Mục đích:
Định lợng protein.
Cách làm:
Giai đoạn đầu thực hiện phản ứng Biure, sau đó mới thêm thuốc thử Folin-Xiocanto.
Quan sát:
Xuất hiện phức chất màu xanh.
Cờng độ màu phản ứng phụ thuộc nhiều vào loại protein. Ví dụ cùng 1 nồng độ, dung dịch tripsin cho cờng độ màu cao gấp 3 lần gelatin.
Giải thích:
Thuốc thử Folin – Ciocateau cú chứa photphomolipdic axit và photphovoframmic axit. Cỏc chất này làm tăng độ nhạy của phản ứng biure, mặt khỏc phản ứng với gốc Tyr và Trp trong phõn tử protein. Cỏc amino axit này tham gia trong quỏ trỡnh tạo phức chất màu xanh da trời.
* Ngoài ra còn một số phản ứng khác nh:
+ Phản ứng của nhóm α-amin với foocmanđehit (Phản ứng Xiorenxen) để đánh giá mức độ thuỷ phân protein. Foocmanđehit phản ứng với nhóm amin tạo thành dẫn xuất metylen của axit amin. Do nhóm amin đã bị khoá nên có thể chuẩn độ nhóm cacboxyl bằng kiềm, từ đó tính đợc số nhóm amin.
+ Phản ứng Pauli: cỏc gốc Tyr, His trong protein tỏc dụng với điazobenzosulfonic axit tạo màu đỏ anh đào.
+ Phản ứng Millon: gốc Tyr tỏc dụng với Hg(NO3)2 trong HNO3 đặc tạo thành kết tủa màu nõu đất.
+ Phản ứng Saccaguichi: gốc Arg tỏc dụng với dd kiềm của α –naphotol và HBr cho màu đỏ anh đào.
CÂU HỎI KIỂM TRA
Cõu 1: Tại sao núi cấu trỳc bậc một của protein cú vai trũ tối quan trọng trong cấu trỳc và vai trũ của phõn tử protein?
Gợi ý đỏp ỏn:
Cấu trỳc bậc một của protein cú vai trũ tối quan trọng vỡ: - Trỡnh tự cỏc axit amin trờn chuỗi polypeptit sẽ thể hiện tương tỏc giữa cỏc phần trong chuỗi polypeptit, từ đú tạo nờn hỡnh dạng lập thể của protein (cấu trỳc bậc I sẽ quyết định cấu trỳc bậc II, III và IV của protein) và do đú quyết định tớnh chất cũng như vai trũ của protein.
- Sự sai lệch trong trỡnh tự sắp xếp của cỏc axit amin cú thể dẫn đến sự biến đổi cấu trỳc và tớnh chất của protein. Sự khỏc nhau về thành phần, số lượng và trật tự sắp xếp cỏc axit amin tạo nờn sự đa dạng của protein, từ đú tạo nờn tớnh đa dạng của sinh giới.
Cõu 2: Sự khỏc biệt trong cấu trỳc xoắn anpha và nếp gấp beta trong cấu trỳc bậc hai của phõn tử protein là gỡ? Những loại protein nào thường cú cấu trỳc xoắn anpha, cũn loại nào thường cú cấu trỳc nếp gấp beta?
Gợi ý đỏp ỏn:
Cấu trỳc nếp gấp β khỏc với xoắn α ở một số điểm như sau:
+Đoạn mạch polipeptit cú cấu trỳc phiến gấp β thường duỗi dài ra chứ khụng cuộn xoắn chặt như xoắn α. Khoảng cỏch giữa 2 gốc axit amin kề nhau là 3,5A0.
+Liờn kết hidro được tạo thành giữa cỏc nhúm –NH- và –CO- trờn 2 mạch polipeptit khỏc nhau, cỏc mạch này cú thể chạy cựng hướng hay ngược hướng với nhau.
Trong phõn tử của nhiều protein hỡnh cầu cuộn chặt, cũn gặp kiểu cấu trỳc "quay- β". Ở đú mạch polipeptit bị đảo hướng đột ngột. Đú là do tạo thành liờn kết hidro giữa nhúm –CO của liờn kết peptit thứ n với nhúm –NH của liờn kết peptide thứ n+2.
