Môt sô hê dung môi duoc dùng dë châ'm sâc kÿ lôp mông: Hê 1 aceton: NH4OH: n-butanol [3:1: 6],
Hê 2 ethylacetat: aceton: triethylamin [1:2: 0,2], Hê 3 n-butanol: aceton:triethylamin [5: 10: 4], Hê 4 cloroform: metanol: NH4OH [2: 2: 1].
Két qüa sâc kÿ lôp mông dich chiét khâng sinh nôi bào và ngoai bào duoc trînh bày à bâng 2.10. VSV kiëm dinh là B. pumilus.
Bàng 2.10: Két quâ sac kÿ lôp mông
STT Hê dungmôi Khâng sinh ngoai bào Khâng sinh nôi bào
Rf D (mm) Rf D (mm) 1 Hê 1 0,82 11,00 0,82 9,12 Hê 2 0,99 16,06 0,99 12,32 z 0,00 6,30 0,00 4,14 Q Hê 3 0,87 11,84 0,87 8,96 3 0,00 4,82 0,00 3,54 Nhân xét:
- Khâng sinh ngoai bào và khâng sinh nôi bào cô thành phân giông nhau. - Két quâ sâc kÿ cho thâÿ ô hê 1, dich chiét cô mot vét khâng sinh hiên hinh bàng phuong phâp VSV.
- Câc hê 2, 3 cho hai vét khâng sinh hiên hinh bàng phirong phâp VSV, chüng tô khâng sinh do chüng Streptomyces 35.29 sinh tong hop cô ft nhât 2 thành phân cô hoat tmh.
- Vêt khâng sinh không phât quang duoi ânh sâng tü ngoai và cüng không cho phàn üng màu voi thuoc thir hoâ hoc ninhydrin dâ sir dung.
Két quâ sâc kÿ lôp mông trên là co sô cho câc buôc tinh ché tiép theo bàng sâc kÿ côt.
2.2.7. Két quâ cât cô bôt khâng sinh thô
235 ml dich chiét khâng sinh n-Butanol duoc dem cât cô bàng mây cât quay thu duoc 0,2437 g bôt khâng sinh thô màu nâu sâm.
Cân chrnh xâc môt luong bôt khâng sinh thô, hoà tan trong dung môi aceton de duoc dung dich cô nông dô khâng sinh thô 1 mg/ml. Dung dich này duoc dem thir hoat tmh khâng sinh bàng phuong phâp khoanh giâÿ loc, VSV kiëm dinh B. pumilus, P. mirabilis. Song song tién hành vôi mâu chung là dich chiét n-butanol. Két quâ duoc trînh bày trong bàng 2.11.
Bàng 2.11: Két quà thir hoat tinh khâng sinh thô
Mâu thir
Proi teus mirabilis Bacillus pumilus
D (mm) s % hoat tmh D (mm) s % hoat tmh Khâng sinh/aceton 21,28 0,23 103,70% 22,01 0,16 102,85% Dich chiét n-butanol 20,52 0,28 100,00% 21,40 0,33 100,00%
Nhân xét: Qua bàng trên cho thâ'y nông dô khâng sinh thô trong dich chiét n-butanol khoàng 0,96 mg/ml.
Sâc kÿ lôp mông lai vôi khâng sinh thô duoc két quà trong bàng tiép theo:
Bàng 2.12: Két quâ sàc kÿ lôp mông vôi khâng sinh thô
STT Hê dung môi Rf D (mm)
1 H êl 0,82 11,00
2 Hê 2 0,990,00 16,067,30
Nhân xét:
- Khâng sinh thô cô ft nhât hai thành phân cô hoat tinh.
- Cô thë sir dung câc hê dung môi 1, 2 và 4 dë tâch riêng câc thành phân cô hoat tinh bàng sàc kÿ côt.
2.2.8. Két quâ thu hoat tinh chông nâm
Dung dich khâng sinh/aceton trên duoc dùng dë thü hoat tinh chông nâm cüa khâng sinh do chüng Streptomyces 35.29 sinh tong hop, bàng phuong phâp khoanh giây loc. VSV kiëm dinh là C. albicans, Moc xanh sp.l, Moc den
sp.l Két quâ vong vô nâm duoc trînh bày trong bâng 2.13.
