2.3.1. Phƣơng pháp giữ giống trên thạch nghiêng
Pha môi trường giữ giống nấm men theo công thức môi trường thạch, đun cho tan chảy rồi chia đều vào các ống nghiệm, mỗi ống 5– 6ml, nút kín. Tiệt khuẩn các ống nghiệm ở 115oC trong 20 phút. Để nguội, tiến hành cấy giống. Nuôi ở tủ ấm 30oC trong 25 giờ, sau đó bảo quản trong tủ lạnh 5oC.
2.3.2. Phƣơng pháp nhân giống
Pha môi trường nhân giống nấm men theo công thức môi trường lỏng.Chuẩn bị bình nón 250ml có chứa 100ml môi trường nuôi cấy. Tiệt khuẩn các bình này ở 115oC trong 20 phút, để nguội tới nhiệt độ phòng. Cấy giống vào các bình. Nuôi cấy trong máy lắc 140 vòng /phút ở 30oC trong 24 giờ.
2.3.3. Phƣơng pháp nuôi cấy thu dịch lên men
Pha môi trường nuôi cấy như công thức môi trường lỏng, đã nhân giống 24 giờ. Tiệt khuẩn ở 115oC trong 20 phút. Để nguội, cấy giống vào môi trường, lắc trong máy lắc khoảng 140 vòng/phút trong vòng 24 giờ để thu dịch lên men.
2.3.4. Phƣơng phápthu sinh khối
Sau khi tiến hành nuôi cấy S. boulardii trong điều kiện thích hợp, đem toàn bộ dịch nuôi cấy đi ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 10 phút, thu lấy sinh khối. Sau đó, xác định khối lượng sinh khối thu được bằng cách cân trên cân kỹ thuật.
CHƢƠNG III:KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM
Khi nghiên cứu về vi sinh vật vấn đề cần quan tâm trước hết là lựa chọn được những điều kiện nuôi cấy thích hợp cho vi sinh vật sinh trưởng và phát triển tốt nhất. Đó là những điều kiện về hô hấp, nhiệt độ, thời gian và môi trường dinh dưỡng. Đề tài đã nghiên cứu ảnh hưởng củamôi trường tới sự phát triển của S.boulardii,từ đó lựa chọn ra những điều kiện dinh dưỡng cho lượng sinh khối S. boulardiithu được là thích hợp nhất.
3.1. Xây dựng đƣờng cong sinh trƣởngcủa nấm men S. boulardiiMục đích: Mục đích:
Xây dựng đường cong sinh trưởngnấm men S. boulardii, từ đó lựa chọn thời điểm nuôi cấy để thu được lượng sinh khối nấm men S. boulardii thích
hợp nhất.
Tiến hành:
Chuẩn bị môi trường nhân giống nấm men S. boulardii theo phương
pháp mô tả ở mục 2.3.2. Pha 8 bình mỗi bình chứa 20ml môi trường nấm men,sau đó tiến hành nuôi cấy theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.3. Tại thời điểm 6, 10, 24, 30, 34, 48, 54, 58 giờ, tiến hành xác định lượng sinh khối thu được theo phương pháp mô tả mục 2.3.4. Thí nghiệm tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình.
Kết quả :
Bảng 3.1.Khối lượng sinh khối nấm menS. boulardii thu được từ20ml môi
trường nuôi cấy tại các thời điểm đã cố định.
Thời gian (h) 6h 10h 24h 30h 34h 48h 54h 58h Khối lượng (g) 0,518 0,708 0,763 0,690 0,663 0,630 0,610 0,553
Hình 3.1. Đường cong sinh trưởng biểu diễn khối lượng sinh khốinấm menS.
boulardiithu được trong 20ml môi trường nuôi cấy tại các thời điểm đã cố
định.