Cỏc protein dạng hỡnh cầu thường cú cấu trỳc nếp gấp β trong khi cỏc protein dạng sợi như keratin thường cú cấu trỳc xoắn α.
Cõu 3: Tại sao một số sinh vật sống trong cỏc suối nước núng mà protein của chỳng lại khụng bị hư hỏng?
Khi nhiệt độ mụi trường quỏ cao cú thể phỏ hủy cấu trỳc khụng gian 3 chiều của prụtờin làm cho chỳng mất chức năng (hiện tượng biến tớnh của prụtờin). Một số vi sinh vật sống được ở trong suối nước núng cú nhiệt độ xấp xỉ 1000C mà prụtờin của chỳng lại khụng bị hỏng do prụtờin của cỏc loại sinh vật này cú cấu trỳc đặc biệt nờn khụng bị biến tớnh khi ở nhiệt độ cao. Vớ dụ: trong phõn tử protein giàu axit amin chứa lưu huỳnh giỳp chỳng cú tớnh bền nhiệt.
Cõu 4: Tại sao khi ta đun nước lọc cua thỡ lại tạo thành mảng (gạch cua) nổi lờn? Gợi ý đỏp ỏn:
Trong mụi trường nước của tế bào, prụtờin thường quay cỏc phần kị nước vào bờn trong và bộc lộ phần ưa nước ra bờn ngoài. Ở nhiệt độ cao, cỏc phõn tử chuyển động hỗn loạn làm cho cỏc phần kị nước ở bờn trong bộc lộ ra ngoài, nhưng do bản chất kị nước nờn cỏc phần kị nước của phõn tử này ngay lập tức lại liờn kết với phần kị nước của phõn tử khỏc làm cho cỏc phõn tử nọ kết dớnh với phõn tử kia. Do vậy, prụtờin bị vún cục và đúng thành từng mảng nổi trờn mặt nước canh.
Cõu 5: Phõn tử Ribonucleaza gồm 1 chuỗi polipeptit với 124 axit amin, cú 4 cầu đisulfua. Ở pH = 7, t0 =370C, dựng β-mecaptoetanol dư để khử 4 cầu đisulfua và ure để phỏ vỡ cỏc liờn kết khỏc. Kết quả làm phõn tử enzim mất hoạt tớnh xỳc tỏc. Nếu thẩm tớch dung dịch này để loại β-mecaptoetanol và ure, hoạt độ enzim tăng dần đến phục hồi hoàn toàn. Nếu oxi húa enzim đó mất cầu –S-S- trong mụi trường cú ure rồi mới thẩm tớch loại ure, hoạt độ enzim chỉ phục hồi 1%. Hóy giải thớch.
Gợi ý đỏp ỏn:
- Ban đầu, khi dựng β-mecaptoetanol dư để khử 4 cầu đisulfua và ure để phỏ vỡ cỏc liờn kết khỏc làm phõn tử enzim mất hoạt tớnh xỳc tỏc do đó làm biến tớnh phõn tử enzim bằng cỏch phỏ vỡ cấu trỳc khụng gian của nú.
- Thẩm tớch dung dịch này để loại β-mecaptoetanol và ure, hoạt độ enzim tăng dần đến phục hồi hoàn toàn là do loại bỏ tỏc nhõn biến tớnh dẫn đến hồi tớnh, khụi phục cấu trỳc khụng gian, phục hồi chức năng xỳc tỏc của enzim.
- Oxi húa enzim đó mất cầu –S-S- trong mụi trường cú ure rồi mới thẩm tớch loại ure, hoạt độ enzim chỉ phục hồi 1% vỡ trong điều kiện này cú thể tạo thành cỏc cầu –S-S- theo nhiều cỏch khỏc nhau (cú tới 105 cỏch) nhưng chỉ cú 1 cỏch giống với dạng ban đầu.
Cõu 6: Tại sao protein vừa cú tớnh đa dạng rất cao song lại cú tớnh đặc thự? Tớnh đặc thự này do yếu tố nào quy định?