Bâng 2.13: Két quâ thü hoat tinh chông nâm
Chüng VSV kiëm dinh D ( mm) s
C.albicans 9,27 0,05
Moc den sp.l 17,76 0,74
Moc xanh sp.l 0,00 0,00
Nhân xét :
Qua bâng 13 cho thây khâng sinh do chüng Streptomyces 35.29 sinh tong hop cô tâc dung khâng nâm khâ manh voi chüng Moc den sp.l, tâc dung yêu voi Candida albicans, và không cô tâc dung voi Moc xanh sp.l.
2.2.9. Két quâ sàc kÿ côt
Dë tinh ché và tâch riêng câc thành phân trong khâng sinh thô do chüng
Streptomyces 35.29 sinh tong hop, chüng tôi tien hành sàc kÿ côt dua trên câc két quâ tù sàc kÿ lôp mông.
Sur dung:
- Hê chay sàc kÿ: hê dung môi 1, 2,4 dâ sü dung trong sàc kÿ lôp mông . - 18 g Silicagel 60 Merck (16 g nhôi côt và 2 g thâm 2 ml methanol dâ
- Bôt khâng sinh thô m=0,2342 g,
Tiên hành rijra giài bât dâu voi hê dung môi thu” 2, tiép theo lân lirçrt vôi hê dung môi 1, hê dung môi 4.
Két quâ: Thu duofc 15 phân doan, két quâ hoat tmh câc phân doan duofc trînh bày trong bâng 2.14, VSV kiëm dinh là B. pumilus.
Bâng 2.14: Két quâ sâc kÿ côt
Phân doan Câm quan D (mm) s Hoat tmh khâng sinh
1 Không màu 0,00 0,00 Không cô
2 Màu dô 22,25 0,00 Manh
3 Vàng cam 19,13 0,29 Manh
4 Vàng cam nhat 12,59 0,33 Cô
5 Vàng 10,15 0,24 Yêu
6 Vàng nhat 0,00 0,00 Không cô
7 Không màu 0,00 0,00 Không cô
8 Vàng nâu 9,97 0,14 Yêu
9 Vàng nâu dâm 14,79 0,36 Cô
10 Vàng nâu 11,86 0,33 Cô
11 Vàng 10,97 0,31 Cô
12 Vàng 9,22 0,34 Yêu
13 Không màu 0,00 0,00 Không cô
14 Nâu den 13,92 0,50 Cô
15 Không màu 0,00 0,00 Không cô
Nhân xét:
- Khâng sinh duçfc tâch thành ba thành phân cô hoat tmh . - Câc phân doan 2, 3 cho hoat tmh khâng sinh manh nhât.
Bàng 2.15: Két quâ sàc kÿ lôp mông câc phân doan Phân
doan
Butylacetat:aceton:DMF
________ (2:2:1)________ BuOH : aceton: triety lamin
________(2:2:1)________ BuOH:EtOH:DMF (3:1:1) Rf Rf Rf 0,81 0,90 0,85 0,81 0,90 0,85 8 0,67 X 0,82 0,67 X 0,82 12 0,67 X 0,82 14 X X X X: không hiên hînh vét Nhân xét:
- Khâng sinh do chüng Streptomyces 35.29 sinh tong hop co ft nhât ba thành phân co hoat tmh. Gôp câc phân doan cô hoat tmh giông nhau dem cô lây cân tinh khiét.
- Câc vét khâng sinh trên không phât quang duôi ânh sâng tü ngoai và cüng không cho phân ûng màu vôi thuôc thû ninhydrin dâ sü dung.
2.2.10. Két quâ tinh ché khâng sinh
Phân doan sâc kÿ thû 2-5 gôp lai thu duoc 0,1645 g bôt khâng sinh màu dô vàng (35A). Phân doan thû 8-12 thu duçfc 0,0471 g chât nâu sâm thé chât dàu (35B). Phân doan 14 thu duoc 0,0142 g chât màu vàng nâu (35C) thé chât dàu.
Hiêu suât tinh ché : 0,1 6 4 1 42£ x x 0o =96,41 %
0,2342g
Nhân xét:
- Hiêu suât tinh ché khâng sinh bàng côt sâc kÿ khâ cao.
2.2.11. Két quâ do pho hông ngoai (IR), pho tur ngoai-khâ kién (UV-VIS)
- Pho UV-VIS (xem phu lue) cho két quà sau:
+ Mâu 35A co hai eue dai hâp thu à câc buôc song: ^max 1= 208 nm, ?imax 2= 440 nm,
+ Mâu 35B co mot eue dai hâp thu à buôc song: À,max=217 nm, + Mâu 35C không co eue dai hâp thu nào.
