Theo dược điển châu Âu độ đắng của một chất có giá trị bằng số ml nước cất lớn nhất dùng để hòa tan 1 g chất đó thành dung dịch còn có vị đắng [5].
Quinin có độ đắng là 200000, là một chất rất đắng vì thế người ta chọn chất này làm chất chuẩn để thử độ đắng cho các chất khác [5].
Cách tiến hành:
Cần 6 tình nguyện viên để xác định độ đắng của dược chất AZI (3 nam, 3 nữ).
T s hi u chỉ á : để khắc phục sự khác nhau về cảm nhận vị đắng giữa các thành viên trong nhóm tình nguyện cần xác định một hệ số hiệu chỉnh cho từng thành viên. Pha một dung dịch Quinin có nồng độ 0,001% trong nước cất (dd A). Lấy 4,4; 4,6; 4,8; 5; 5,2; 5,4; 5,6 ml dd A cho vào các bình định mức 10 ml, bổ sung nước cất vừa đủ được các dung dịch thử. Cho lần lượt 10 ml các dung dịch thử có nồng độ từ thấp đến cao vào giữa lưỡi của tình nguyện viên, ngậm trong 30s sau đó nhổ ra và ghi lại cảm nhận về vị đắng. Sau mỗi lần thử rửa sạch miệng và chờ 10 phút để thử dung dịch tiếp theo [5].
Hệ số hiểu chỉnh cho mỗi thành viên được tính theo công thức [5].
Trong đó:
- K: hệ số hiệu chỉnh cá thể
- n: số ml dd A nhỏ nhất dùng để pha dung dịch thử có vị đắng.
Thử ng của ợc ch t AZI: lấy 0,1g AZI hòa tan trong 1000 ml nước cất thu được dd B có độ pha loãng 10000. Hút lần lượt 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9 ml dd B cho vào các bình định mức 10 ml, thêm nước cất vừa đủ được các dung dịch thử. Cho các thành viên thử lần lượt các dung dịch thử có nồng độ từ thấp đến cao và ghi lại kết quả [5].
Độ đắng của AZI được tính theo công thức [5].
Trong đó: - B: độ đắng của azithromycin - X: số ml dd B nhỏ nhất dùng để pha dung dịch thử có vị đắng Từ ng của a ẽ ợc nồ nh nh ó ó ng, nồ ợc g ng.
2.3.2. Phương ph p bào chế và đ nh gi vi hạt che vị
2.3.2.1. B o vi h t che v azithromycin
- Bào chế vi hạt bằng phương pháp phun sấy
Hòa tan polyme và dược chất trong hỗn hợp dung môi ethanol : diclomethan = 1:1 (v/v), với nồng độ polyme là 50 mg/ml. Lọc qua rây 125 và đem phun sấy trên máy spray dryer SD-05 với vòi phun có đường kính lỗ là 0,75 mm, tốc độ thổi khí là 40, áp suất khí phun là 0,4 bar, nhiệt độ khí vào 80oC, tốc độ phun dịch 10
ml/phút. Thu sản phẩm và bảo quản trong túi nilon 2 lớp để trong bình hút ẩm đến khi sử dụng.
- Bào chế vi hạt bằng phương pháp bốc hơi dung môi
Hòa tan polyme và dược chất trong hỗn hợp dung môi ethanol : diclomethan = 1:1 (v:v), với nồng độ polyme là 300 mg/ml. Sau đó bốc hơi dung môi bằng tủ sấy
tĩnh ở 60oC trong 24 giờ. Sử dụng máy nghiền bi để nghiền hệ cốt thu được sau khi
bốc hơi dung môi. Thu được bột, đem rây lấy kích cỡ phù hợp. Bảo quản trong túi nilon 2 lớp để trong bình hút ẩm đến khi sử dụng.
2.3.2.2. Đá á k ă e của vi h t
Khả năng che vị của vi hạt được đánh giá bằng phương pháp ngưỡng đắng. Lấy một lượng vi hạt tương đương 600mg AZI cho vào ống nghiệm, sau đó thêm 10ml nước cất và lắc xoáy ở mức 2 trong 30s, lọc qua giấy lọc lấy dịch lọc đem định lượng bằng phương pháp đo mật độ quang của sản phẩm giáng hóa. Nồng độ AZI trong dịch lọc được so sánh với ngưỡng đắng, nếu nhỏ hơn ngưỡng đắng thì mẫu vi hạt đó được coi là có khả năng che vị hoàn toàn [8].
