D A+ 2B + 3C Trong đó: : mức độ tổn thương (điểm)
3.2.NGHIÊN CỨU PHẦN HOÁ HỌC 1 Định tính
Phần 3: KÊT QUẢ NGHIÊN cứu VÀ BÀN LUẬN
3.2.NGHIÊN CỨU PHẦN HOÁ HỌC 1 Định tính
3.2.1. Định tính
3.2.1.1. Phản ứng hoá học
Tiến hành định tính với MNC là cao lỏng NNHV và cao lỏng NNHV đã được bảo quản sau 1 0 0 ngày.
* Alcaloid
- Chuẩn bị mẫu: Lấy 20ml MNC cho vào bình gạn, kiềm hoá bằng NH4 0Hj đến pH =^8-9 (khoảng 2.5ml). Lắc với chloroform 31ần X lOmlAần,
gộp dịch chiết chloroform —^ c ắ n + lOml HCl 5% —> dịch nước acid, kiềm hoá bằng NH4 0H^j đến p / / » 8 - 9 (khoảng 3ml). Lắc với chloroform 31ần X
lOml/lần, gộp dịch chiết, chia làm 2 phần — cắn. Một phần hoà tan vào Iml MeOH để chấm sắc ký, phần còn lại hoà tan trong 5ml HCl 5% để định tính bằng phản ứng hoá học.
- Tiến hành:
Cho vào 3 ống nghiệm nhỏ mỗi ống Iml dịch chiết acid, nhỏ vào từng ống nghiệm 2 - 3 giọt lần lượt các thuốc thử sau;
ống 1: thuốc thử May er -> pư (+) nếu có ị màu trắng đến vàng.
ống 2: thuốc thử Bouchardat —> pư (+) nếu có ị nâu.
ống 3: thuốc thử Dragendorff ^ pư (+) nếu có ị đỏ cam. * Flavonoid:
- Chuẩn bị mẫu: Lấy 20ml MNC cho vào bình gạn, loại tạp chất bằng chloroform SlầnxlOmlAần, bỏ dịch chloroform, thêm ethylacetat vào dịch nước lắc 31ầnx20ml/lần. Gộp dịch chiết ethylacetat, chia làm 2 phần, cô cách thuỷ đến cắn, một phần cắn hoà tan trong 5ml EtOH được dung dịch F| để làm định tính bằng phản ứng hoá học, một phần cắn hoà tan trong Iml MeOH được dung dịch p2 để chấm sắc ký.
- Tiến hành:
+ Phản ứng Cyanidin:
Iml ddFj + lOmgMg + 3 giọt HClj —^ pư (+) nếu dung dịch có màu đỏ. + Phản ứng với kiềm:
Iml ddF, + 3 giọt NaOH 10% -> pư (+) nếu màu vàng tăng lên hoặc có
vàng — ị tan tạo thành dung dịch màu vàng.
Nhỏ 1 giọt ddF| lên giấy lọc, để khô, hơ lên miệng lọ NH3 đ -> pư (+) nếu thấy màu vàng tăng lên.
+ Phản ứng với FeClji
* Saponin
- Chuẩn bị mẫu: Lấy 20ml MNC cho vào bình gạn, lắc với ether dầu hoả đến khi lớp ether trong. Lắc tiếp với n-butanol 31ần X lOml/lần, gộp dịch
chiết n-butanol, chia làm 2 phẩn —^ cắn. Một phần cắn hoà tan trong H2O được dung dịch s, để làm phản ứng hoá học, phần còn lại hoà tan vào Iml MeOH được dung dịch S2 để chấm sắc ký.
- Tiến hành:
+ Quan sát hiện tượng tạo bọt:
ống nghiệm: Iml ddSj + 5ml nước -> lắc kỹ để yên, quan sát pư (+) nếu bọt bền sau 15’.