- Pho IR (phu lue) mâu 35A cho câc dâi hâp thu dâc trung sau: + 3397 cm'1 : (amin, amid); v0H (alcol, phénol),
+ 2965 cm'1 : vc_H (nhôm CH3, CH2), + 1746 cm'1 : vc=Q (ester),
+ 1653 cm'1 : vc=G (amid hoâc ceton a, (3- không no), + 1582 cm'1 và 1509 cm'1 : vc.c (nhân benzen),
+ 1193 cm'1 và 1096 cm'1 : ÔC.H (nhân benzen).
Nhân xét:
- Moi cô thành phân khâng sinh 35A do duoc pho IR (mâu 35B, 35C cân chuân bi mâu do theo phucfng phâp khâc).
- Dua vào két quâ pho IR cho ta nhiêu du kién vê nhôm dure cô thë cô trong câu truc cüa khâng sinh thành phân 35 A.
2.2.12. Két quâ do nhiêt dô nông chây bôt khâng sinh 35 A
Dùng mây do nhiêt dô nông chày Gallen-Kamp, duoc két quâ nhiêt dô nông chây bôt khâng sinh 35A là 205°C -210° C.
Nhân xét: Khâng sinh thành phân 35A cô diëm nông chây rât cao. 2.2.13. Hoat tinh khâng sinh 35A trên mot so chung VSV kiëm dinh
Sau khi cô sân phâm khâng sinh tinh khiét, chüng tôi quyét dinh thü hoat tmh thành phân khâng sinh (35A) trên 10 chüng VSV kiëm dinh, dë so bô dânh
Dùng phuang phâp khoanh giâÿ loc, bôt thành phân khâng sinh 35A duoc hoà tan trong aceton voi nông dô 0,1 mg/ml. Két quâ duoc trinh bày trong bâng 2.16.
Bâng 2.16: Tâc dung cüa khâng sinh trên câc vi khuân kiëm dinh
VSV kiëm dinh D (mm) s E.coli 0,00 0,00 P. mirabilis 20,94 0,24 S.flexneri 0,00 0,00 S. typhi 0,00 0,00 P. aeruginosa 18,87 0,29 S. aureus 22,18 0,10 B. pumilus 21,50 0,13 B. subtilis 21,01 0,10 B. cereus 18,39 0J1 S. lutea 21,05 0,15 Nhân xét:
Nhu vây thành phân khâng sinh 35A co tâc dung vôi 5/5 chùng vi khuân Gr (+) và 2/5 chüng vi khuân Gr (-) duoc thü nghiêm.
2.2.14. Thûr hoat tmh khâng sinh à câc nông dô pha loâng
Cân m = 0,0109 g bôt mâu 35A, hoà tan vôi chrnh xâc 100 ml aceton (dùng bînh dinh müc 100) duoc dung dich gôc cô nông dô khâng sinh 109 |iig/ml. Tù dung dich gôc lân luot pha loâng gâp dôi dë duoc dây dung dich cô dô pha loâng 2, 4, 8...64 lân. Thü hoat tmh dây dung dich bàng phuong phâp khoanh giây loc.
Bàng 2.17: Thir hoat tinh khâng sinh à câc nông dô pha loâng
Dô pha loâng Dung môi aceton
D (mm) s 1 20,53 0,76 2 18,06 0,35 4 15,84 0,44 8 13,80 0,22 16 12,13 0,41 32 10,00 0,51 64 0,00 0,00 Nhân xét:
Khâng sinh thành phân 35A con hoat tinh dôi vôi B. pumilus à dô pha loâng 32 lân, tirong ûng vôi nông dô khâng sinh là 3,4 (ig/ml (vôi dung môi aceton).
2.2.15. Sa âô tong quât quy trînh lên men sân xuât, tinh ché khâng sinh
Sau khi két thuc quâ trînh lên men-tinh ché, chüng tôi dê xuât so dô tong quât quy trînh lên men sân xuât và tinh ché khâng sinh do chüng
Hînh 2.1: Sa dô tong quât qui trînh lên men, tinh ché khâng sinh ttr
PHÂN 3. KÉT LUÂN VÀ DE XUÂT
3.1. Két luân:
Sau thôi gian tién hành thuc nghiêm, chüng tôi dâ hoàn thành duoc câc mue tiêu dê ra và thu duoc câc két quâ sau:
- Quâ trînh câi tao và chon giông thu duoc câc bién chüng cô khà nâng sinh tong hop khâng sinh tôt hon chüng xuât phât. Dô là câc dang chüng 5,
14, 17 sau sàng loc ngâu nhiên, bién chüng 17.1, 17.2, 17.16 sau dôt bién lân 1, bién chüng 1.1, 1.13, 1.21 sau dôt bién lân 2, bién chüng 13.4, 13.7, 13.28 sau dôt bién lân 3.