2.3.2.3. Đá á k ă a a ủa ợc ch t từ vi h t
Điều kiện hòa tan
Thi t b a a : kiểu cánh khuấy
Thể ng: 500 ml đệm pH 1,2; pH 5; pH 6,8; nước cất
T quay: 100 vòng/phút
Nhi ng: 37±0,5oC
Ti n : cho lượng vi hạt tương đương 50 mg dược chất vào cốc thử hòa tan, sau khoảng thời gian 15 phút, 30 phút, 60 phút, 120 phút hút 10 ml dung dịch hòa tan lọc qua giấy lọc và định lượng bằng phương pháp đo hấp thụ quang của sản phẩm giáng hóa.
Xử k t qu : nồng độ dung dịch thử được tính dựa trên phương trình đường chuẩn. Các dung dịch chuẩn được pha bằng môi trường hòa tan.
Trong đó: Ct: nồng độ dung dịch thử V: thể tích môi trường m: khối lượng vi hạt
h: hàm lượng AZI trong vi hạt
2.3.2.4. Đá á k c tiể á của vi h t
Kích thước tiểu phân trung bình và phân bố kích thước tiểu phân: kích thước tiểu phân được đo bằng máy đo kích thước tiểu phân mastersize 3000. Khoảng 1 g vi hạt được phân tán đều trong 20 ml nước cất sau đó thêm dần vào cốc đo đã chứa sẵn 500 ml nước cất cho đến khi nồng độ nằm trong khoảng từ 0,1 đến 20%. Tiến hành đo theo các bước theo qui định của máy.
Hình thái của vi hạt: hình thái vi hạt được đánh giá bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM). Phun một lớp mỏng vi hạt lên một đĩa kim loại có dính sẵn 1 miếng băng dính 2 mặt dẫn điện. Mẫu được làm khô sau đó phun lên một lớp vàng cực mỏng nhằm trách tích điện trên bề mặt. Đưa tiêu bản vào buồng chân không và tiến hành chụp hình ảnh bề mặt của hạt bằng kính hiển vi điện tử quét.
2.3.2.5. Đá á á a o e ợc ch t trong vi h t
Phân tích nhiệt vi sai (DSC): cân khoảng từ 0,5 đến 100 mg mẫu vào 1 đĩa nhôm DSC trên cân phân tích ( lớp chất rắn phẳng và cao khoảng 2 mm là tốt nhất). Sau đó đậy nắp lên và dùng lực dập để dính chặt nắp vào đĩa. Để không khí bên trong có thể giãn nở nắp đĩa được đục sẵn 1 lỗ nhỏ. Sử dụng một đĩa nhôm trắng để làm mẫu so sánh và nắp được đục 2 lỗ để phân biệt. Dùng kẹp để 2 đĩa nhôm vào buồng gia
nhiệt, bắt đầu tăng nhiệt độ từ 30-250oC với tốc độ gia nhiệt là 10 độ/phút. Nhập khối lượng cân vào máy tính và xử lý kết quả thu được.
Phổ hồng ngoại (FTIR): nghiền khoảng 1-2 mg mẫu với 300-400 mg KBr, Khi được hỗn hợp đồng nhất đem dập thành viên nén có đường kính 13 mm, lực dập 800MPa. Tiến hành quét phổ với viên nén thu được.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1-H NMR): hòa tan mẫu trong CD3OD đã khử khí với nồng độ 20 mg/ml. Cho dung dịch vào một ống thủy tinh chuyên dụng sao cho độ cao của mực chất lỏng khoảng 4,5 đến 5 cm sau đó đậy nắp kín lại. Đặt ống thủy tinh vào buồng đo và tiến hành quét phổ [12].
2.3.3. Phương ph p bào chế và đ nh gi bột pha hỗn dịch
2.3.3.1. B o b t pha hỗn d ch che v azithromycin
Vi hạt tối ưu được trộn với tá dược ổn định hỗn dịch, tá dược kiềm, tá dược trơn, tá dược bảo quản, chất điều hương, điều vị với khối lượng mỗi thành phần theo công thức đã nghiên cứu. Quy trình cụ thể như sau: các tá dược được nghiền và rây qua rây 180, sau đó trộn với nhau theo nguyên tắc đồng lượng. Trộn hỗn hợp tá dược với vi hạt theo nguyên tắc đồng lượng. Rây hỗn hợp bột qua rây 350. Đóng vào lọ chất dẻo thể tích 50ml.