+ Phản ứng Rosenthaler:
ống nghiệm; Iml ddS| + vanilin 1%/HCl — pư (+) nếu có màu hoa cà. + Phản ứng Caư - Price:
ống nghiệm: Iml ddS| — cắn + Iml cồn + 1 - 2 giọt SbClg 2 0%/CHCl3 -> soi huỳnh quang, pư (+) nếu dung dịch cho huỳnh quang xanh hoặc vàng
( Ẫ = 365nm ).
Kết quả định tính một số nhóm chất hoá học trong MNC bằng các phản ứng hoá học được trình bày trong bảng 3.2. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.2. Kết quả định tính một số nhóm chất hoá học trong cao lỏng NNHV bằng các phản ứng hoá học.
cao lỏng NNHV cao lỏng NNHV đã bảo quản
Thuốc thử Mayer + +
Alcaloid Thuốc thử Bouchardat + +
Thuốc thử Dragendorff + +
Phản ứng Cyanidin + +
Flavonoid Phản ứng với kiềm + +
Phản ứng với FeCl3 + + Phản ứng tạo bọt + + Saponin Phản ứng Rosenthaler + + Phản ứng Carr - Price + (vàng) + (vàng)
Nhận xét: Trong cả hai MNC đều có chứa alcaloid, flavonoid và saponin.
3.2.I.2. SKLM
* Alcaloid
- Mẫu thử; dung dịch alc/ MeOH chiết từ MNC.
- Mẫu đối chứng: dung dịch Berberin hydrochlorid chuẩn và dung dịch Palmatin hydrochlorid chuẩn trong Methanol.
- Bản mỏng Silicagel GF254 (Merck), hoạt hoá ở 110°c/lh. - Hệ dung môi khai triển:
(1) Toluen : Aceton : MeOH : NH4ƠH(J (2) Chloroform : MeOH
(3) Chloroform : MeOH : NH4OH4
(4) Toluen : Ethylacetat: Aceton : Acid formic (5) n - butanol: Acid acetic ; H2O
(10: 10: 1.5 : 1) ( 9 : 1 )
(20 : 3.5 : 0.5) (5 ; 2 : 2 : 1) (8 : 1 : 1)
- Hiện màu: + Soi dưới đèn uv ở Ả = 365rim.
+ Phun thuốc thử Dragendorff.
Qua thăm dò một số hệ dung môi SKLM, kết quả cho thấy hệ (5) tách vết tốt, vết tròn, rõ. Kết quả được trình bày ở hình 3.1.
a b
Hình 3.1. Sắc ký đồ của dịch chiết alcaloid trong cao lỏng NNHV.
a: Hiện màu bằng thuốc thử dragendorff. b: Soi dưới đèn u v ở Â = 365nm.
B: Berberin. P: Palmatin.
Alc: dịch chiết alcaloid trong cao lỏng NNHV. * Flavonoid
- Mẫu thử: dung dịch flavonoid/ MeOH chiết từ MNC (dung dịch Fj). - Mẫu đối chứng:
+ Flavonoid trong nhân trần: cân khoảng lOg nhân trần đã chế biến, thêm
Chloroform (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
^dịch chiết nước eth yla cetctíx 3 ỉx \ Om/
^dịch chiết ethylacetat—^ c ắ n + Iml MeOH dung dịch chấm sắc ký.
+ Flav trong Cam thảo: chiết tương tự như đối với Nhân trần, được dung dịch cắn Aavonoid/ MeOH để chấm sắc ký.
- Bản mỏng Silicagel G F 2 5 4 (Merck), hoạt hoá ở 110°c/lh. - Hệ dung môi khai triển:
(1) Ethylacetat: MeOH : H2O (2) Chloroform : MeOH
(3) Ethylacetat: Acid formic : Chloroform (4) Ethylacetat: n - Butanol: Acid acetic : HjO (5) Toluen : Ethylacetat: Acid formic
- Hiện màu: + Soi dưới đèn uv ở Ầ = 365nm và 254nm.