- Khâng sinh duoc chiét kiêt tù dich lên men bàng n-butanol, pH 3.
- Khâng sinh do Streptomyces 35.29 sinh tong hop cô tâc dung doi vôi
moc den sp.l và vi nâm Candida albicans.
- Sau khi sâc kÿ côt, khâng sinh duoc tâch thành ba thành phân cô hoat tmh, kf hiêu: 35A (màu dô vàng), 35B (màu nâu sâm), 35C (màu vàng nâu). Trong dô 35A là thành phân cô hoat tmh manh nhât và tî lê khôl luong khô lôn nhât.
Bôt khâng sinh 35A cô nhiêt dô nông chây cao 205 °C- 210°C.
- Thành phân khâng sinh 35A là khâng sinh ph6 rông, tâc dung tôt trên câc vi khuân Gr (+) và cô tâc dung trên mot sô vi khuân Gr (-).
- Tmh nhay càm cüa vi khuân Bacillus pumilus vôi thành phân khâng sinh 35A khâ cao, à nông dô khâng sinh là 3,4 (J.g/ml (dung môi aceton) dâ cô tâc dung.
- Quang pho hông ngoai cho thâ'y thành phân khâng sinh 35A cô câc dài hâp thu dâc trung ûng vôi câc nhom chüc: 3397 cm'1 (-NH amin, amid hoâc - OH alcol, phénol), 2965 cm*1 (-C-H nhom CH2, CH3), 1746 cm'1 (-C=0- ester), 1653 cm'1 (-C=0- amid hoâc ceton a, p- không no), 1582 cm'1 và 1509 cm'1
3.2. De xuât:
Sau khi két thuc thuc nghiêm chüng tôi co môt sô' dê xuât sau:
- Tiép tue tien hành cài tao giong dë thu duoc chüng cô khâ nâng sinh tong hop khâng sinh ngày càng tôt hon.
- Tôi uu hoâ môi trucfng lên men nham nâng cao hiêu suât sinh tong hop khâng sinh cüa chüng Streptomyces 35.29.
- Nghiên cüu sâu hon dë hoàn thiên quâ trînh chiêt tâch và tinh ché, tién hành do pho khôi, pho công hircmg tir hat nhân...nhàm xâc dinh câu truc hoâ hoc và tinh chât hoâ li khâc cüa khâng sinh.
- Nghiên cüu thêm vê khà nâng khâng nâm cüa khâng sinh do chüng
Streptomyces 35.29 sinh tong hçfp, thành phân cô tâc dung chông nâm eu thë. - Nghiên cüu thêm câc khâ nâng üng dung và tién hành thü nghiêm phât triën vôi khâng sinh néu diêu kiên cho phép.
TÀILIÊU THAM KHÂO
1. Bô môn Công nghiêp Dugc (2003), Kÿ thuât sân xuât Duçfc phâm.
Trucmg DH Dugc Hà Nôi, tâp I, tr. 142-163,165-197.
2. Bô môn Dugc lÿ (2004), Duoc lÿ hoc. Trucmg DH Dugc Hà Nôi, tâp II, tr. 112-162.
3. Bô môn Hoâ dugc (2004), Hoâ duoc. Trucmg DH Dugc Hà Nôi, tâp II, tr. 146-259.
4. Bô môn Hoâ phân tich (2002), Hoâ phân tich. Trucmg DH Dugc Hà Nôi, tâp II, tr. 25-27, 49-54.
5. Bô môn Hoâ sinh-Vi sinh (1999), Vi sinh hoc. Trucmg DH Dugc Hà Nôi, tr. 24-26, 57.
6. Bô môn Vi sinh- sinh hoc (2005), Vi sinh hoc. Trucmg DH Dugc Hà Nôi, tr. 21-25, 76-79.
7. TS. Nguyên Vân Câch (2005), Công nghê lên men câc chât khâng sinh. NXB Khoa hoc và kÿ thuât, tr. 9-16, 24-27.
8. Nguyên Lân Düng, Nguyên Vân Quyên, Pham Vân Ty (1997), Vi sinh vât hoc. NXB GD, tr. 38-41, 381-394.
9. Tù Minh Koong (2004), Co sô công nghê sinh hoc và sân xuât Duç/c phâm. NXB Y hoc, tr. 42-45, 84-86.
10. Lê Dinh Lucmg, Phan Cu Nhân (1997), Co sô di truyên hoc. NXB Giâo Duc, tr. 40-45.
11. Chu Vân Men (2006), Nghiên cüu sinh tong hop khâng sinh tù Streptomyces 35.29. Khoa luân tôt nghiêp Dugc sï khoa 2001-2006.