2.3.3.2. Đá á k ă a a ch v của á ợc ki m
Để đánh giá đúng thực tế khi sử dụng hỗn dịch cần xây dựng phương pháp mô phỏng quá trình trung hòa trong dạ dày khi đói. Theo các nghiên cứu thăm dò bài tiết dịch vị cho thấy thể tích dịch vị khi đói là 40ml, tốc độ bài tiết dịch vị là 2ml/phút và tham khảo tài liệu [11], thí nghiệm được thiết kế như sau: Cho tá dược kiềm vào cốc có mỏ sau đó cho thêm 10ml nước khuấy đều tiếp tục cho thêm 40ml dung dịch HCl 0,1N khuấy đều và đo pH sau 5 phút. Sau đó thêm dần mỗi lần một lượng 10ml dung dịch HCl 0,1N chờ phản ứng 5 phút rồi đo pH. Lập đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của pH theo số ml HCl thêm vào [11].
Thêm 9 ml nước vào lọ bột lắc cho phân tán đều sau đó đổ vào cốc hòa tan. Điều kiện hòa tan giống phần thử khả năng hòa tan của vi hạt. Môi trường hòa tan là đệm pH 1,2 sau 120 phút chuyển thành pH 6,8 bằng cách thêm 10 ml dung dịch NaOH 5M và 10 ml dung dịch đệm phosphat pH 6,8 nồng độ 1M. Lấy mẫu tại các thời điểm 5; 30; 60; 120; 125; 150; 180; 240 phút. Tại thời điểm lấy mẫu hút 10 ml dịch hòa tan lọc qua giấy lọc, hút chính xác 5 ml dịch lọc trung hòa bằng 5ml dung dịch Na2HPO4 0,2M sau đó tiến hành định lượng bằng HPLC. Lập đồ thị biểu diễn sự thay đổi nồng độ AZI và chất phân hủy theo thời gian.
2.3.3.4. Đá á y của b t pha hỗn d ch
Tiến hành đánh giá độ trơn chảy bằng phương pháp đo góc nghỉ theo tiêu chuẩn Dược điển Anh 2013.
Lấy khoảng 1g bột dàn đều thành một lớp mỏng trên mặt phẳng nằm ngang A. Phễu B đặt vuông góc với mặt phẳng A và cố định ở độ cao sao cho đáy phễu cách đỉnh khối bột <4 cm. Đường kính đáy phễu là 1cm.
Cho khoảng 10g bột chảy tự do qua phễu sao cho khối bột tạo thành có đỉnh. Đo góc nghỉ α là góc tạo bởi cạnh khối bột với mặt phẳng A. Lặp lại phép đo 3 lần và lấy kết quả trung bình.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Nghiên cứu tiền công thức
3.1.1. Ph t triển phương ph p định lượng azithromycin
Để thuận tiện cho việc định lượng azi trong từng trường hợp cụ thể cần xây dựng các phương pháp định lượng khác nhau. Với điều kiện thực tế đề tài phát triển phương pháp định lượng azi trên 2 công cụ là HPLC và UV-VIS.
3.1.1.1. P á ợng azithromycin bằng HPLC
Phương pháp định lượng AZI bằng HPLC được tham khảo từ DĐVN IV trong chuyên mục “viên nang azithromycin”. Kết quả đo thực tế được thể hiện trong bảng và hình dưới đây.
Bảng 3.1. Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ azithromycin
Nồng độ (µg/ml) 500 1000 1500 2000 2500
Diện tích pic 858 1654,5 2514,6 3327,1 4207,7
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ azithromycin
Nhận xét: kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ từ 500 đến 2500 (µg/ml), đường thể hiện mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ là một đường tuyến tính có phương trình hồi quy là y = 1,6744x + 0,78, hệ số tương quan R2 =0,9997>0,995. Như vậy diện tích pic phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ.
3.1.1.2. P á ợng azithromycin bằng UV-VIS
Phương pháp định lượng AZI bằng UV-VIS dựa trên đo quang sản phẩm giáng hóa AZI bằng acid sulfuric đặc. Kết quả thu được như sau.
Bảng 3.2. Mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ AZI
C (µg/ml) 25 37,5 50 62,5 75
A 0,236 0,335 0,473 0,583 0,701
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thu và nồng độ azithromycin
Nhận xét: kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ từ 25 đến 75 (µg/ml), đường thể hiện mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ là một đường tuyến tính có phương trình hồi quy là y = 0,0094x - 0,0056, hệ số tương quan R2 =0,9982>0,995. Như vậy độ hấp thụ phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ.