Gợi ý đỏp ỏn:
Từ 20 loại axit amin kết hợp với nhau theo những cỏch khỏc nhau tạo nờn vụ số loại prụtờin khỏc nhau (trong cỏc cơ thể động vật, thực vật ước tớnh cú khoảng 1014 – 1015 loại prụtờin). Mỗi loại prụtờin đặc trưng bởi số lượng, thành phần và trỡnh tự sắp xếp cỏc axit amin trong phõn tử. Điều đú giải thớch tại sao trong thiờn nhiờn cỏc prụtờin vừa rất đa dạng, lại vừa mang tớnh chất đặc thự.
Tớnh đặc thự này do thụng tin di truyền quy định.
Cõu 7: Mạch polipeptit mới được tạo thành phải chịu những tỏc động nào để tạo thành protein cú hoạt tớnh sinh học?
Gợi ý đỏp ỏn:
Mạch polipeptit mới được tạo thành phải chịu nhiều tỏc động nào để tạo thành protein cú hoạt tớnh sinh học, gồm:
- Sự gấp cuộn: Khi protein vừa được tổng hợp xong, nú gấp cuộn thành cấu trỳc khụng gian ba chiều xỏc định chức năng sinh học. Một số protein bắt đầu gấp cuộn ngay khi cũn đang được tổng hợp. Mặc dự về nguyờn tắc, polipeptit cú thể hỡnh thành nhiều cấu hỡnh khụng gian khỏc nhau, nhưng tất cả cỏc protein chỉ cú 1 cấu hỡnh tự nhiờn là trạng thỏi cấu trỳc ổn định nhất với mức năng lượng tự do thấp nhất. Ngoài vai trũ chủ yếu của cấu trỳc bậc I cũn cú cỏc nhúm protein chapreron giỳp polipeptit gấp cuộn đỳng hỡnh dạng khụng gian cú đủ hoạt tớnh sinh học.
- Biến đổi cỏc gốc axit amin tựy trường hợp.
- Cỏc biến đổi sau dịch mó như cắt xộn bởi proteaza, thờm nhúm đường, nhúm photphat,…
- Sẽ bị phõn hủy nếu tổng hợp hoặc gấp cuộn sai.
Cõu 8: Cỏc protein nào tham gia vào sự gấp cuộn protein? Gợi ý đỏp ỏn:
Các nhà khoa học đã phát hiện ra Chaperonin (hay protein chaperon) giúp cuộn xoắn các protein khác.
Chaperon cú 2 nhúm:
- Cỏc chaperon phõn tử như Hsp 60 và Hsp70 gắn và ổn định cỏc protein khụng hoặc cuộn gấp 1 phần, nhờ vậy ngăn cỏc protein mới tổng hợp tạo thành phức hợp hay bị phõn hủy.
- Chaperonin không xác định cấu trúc cuối cùng của chuỗi polipeptit; thay vào đó chúng giữ cho chuỗi polipeptit khỏi tác động có hại của môi trờng trong tế bào khi nó cuộn xoắn tự nhiên.
Cõu 9: Sau khi biến tớnh, protein thường cú đặc điểm gỡ? Gợi ý đỏp ỏn:
Sau khi bị biến tớnh, protein thường thu được cỏc tớnh chất sau:
- Độ hũa tan giảm do làm lộ cỏc nhúm kỵ nước vốn đó chui vào bến trong phõn tử protein.
- Khả năng giữ nước giảm.
- Mất hoạt tớnh sinh học ban đầu.
- Tăng độ nhạy đối với sự tấn cụng của enzim proteaza do làm xuất hiện cỏc liờn kết peptit ứng với trung tõm hoạt động của proteaza.
- Tăng độ nhớt nội tại. - Mất khả năng kết tinh.
Cõu 10: Tại sao protein cú tớnh lưỡng cực? Tớnh chất này của protein cú ý nghĩa gỡ? Gợi ý đỏp ỏn:
Axit amin cú tớnh chất lưỡng tớnh vỡ trong axit amin cú chứa cả gốc axit (COO-) và gốc bazơ (NH2) do đó, protein cũng cú tớnh chất lưỡng tớnh.
Trong mụi trường axit, sự phõn ly của nhúm axit bị kỡm hóm, protein cú tỏc dụng như một bazơ , tớch điện + (cation) , chuyển về cực õm trong điện trường.
-Trong mụi trường bazơ , sự phõn ly của nhúm bazơ bị kỡm hóm , protein cú tỏc dụng như một acid , tớch điện – (anion) , chuyển về cực + điện trường.