Nhận xét:
Từ các kết quả trong bảng và hình 3.1. nhận thấy trong 24 giờ đầu, lượng sinh khối vi sinh vật tăng nhanh liên tục và đạt khối lượng lớn nhất tại 24 giờ là 0,763g. Sau đó lượng sinh khối vi sinh vật giảm dần và tới 58 giờ chỉ đạt được 0,553g. Như vậy khóa luận lựa chọn thời điểm 24giờ để thu lượng sinh khối cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2. Khảo sát ảnh hƣởng củacác môi trƣờng dinh dƣỡng lƣợng sinh khối nấm men S. boulardii khối nấm men S. boulardii
3.2.1.Khảo sát ảnh hƣởng củacác nguồn hydrat cacbon đến lƣợng sinh khối nấm S. boulardii
Mục tiêu:
Khảo sát ảnh hưởng củanguồn hydrat cacbon đến lượng sinh khốinấmmen S. boulardii, từ đó lựa chọn nguồn đườngthu được lượng sinh
khối nấm men S. boulardii thích hợp nhất.
0.518 0.708 0.763 0.69 0.663 0.63 0.61 0.553 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 6h 10h 24h 30h 34h 48h 54h 58h K hố i lƣợng ( g )
Tiến hành:
Chuẩn bị môi trườngnhân giống nấm men S. boulardii theo phương
pháp mô tả ở mục 2.3.2.Pha 20ml các môi trường chứa môi trường glucose, maltose, saccharose, lactose với nồng độ 10%.Sau đó tiến hành nuôi cấy theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.3, tiếp theo tiến hành thu sinh khối theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.4. Thí nghiệm được tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình.
Kết quả:
Bảng 3.2. Khối lượng sinh khối thu được trong các môi trường có chứa nguồn
hydratcacbon khác nhau.
Nguồn hydratcacbon Khối lƣợng (g)
Glucose 0,430
Maltose 0,355
Saccharose 0,400
Lactose 0,420
Hình 3.2. Khối lượng sinh khối thu được trong các môi trường có chứa nguồn hydratcacbon khác nhau.
Nhận xét:
Trong bốn loại đường, lượng sinh khối thu được là tương đương nhau chỉ có maltose cho lượng sinh khối thấp hơn. Điều này phù hợp với đặc điểm
0.43 0.355 0.4 0.42 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
glucose maltose saccharose lactose
K
hố
i lƣợng
(
sinh lý chung của nấm men. Khóa luận chọn glucose là nguồn đường phổ biến, đơn giản nhất để tiến hành thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2.Khảo sát ảnh hƣởng của các nồng độ đƣờng glucose đến lƣợng sinhkhối nấm men S. boulardii
Mục tiêu:
Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ glucose đến lượng sinh khối nấm men S. boulardii, từ đó lựa chọn nồng độ glucose thu được lượng sinh khối
nấm men S. boulardii thích hợp nhất.
Tiến hành:
Chuẩn bị môi trường nhân giống nấm men S. boulardii theo phương
pháp mô tả ở mục 2.3.2. Pha 20mlcác môi trường với nồng độ glucose 5%, 10%, 15%, 20%. Sau đó tiến hành nuôi cấy theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.3, tiếp theo tiến hành thu sinh khối theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.4. Thí nghiệm được tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình.
Kết quả:
Bảng 3.3. Khối lượng sinh khối thu được theo các nồng độ của đườngglucose Nồng độ glucose Khối lƣợng (g) 5% 0,278 10% 0,483 15% 0,303 20% 0,293 0.278 0.483 0.303 0.293 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 5% 10% 15% 20% K hố i lƣợn g ( g) Nồng độ glucose
Hình 3.3. Khối lượng sinh khối thu được theocác nồng độđường glucose.
Nhận xét:
Ở nồng độglucose 5% lượng sinh khối thu được là thấp nhất là 0,278g. Khi tăng lên 10% thì lượng sinh khối thu được là lớn nhất là 0,483g, Tiếp tục tăng lên 15%, 20% thì lượng sinh khối thu được giảm xuống và không khác biệtnhiều so với nồng độ 5%. Như vậy chọn nồng độ 10% là nồng độglucose thích hợp cho lượng sinh khối S. boulardii lớn nhất.
3.2.3.Khảo sát ảnh hƣởng củacác nguồn nitơ đến lƣợng sinh khối nấm men S. boulardii
Mục tiêu:
Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn nitơ đến lượng sinh khối nấm men
S. boulardii, từ đó lựa chọn nguồn nitơthu được lượng sinh khối nấm men S. boulardii thích hợp nhất.
Tiến hành:
Chuẩn bị môi trường nhân giống nấm men S. boulardii theo phương
pháp mô tả ở mục 2.3.2. Pha 20ml các môi trường chứa (NH4)2SO4, NH4NO3, NH4Cl, NH4acetat, NH4 citrat, pepton, cao nấm men, cao thịtvới nồng độ 10%. Sau đó tiến hành nuôi cấy theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.3, tiếp theo tiến hành thu sinh khối theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.4. Thí nghiệm được tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình.