3.1.2. Đ nh gi độ tan bão hòa của azithromycin trong c c môi trường
Độ tan bão hòa của AZI trong các môi trường được thể hiện trong bảng sau
Bảng 3.3. Độ tan bão hòa của azithromycin trong các môi trường pH khác nhau
pH môi trường pH 1,2 pH 5 pH 6,8 pH 7,4
Độ tan bão hòa (mg/ml)
51,658 15,885 4,731 1,794
Bảng 3.4. Độ tan bão hòa của azithromycin trong dung môi hữu cơ
Môi trường Ethanol Diclomethan EtOH:DCM (1:1)
Độ tan bão hòa (mg/ml) 335,743 250 350
Nhận xét: azithromycin tan tốt trong các dung môi hữu cơ, điều này rất thuận lợi cho việc bào chế vi hạt bằng phương pháp bốc hơi dung môi. Trong nước độ tan của AZI phụ thuộc lớn vào pH môi trường, pH càng thấp độ tan càng lớn và ngược lại, điều này giúp định hướng được phương pháp che vị. Điều chỉnh pH trong khoang miệng để giảm khả năng hòa tan của dược chất.
3.1.3. Đ nh gi độ ổn định của azithromycin trong môi trường acid
Độ ổn định của AZI được đánh giá tại các môi trường có pH 1; pH 2; pH 3; pH 4; pH 5. Trên sắc ký đồ thể hiện rõ pic của chất phân hủy (thời gian lưu 6 phút và 13 phút) và pic của AZI (thời gian lưu 15 phút) được thể hiện trong Hình PL 1.2. Sự thay đổi nồng của AZI và của chất phân hủy theo thời gian được phân tích để tìm ra động học phân hủy của dược chất.
Để thấy rõ cơ chế phân hủy của AZI trong môi trường acid cần tiến hành định lượng nồng độ chất phân hủy và AZI tại các thời điểm nhưng không thực hiện bước trung hòa để dừng phản ứng vì chất kiềm có thể làm chuyển dịch các phản ứng thuận nghịch. Sự thay đổi nồng độ AZI và chất phân hủy theo thời gian được thể hiện trong hình sau.
Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi nồng độ AZI và các chất phân hủy theo thời gian khi không thực hiện bước trung hòa tại pH 1 và pH 2
Nhận xét: nhìn vào dạng đồ thị ta có thể dự đoán chất phân hủy 1 là sản phẩm trung gian của phản ứng phân hủy AZI thành chất phân hủy 2 vì chất phân hủy 1 có giai đoạn giảm nồng độ. Kết quả cho thấy rằng nồng độ AZI giai đoạn đầu giảm rất nhanh sau đó thay đổi rất chậm điều đó cho thấy có thể phản ứng thủy phân AZI thành chất phân hủy 1 là phản ứng thuận nghịch. Từ đó có thể dự đoán phương trình động học phân hủy AZI sẽ có dạng như sau:
Để làm rõ hơn vấn đề này chúng ta thực hiện thao tác trung hòa để dừng phản ứng trước khi thực hiện xác định nồng độ các chất trong mẫu. Kết quả thu được như sau.
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi nồng độ AZI và chất phân hủy theo thời gian khi thực hiện bước trung hòa tại pH 1 và pH 2
Nhận xét: kết quả cho thấy khi trung hòa trên sắc ký đồ chỉ còn 2 pic là pic của AZI (thời gian lưu 15 phút) và pic của chất phân hủy 2 ( thời gian lưu 6 phút) được thể hiện trong Hình PL 1.3. Sự giảm nồng độ AZI theo thời gian tuân theo động học phân hủy bậc 1. Điều này cho thấy bước trung hòa vừa có tác dụng dừng phản ứng vừa có tác dụng chuyển chất phân hủy 1 thành AZI. Điều này làm sáng tỏ hơn cho nhận định về cơ chế phân hủy của AZI.
Bảng 3.5. Hằng số tốc độ K và T10% của phản ứng phân hủy AZI trong các môi trường
pH1 pH2 pH 3; pH 4; pH 5
K (phút-1
) T10% (phút) K (phút-1
) T10% (phút) Nồng độ không thay đổi
sau 4 giờ
2,07.10-2 5,1 1,87.10-3 56,3
Nhận xét: sự thủy phân AZI trong nước phụ thuộc rất lớn vào pH môi trường, ở pH<2 dược chất rất kém ổn định. Điều này là do liên kết glycoside với đường cladinose (đường 2-desoxy) rất kém bền trong môi trường acid và dễ dàng bị thủy phân ở điều kiện thường dưới sự xúc tác của acid. Từ kết quả hằng số tốc độ tại các
pH khác nhau ta thấy rằng khi pH tăng 1 đơn vị thì tốc độ phân hủy giảm khoảng 10 lần. Như vậy trong môi trường acid dịch vị AZI bị phân hủy khá nhanh, muốn hạn chế điều này cần tránh giải phóng AZI tại dạ dày hoặc tăng pH dịch vị.
3.1.4. Đ nh gi độ đắng của azithromycin bằng chất chuẩn quinin
Độ đắng của AZI được đánh giá theo hướng dẫn của dược điển châu Âu dựa trên