Ở 1 pH nào đú mà tổng số điện tớch dương và điện tớch õm của phõn tử protein bằng khụng , phõn tử protein khụng di chuyển trong điện trường gọi là pHi của protein.
-Ở mụi trường co pH < pHi , protein là một đa cation , số điện tớch dương hơn số điện tớch õm . Ở pH> pHi , phõn tử protein thể hiện tớnh axit cho ion H+ do đú số điện tớch õm lớn hơn số điện tớch dương , protein là đa anion tớch điện õm.
- Ở trong mụi trường cú pH = pHi , protein dễ dàng kết tụ lại với nhau, do đú cú thể sử dụng tớnh chất này để xỏc định pHi của protein cũng như để kết tủa protein . Mặt khỏc do sự sai khỏc về pHi giữa cỏc protein khỏc nhau cú thể điều chỉnh pH mụi trường để tỏch cỏc protein ra khỏi hỗn hợp của chỳng .
Cõu 11: Tại sao protein biến tớnh khụng hoạt động chức năng bỡnh thường nữa? Gợi ý đỏp ỏn:
Khi bị biến tớnh, protein khụng cũn cuộn chặt như trước mà duỗi ra, kết quả là phỏ vỡ cấu hỡnh khụng gian cần thiết để thực hiện hoạt tớnh sinh học.
Cõu 12: Những phần nào của chuỗi polipeptit tham gia vào cỏc liờn kết tạo và duy trỡ cấu trỳc bậc ba?
Gợi ý đỏp ỏn:
- Cấu trúc bậc ba là hình dạng chung của chuỗi polipeptit hình thành do sự tơng tác giữa các chuỗi bên (R) của axit amin.
- Cấu trỳc bậc III được giữ vững nhờ cỏc cầu disulfua, tương tỏc VanderWaals, liờn kết hidro, lực ion.
Cõu 13: Tại sao núi hầu hết hoạt động chức năng của cơ thể sống đều phụ thuộc vào protein?
- Prụtờin là thành phần khụng thể thiếu được của mọi cơ thể sống. Cấu trỳc của prụtờin quy định chức năng sinh học của nú. Prụtờin cú cấu trỳc và chức năng sinh học đa dạng nhất trong số cỏc hợp chất hữu cơ cú trong tế bào.
– Sự đa dạng của cơ thể sống do tớnh đặc thự và tớnh đa dạng của prụtờin quyết định. – Prụtờin cú một số chức năng chớnh sau:
+ Cấu tạo nờn tế bào và cơ thể. Chỳng đúng vai trũ cốt lừi trong cấu trỳc của nhõn, của mọi bào quan, đặc biệt là hệ màng sinh học cú tớnh chọn lọc cao. Vớ dụ: cụlagen tham gia cấu tạo nờn cỏc mụ liờn kết, histon tham gia cấu trỳc nhiễm sắc thể....
+ Vận chuyển cỏc chất. Một số prụtờin cú vai trũ như những “xe tải” vận chuyển cỏc chất trong cơ thể. Vớ dụ: hờmụglụbin...
+ Bảo vệ cơ thể. Vớ dụ: cỏc khỏng thể (cú bản chất là prụtờin) cú chức năng bảo vệ cơ thể chống lại cỏc tỏc nhõn gõy bệnh...
+ Thu nhận thụng tin. Vớ dụ: cỏc thụ thể trong tế bào...
+ Xỳc tỏc cho cỏc phản ứng sinh húa. Vớ dụ: cỏc enzim (cú bản chất là prụtờin) đúng vai trũ xỳc tỏc cho cỏc phản ứng sinh học...
+ Điều hoà quỏ trỡnh trao đổi chất. Cỏc hoocmụn - phần lớn là prụtờin – cú chức năng điều hoà quỏ trỡnh trao đổi chất trong tế bào và trong cơ thể. Vớ dụ: insulin điều hoà lượng đường trong mỏu...
+ Vận động. Nhiều loại prụtờin tham gia vào chức năng vận động của tế bào và cơ thể. Vớ dụ: miozin trong cơ, cỏc prụtờin cấu tạo nờn đuụi tinh trựng...
