềm Minitab để kiểm định phân phối chuẩn, đồng nhất phương sai, so sánh trung bình và phân tích ANOVA. Xử lí ảnh bằng phần mềm Cluster và Gel Compare.

28

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Một số đặc tính lý hóa đất tại khu ực thu mẫu

Phân tích đặc tính lý, hóa đất là cơ sở để biết được một số điều kiện vô sinh mà các loài vi khuẩn bản địa sinh sống. Kết quả phân tích mẫu như sau: đất ở Cai Lậy thuộc loại typic Gleysols (Phân loại theo WRB), sa cấu sét, hàm lượng hữu cơ ở mức trung bình, pH ở mức hơi chua. Trong hi đó, đất ở Hòa An thuộc loại đất phèn hoạt động trung bình, các đốm Jarosite xuất hiện trong khoảng 60-70 cm ưới mặt đất. Đất có sa cấu sét, hàm lượng hữu cơ thuộc nhóm trung bình và pH ở mức chua v a. Số liệu cụ thể được trình bài trong Bảng 3.1 bên ưới.

Bảng 3.1. Một số đặc tính lý hóa của các loại đất sử ụng trong thí nghiệm

Địa điểm Sa cấu đất Hàm lượng hữu cơ (%) pH Sét(%) Thịt (%) Cát(%) Cai Lậy – TG 67 31 2 7,62 5,70 Hòa An – HG 73 27 0,2 4,90 5,06

3.2. Khảo sát khả năng h n hủy yếm khí Chlor yri os thyl của các hệ i khuẩn đất

3.2.1 Kết uả đánh giá so sánh khả năng h n hủy yếm khí Chlor yri os ethyl của 4 hệ i khuẩn trong dung dịch khoáng tối thiểu

Kết quả thí nghiệm đánh giá hả năng phân hủy Chlorpyrifos ethyl cho thấy cả 4 hệ vi khuẩn ký hiệu CL01, CL02, PH01 và PH02 đều có khả năng phân hủy tốt Chlorpyrifos ethyl. T 35 ppm ban đầu, nồng độ Chlorpyrifos ethyl giảm đáng ể ở hầu hết các mẫu đất được ủ sau 60 ngày. Tốc độ phân hủy Chlorpyrifos ehtyl cụ thể của 4 hệ vi khuẩn được trình bày trong Hình 3.1 và Hình 3.2.

29

Hình 3.1 Khả năng phân hủy Chlorpyrifos ethyl của hệ vi huẩn CL01 (a) và CL02 (b)

Sự phân hủy Chlorpyrifos ethyl của hệ vi khuẩn ký hiệu CL01, CL02 khá tốt. Sau 60 ngày ủ, nồng độ Chlorpyrifos ethyl còn lại t 1,3-4,8 ppm (tương đương 5- 27%). Riêng với nghiệm thức có b sung acid hữu cơ của hệ vi khuẩn CL01, nồng độ Chlorpyrifos ethyl còn lại đến 10,76 ppm (60%), chưa có sự khác biệt so với đối chứng. Nhưng đến thời điểm 180 ngày và 300 ngày, Chlorpyri os thyl đã hoàn toàn được phân hủy ở cả hai hệ vi khuẩn. Nồng độ thuốc còn lại sau 300 ngày ủ là 0,57-0,81 ppm (chỉ khoảng 2,5-4%). Đối với hệ vi khuẩn CL01 và CL02, khả năng phân hủy thuốc giữa hai nghiệm thức có b sung acid hữu cơ và hông b sung acid hữu cơ là tương đương nhau.

Như vậy, sau 300 ngày ủ nồng độ Chlorpyri os thyl đã cạn kiệt. Để làm giàu mật số của hệ vi khuẩn mục tiêu cần phân lập, thí nghiệm b sung thêm Chlorpyrifos ethyl nồng độ 34 ppm. Nồng độ Chlorpyrifos ethyl b sung xấp xỉ nồng độ bố trí thí nghiệm ban đầu. Kết quả phân tích chỉ tiêu 20 ngày sau khi làm giàu mật số cho thấy hàm lượng Chlorpyrifos ethyl giảm đáng ể, nồng độ còn lại t 1,6-9,3 ppm (tương đương 4-31%). Tr nghiệm thức b sung acid hữu cơ của hệ vi khuẩn ký hiệu CL01. Ở nghiệm thức này, nồng độ thuốc còn lại đến 26,7 ppm (tương đương 68%) chưa hác biệt thống kê so với thời điểm v a b sung thuốc.