12. Lê Xuân Phuong (2001), Vi sinh vât công nghiêp. NXB Xây Dung, tr. 47-49,214-216,276-278.
13. Trân Thi Thanh (2003), Công nghê Vi Sinh. NXB Giâo Duc, tr. 40-
14. TS. Tràn Thi Xô, ThS. Nguyên Thi Lan (2005), Ccf sô di truyên và công nghê gen. NXB Khoa hoc và kÿ thuât, tr. 90-99.
15. Wolgang Fritsche (1983), Ccf sô hoâ sinh cüa Vi sinh vât hoc công nghiêp. NXB Khoa hoc và Kÿ thuât, tr. 22-26, 40-61.
16. Nester, Anderson, Roberts, Pearsall (2004), Microbiology- Ahuman perspective. Me Graw Hill, p. 508-509.
17. O. Kayser, R.H.Muller (2003), Pharmaceutical Biotechnology- Drug Discovery and Clinical Applications. Wiley-VCH, p. 9-15.
18. Yi Yu, Linquan Bai, Kazuyuki Minagawa, Xiaohong Jian, Lei li, Jialiang Li, Shuangya Chen, Erhu Cao, Taifo Mahmud, Heinz G. Floss, Xifuen Zixin Deng. “Gene Quster Responsible for Validamycin Biosyntheis in Streptomyces hygroscopicus subsp. Jinggangensis 5008”. Applied and Environmetal Microbiology (sept. 2005), Vol. 71, No. 9, p. 5066-5076.
19. Yuuki Awa, Noritaka Iwai, Tomohiko Ueda, Kenji Suzuki, Shoji Asano, Jun-ichi Yamagishi, Kazuo Nagai, and Masaaki Wachi. “Isolation of a New Antibiotic, Alaremycin, Structurally Related to 5-Aminolevulinic Acid from Streptomyces sp. A012304”. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry (sept. 2005), Vol. 69, No. 9, p. 1721-1725.
20. Nilanshu Shekhar, Debaditya Bhattacharya, Dishant Kumar, and Rajinder K. Gupta. “Biocontrol of wood-rotting fungi with Streptomyces violaceusniger XL-2”. Canadian Journal of Microbiology (sept. 2006), Vol. 52, No. 9, p. 805-808.
PHU LUC
Bâng PL.l : Mot so khâng sinh co nguôn gôc tir Streptomyces
duoc su dung trong thuc té [17] Tên khâng sinh Streptomyces sân xuât Üng dung
Amphotericin S.nodosus Khâng nâm
Avermectin S.avermitilis Khâng ki sinh trùng Bleomycin S.verticillus Khâng ung thu Bialaphos S.hygroscopicus Thuôc diêt cô
Clavulanic acid S.clavuligerus Két hop voi khâng sinh P-lactam
Cloramphenicol S.venezuelae Khâng khuan Chlortertacyclin S.aureofaciens Khâng khuân Cyclohexamide S.griceus Khâng sinh Dactinomycin S.parvulus Khâng ung thu Daunorubicin S.peucetius Khâng ung thu Kanamycin S.kanamycetius Khâng khuan Lincomycin S.lincolnensis Khâng khuan
Milbemycin S.hygroscopicus Khâng ki sinh trùng Mithramycin S.argillaceus Khâng ung thu
Neomycin S.fradiae Khâng khuan
Nikkomycin S.tendae Khâng nâm
Nystatin S.noursei Khâng nâm
Spiramycin S.ambofaciens Khâng khuan
Streptomycin S.griseus Khâng khuân
Hinh PL.l: Két quâ thû hoat tinh khâng sinh bàng phuong phâp khoi thach. Vi khuân kiëm dinh là Proteus mirabilis.
Hinh PL.3: Két quà thü hoat tinh pha dmhc và pha ntfcirc sau khi chiét khâng sinh bàng n-Butanol, pH 3. Vi khuân kiëm dinh là Baciluspumlus.
Hînh PL.5: Két quâ sàc kÿ lcrp mông khâng sinh thô voi hê
Ethylacetat: aceton: triethylamin (1:2: 0,2).