+ Dự trữ. Lỳc thiếu hụt cacbohiđrat và lipit, tế bào cú thể phõn giải prụtờin dự trữ cung cấp năng lượng cho tế bào và cơ thể hoạt động. Vớ dụ: albumin, cazờin, prụtờin dự trữ trong cỏc hạt của cõy.
Cõu 14: Những yếu tố nào xỏc định cấu trỳc của protein? Gợi ý đỏp ỏn:
- Chuỗi polipeptit với số lượng, thành phần và trình tự axit amin xác định (theo
dạng đó nhờ các mối tơng tác quy định cấu trúc bậc II và bậc III. Sự cuộn xoắn thờng xảy ra khi protein đợc tổng hợp trong tế bào.
- Sự cuộn xoắn tạo cấu trỳc khụng gian xỏc định cũn nhờ cỏc protein chapperon. - Cấu trúc protein cũng phụ thuộc vào điều kiện vật lí và hoá học của môi trờng.
Cõu 15: So sỏnh trỡnh tự axit amin cú thể làm sỏng tỏ sự phõn li tiến húa của cỏc loài họ hàng. Theo em, tất cả cỏc protein của của cỏc loài đều cú mức độ phõn li như nhau khụng? Tại sao?
Gợi ý đỏp ỏn:
Khụng.
Cõu 16: Bậc cấu trỳc nào của protein chịu ảnh hưởng ớt nhất bởi sự phỏ hủy liờn kết hidro? Tại sao?
Gợi ý đỏp ỏn:
Cấu trỳc bậc I.
Cấu trỳc này được tạo thành nhờ cỏc liờn kết peptit giữa cỏc axit amin.
Cõu 17: Kể tờn cỏc loại liờn kết húa học tham gia duy trỡ cấu trỳc prụtờin? Gợi ý đỏp ỏn:
Cỏc loại liờn kết húa học tham gia duy trỡ cấu trỳc prụtờin:
– Liờn kết peptit hỡnh thành giữa 2 axit amin. Cỏc axit amin nối với nhau bởi liờn kết peptit hỡnh thành nờn chuỗi pụlipeptit tạo nờn cấu trỳc bậc 1 của prụtờin.
– Liờn kết hiđrụ. Cấu trỳc bậc 2 của prụtờin được giữ vững nhờ liờn kết hiđrụ giữa cỏc axit amin ở gần nhau.
– Liờn kết kỵ nước. Khi cỏc gốc kỵ nước (vớ dụ gốc -CH3 của cỏc axit amin) ở gần nhau, giữa chỳng hỡnh thành lực hỳt, đú là lực hỳt kỵ nước tạo nờn liờn kết kỵ nước. – Liờn kết đisunphua (-S-S-), gúp phần hỡnh thành cấu trỳc bậc 3 và bậc 4 của prụtờin.
Cõu 18: Tơ nhện, sừng trõu, túc, thịt gà và thịt bũ đều được cấu tạo từ prụtờin nhưng chỳng khỏc nhau về nhiều đặc tớnh, em hóy cho biết sự khỏc nhau đú là do đõu? Gợi ý đỏp ỏn:
– Trỡnh tự cỏc axit amin trờn chuỗi pụlipeptit sẽ thể hiện tương tỏc giữa cỏc phần trong chuỗi pụlipeptit, từ đú tạo nờn hỡnh dạng khụng gian 3 chiều của prụtờin và do đú quyết
định tớnh chất cũng như vai trũ của prụtờin. Sự sai lệch trong trỡnh tự sắp xếp của cỏc axit amin cú thể dẫn đến sự biến đổi cấu trỳc và tớnh chất của prụtờin. Số lượng, thành phần và trỡnh tự sắp xếp của cỏc axit amin trờn chuỗi pụlipeptit quyết định tớnh đa dạng và đặc thự của prụtờin.
– Tơ nhện, sừng trõu, túc, thịt gà và thịt bũ mặc dự đều được cấu tạo từ prụtờin nhưng chỳng khỏc nhau về nhiều đặc tớnh là do chỳng khỏc nhau về số lượng, thành phần và trỡnh tự sắp xếp của cỏc axit amin.
Cõu 19: Tại sao nuclesụm được cấu tạo từ prụtờin histụn chủ yếu chứ khụng phải