Kết quả:
Bảng 3.4. Khối lượng sinh khối thu được trong các môi trường có chứa nguồn
nitơ khác nhau:
Nguồn nitơ Khối lƣợng(g)
(NH4)2SO4 0,340
NH4NO3 0,295
NH4 acetat 0,260
NH4 citrat 0,240
Pepton 0,415
Cao nấm men 0,475
Cao thịt 0,450
Hình 3.4. Khối lượng sinh khối thu được trongcác môi trường có chứa nguồn nitơ khác nhau.
Nhận xét:
Trongcác nguồn nitơ vô cơ nhận thấy môi trường (NH4)2SO4thu được lượng sinh khối lớn nhất là 0,340g và trongcác nguồn nitơ hữu cơ nhận thấy môi trường cao nấm men thu được lượng sinh khối lớn nhất là 0,475g. Như vậy trong nguồn nitơ ta lựa chọncao nấm men thu được lượng sinh khối lớn nhất trong thí nghiệm thiếp theo.
3.2.4. Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ cao nấm men đến lƣợng sinh khốinấm men S. boulardii
Mục tiêu:
Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ cao nấm men đến lượng sinh khối nấm men S. boulardii, từ đó lựa chọn nồng độ cao nấm men thu được lượng sinh khối nấm men S. boulardiithích hợp nhất.
Tiến hành:
Chuẩn bị môi trường nhân giống nấm men S. boulardii theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.2. Pha 20ml các môi trường với nồng độcao nấm men 5%, 10%, 15%. Sau đó tiến hành nuôi cấy theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.3, tiếp theo tiến hành thu sinh khối theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.4. Thí nghiệm được tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình.
Kết quả:
Bảng 3.5.Khối lượng sinh khối thu được theo các nồng độcao nấm men. Nồng độ cao nấm men Khối lƣợng(g)
5% 0,29
10% 0,32
15% 0,27
Hình 3.5.Khối lượng sinh khối thu được theocác nồng độcao nấm men.
Nhận xét:
Ở nồng độ cao nấm men 5% lượng sinh khối thu được là 0,29 g. Khi tăng lên 10% thì lượng sinh khối thu được là lớn nhất là 0,32g, tiếp tục tăng lên 15% thì lượng sinh khối thu được là 0,27 g. Nồng độ cao nấm men 5% và 15% thì lượng sinh khối thu được là tương đương nhau, còn nồng độ 10% lượng sinh khối thu được lớn nhất là 0,32 g. Như vậy lựa chọn nồng độcao nấm men 10% thì thu được lượng sinh khối lớn nhất.
0.29 0.32 0.27 0.24 0.26 0.28 0.3 0.32 0.34 5% 10% 15% K hố i lƣợng ( g) Nồng độ cao nấm men
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT I. KẾT LUẬN
1. Đã xây dựng được đường cong sinh trưởng của S. boulardii và xác
định được thời điểm thu lượng sinh khối lớn nhất là 24 giờ.
2. Đã khảo sát được ảnh hưởng của một số nguồn và nồng độ dinh dưỡng đến lượng sinh khối nấm menS. boulardi.
Đã chọn được glucose với nồng độ 10% là nguồn hydratcacbon cho lượng sinh khối lớn nhất.
Đã chọn được cao nấm men với nồng độ 10% là nguồn nitơ cho lượngsinh khối lớn nhất.
II. ĐỀ XUẤT
1. Tiếp tục nguyên cứu về ảnh hưởng các nguồn dinh dưỡng khác đến lượng sinh khối nấm men S. boulardii.
2. Tiếp tục nguyên cứu về ảnh hưởng các điều kiện hô hấp khác đến lượng sinh khối nấm men S. boulardii.
TÀI LIỆU THAM KHẢO I. Tài liệu tiếng Việt
1. Bùi Xuân Đồng (1997), Một số vấn đề về nấm học, Nhà xuất bản
khoa học và kỹ thuật, tr. 82.