+ Thuốc thử AICI3 3%/ EtOH.
Qua thăm dò một số hệ dung môi SKLM, kết quả cho thấy hệ (5) tách vết nhiều, rõ ràng nhất. Kết quả được trình bày ở hình 3.2.
(20 : 3.5 : 2.5) (9 : 1) (2 : 1: 2) (5 : 2 : 2 : 2) (5 :6: 1) a b c
a: Hiện màu bằng AICI3 3%/EtOH.
b, c: Soi dưới đèn u v lần lượt ờ Ằ = 365nm và 254nm.
ct: cam thảo. nt: nhân trần
f: dịch chiết flavonoid trong cao lỏng NNHV. * Saponin
- Mẫu thử: dung dịch saponin/MeOH chiết từ MNC (ddSj).
- Mẫu đối chứng: dung dịch saponin/MeOH chiết từ cam thảo: cân khoảng lOg cam thảo đã chế biến, thêm nước ngập mặt dược liệu (khoảng
50ml)— >gạn—^ lOml dịch gạn— chiết nước—- -“-■''°' >dịch
chiết n-butanol—^ c ắ n + Iml MeOH dung dịch chấm sắc ký. - Bản mỏng Silicagel GF254 (Merck), hoạt hoá ở 110°c/lh. - Hệ dung môi khai triển:
(1) Chloroform : MeOH (9 . 2 : 0.8) (2) Ethylacetat; Acid acetic : HjO (8 :2 : 1) (3) Dichloromethan : MeOH : Chloroform (30 : 2 : 0.5)
(4) Benzen : Aceton ( 9 : 1 )
(5) Benzen : Aceton : MeOH (18 : 3 : 2)
(6) Benzen : MeOH ( 9 : 1 )
(7) Chloroform : Ethylacetat: MeOH (18 : 3 : 1) (8) Chloroform : Aceton : Acid acetic ( 1 6 : 4 : 1) (9) Cyclohexan : Ethylacetat ( 4 : 6 )
- Hiện màu: + Soi dưới đèn ưv ở Ằ=254nm và 365nm.
+ Dung dịch vanilin sulfuric (lOOml vanilin 1% trong cồn tuyệt đối + 2ml H2SO4J).
Qua thăm dò một số hệ dung môi trên, kết quả cho thấy hệ (3) tách vết nhiều, rõ ràng nhất. Kết quả được trình bày ở hình 3.3.
4
Hình 3.3. Sắc ký đồ của Saponin.
a: Hiện màu bằng vanilin sulfuric,
b, c; Soi dưới đèn ưv lần lượt ở Ả = 365nm và 254nm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ct: cam thảo.
s: dịch chiết saponin trong cao lỏng NNHV.
Kết quả định tính bằng SKLM được trình bày trong bảng 3.3, bảng 3.4 và bảng 3.5.
Bảng 3.3. Kết quả định tính alcaloỉd trong cao lỏng NNHV bằng SKLM.
ST T
Cao lỏng NNHV Berberin Palmatin
365|j,m Dragendorff 365 |im Dragendorff 365|im Dragendorff
1 0.35 (xanh lục) 0.35 (vàng) 0.56 (xanh lục) 0.56 (da cam) 0.46 (xanh lục) 0.46 (da cam) 2 0.46 (xanh lục) 0.46 (da cam) 3 0.56 (xanh lục) 0.56 (da cam)
Nhận xét: sắc ký đồ của dịch chiết alcaloid trong cao lỏng NNHV cho 3 vết, trong đó có 2 vết cho Rf tương đương với Rf của berberin (Rf = 0.56) và palmatin (Rf = 0.46).
Bảng 3.4. Kết quả định tínhỷlavonoid trong cao lỏng NNHV bằng SKLM.
STT
C a o lỏ n g N N H V Cam th ảo N h â n trần