2. Nguyễn Khắc Tuấn (1970), Nấm men dung trong chăn nuôi lợn, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật,tr. 122-147.
3. PGS. TS Lương Đức Phẩm (1980), Vi sinh vật học và an toàn vệ sinh
thực phẩm – Nhà xuất bản Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh.
4. Phạm Thúy Ngân (2012), Tổng quan về các vi khuẩn lactic được sử
dụng trong các chế phẩm probiotics, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ,
Trường Đại học Dược Hà Nội.
5. Vương Thị Hồng Vi (2007), Khảo sát sự sinh trưởng của Saccharomyces sp. trên môi trường cám gạo, rỉ đường và một số yếu tố ảnh hưởng đến sức sống của chúng trong chế phẩm, Trường Đại
học Nông lâm thành phố Hồ Chí Minh. II. Tài liệu tiếng Anh
6. Carlos Ricardo Soccol, Luciana Porto de Souza Vandenberghe, Michele Rigon Spier, Adriane Bianchi Pedroni Medeiros, Caroline Tiemi Yamaguishi, Juliano De Dea Linder, Ashok Pandey and Vanete Thomaz-Soccol (2010), “The Potentail of Probiotics”, Food Technol. Biotechnol, 48 (4), pp. 413 – 434.
7. Dimitris Charalampopoulos, Robert A. Rastall (Eds.), Prebiotics and
Probiotics Science and Technology, Springer Science and Bussiness
8. H.A.W. Lengkey, R. L. Balia, I. Togoe, B. A. Tasbac, M. Ludong (2009), “Isolation and identification lactic acid bacteria from raw poultry meat”, Biotechnology in Animal Husbandry 25, Institute for Animal Husbandry,pp.1071 – 1077.
9. Jame W. Anderson, MD and Stanley E. Gilliland, PhD (1999), “ Effect of Fermented Milk (Yogurt) Containing Lactobacillus acidophilus L1 on Serum Cholesterol in Hypercholesterolemic
Humans”, the American College of Nutrition,pp.43 – 50.
10.Medana Zamfir, Silvia Silmona Grosu – tudo (2011) “Isolation and characterization of lactic acid bacteria from Romanian fermented vegetables”, Romanian Journal, pp. 148 – 154.
11.Microbial Ecology in Health and Disease (1993), “Saccharomyces boulardii: A Review of an Innovative Biotherapeutic Agent”, Department of Medical Chemistry, University of Washington Seattle, Washington, USA and laboratoires Biocodex, Montrouge, France. 12.Nur Syarfa Aqilah Mohammed Akhiar (2010), “Enhancement of
probiotics survival by microencapsulation with alginate and prebiotics”, Department of Biochemistry and Molecular Biology Michigan State University, East Lansig, pp. 13 – 18.
13.Peter F Stanbury, Principles of fermentation technology, 2th edition, pp. 1 – 3.
14.Report of a “Joint FAO/WHO Expert Consulation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Power Milk with Live Lactic Acid Bacteria”, (2001), Health and Nutritional Propertires of Probiotics in Food including Power Milk with Live Lactic Acid Bacteria, Cordoba, Argentina.
15.Sumarna (2008) “Changes of raffinose and stachyose in soy milk fermentation by lactic acid bacteria from local fermented foods of Indonesian”, Malaysian Journal of Microbiology, pp.33.
16.T. Madigan, John Martinko, Jack Parker, Michael, Brock biology of microorganism, 21, “Microbial interactions with human”,pp 701 – 713.
III. Tài liệu trên mạng
17.http://tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/B%E1%BA%A1n_%C4%91 %C3%A3%_t%E1%BB%ABng_nh%E1%BA%AFc_%C4%91%E1 %BA%BFn_Probiotic%3F!. 18.http://www.huongvietpharma.com/vn/ykhoa/nhung%E2%80%9Cngu oi-linh-lam%E2%80%9D-probiotics/ 19.http://www.metamicrobe.com/lactobacteria. 20.http://www.scibd.com/doc/51106397/33/CAC-S%E1%BA%A2%N- PH%E1%BA%A8M-CH%E1%BB%A8A-PROBIOTIC- T%E1%BB%AA-S%E1%BB%AEA#page=29. 21.http://tailieu.vn/doc/su-sinh-san-cua-nam--884226.html.