3. í nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
2.3.Phương phỏp nghiờn cứu
Cỏc thớ nghiệm được tiến hành theo sơ đồ sau:
- Điều kiện thớ nghiệm: Quỏ trỡnh nuụi cấy invitro được tiến hành trong mụi trường nhõn tạo, vụ trựng, cú thể thay đổi cỏc điều kiện về nhiệt độ, ẩm độ, điều kiện chiếu sỏng. Ánh sỏng trong phũng nuụi cấy là ỏnh sỏng đốn neon với cường độ chiếu sỏng: 2000 – 3000 lux, thời gian chiếu sỏng: 16h sỏng/8h tối, nhiệt độ phũng cấy: 20 – 30oC, độ ẩm: 70 – 74%.
• Giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu
- Chọn mẫu: Cõy giống được trồng trờn cỏt vụ trựng. Chọn những cõy cú thõn khỏe mạnh, khụng sõu bệnh, cú nhiều chồi bờn. Cắt thành những đoạn thõn dài 2 – 3cm (gồm cả chồi nỏch).
Giai đo n t o v t li u kh i ạ ạ ậ ệ ở đ uầ
Mẫu: đỉnh sinh trưởng, cỏc chồi nỏch
Thớ nghiệm: TN1, TN 2
Giai đo n t o tỏi sinh ạ ạ ch iồ
Mẫu: lỏt cắt mẫu sạch bệnh Thớ nghiệm: TN3, TN 4
Giai đoạn nhõn nhanh cụm chồi
Mẫu: chồi in vitro
Thớ nghiệm: TN5, TN6
Giai đoạn tạo cõy hoàn chỉnh
(giai đoạn ra rễ) Mẫu: chồi in vitro
Thớ nghiệm: TN7, TN8
Giai đoạn huấn luyện thớch nghi
Mẫu: cõy con in vitro
Thớ nghiệm: TN9
- Xử lý mẫu: Rửa sạch mẫu cấy bằng xà phũng dưới vũi nước chảy 3 lần trong 10 – 15 phỳt. Rửa lại bằng nước cất vụ trựng. Lắc cồn 70o trong 1 phỳt. Sau đú khử trựng bằng húa chất khử trựng.
- Húa chất khử trựng: oxy già H2O2, thủy ngõn clorua HgCl2.
- Cỏc cụng thức thớ nghiệm được bố trớ theo kiểu ngẫu nhiờn hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, tiến hành trờn 10 bỡnh, mỗi bỡnh cấy 3 mẫu.
- Thời gian: 4 tuần
- Cỏc chỉ tiờu theo dừi: Tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu chết, tỷ lệ mẫu sống sạch bệnh.
- Cỏc thớ nghiệm tiến hành:
Thớ nghiệm 1: Nghiờn cứu ảnh hưởng của chất khử trựng oxy già và
thời gian đến tỷ lệ sống của mẫu cấy
CT1: 10% H2O2 + 10 phỳt CT2: 10% H2O2 + 20 phỳt CT3: 10% H2O2 + 30 phỳt CT4: 10% H2O2 + 40 phỳt
Thớ nghiệm 2: Nghiờn cứu ảnh hưởng của chất khử trựng HgCl2 và thời gian đến tỷ lệ sống của mẫu cấy
CT1: 0,1% HgCl2 + 5 phỳt CT2: 0,1% HgCl2 + 10 phỳt CT3: 0,1% HgCl2 + 15 phỳt CT4: 0,1% HgCl2 + 20 phỳt - Cỏc chỉ tiờu theo dừi:
∑ mẫu nhiễm
+ Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = x 100 ∑ mẫu nuụi cấy
∑ mẫu chết
+ Tỷ lệ mẫu chết (%) = x 100 ∑ mẫu nuụi cấy
∑ mẫu sống sạch bệnh
+ Tỷ lệ mẫu sống sạch bệnh (%) = x 100 ∑ mẫu nuụi cấy
• Giai đoạn tỏi sinh chồi
- Mẫu: cỏc mẫu sạch bệnh từ TN1, TN2
- Mụi trường: Cỏc mẫu sạch bệnh được cấy chuyển vào mụi trường tỏi sinh chồi là mụi trường MS bổ sung Saccarose 3%, Agar 0,8%, pH = 5,7. Cỏc chất điều tiết sinh trưởng là GA3 (Gibberellic acid) và nước dừa.
- Thời gian: 4 tuần
- Cỏc cụng thức thớ nghiệm tiến hành trờn 10 bỡnh, mỗi bỡnh cấy 1 mẫu, mỗi cụng thức lặp lại 3 lần.
- Cỏc thớ nghiệm tiến hành:
Thớ nghiệm 3: Nghiờn cứu ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến khả năng tỏi sinh chồi
CT1: MT nền + 0 mg/l GA3
CT2: MT nền + 0,5 mg/l GA3
CT3: MT nền + 1,0 mg/l GA3
CT4: MT nền + 1,5 mg/l GA3
CT5: MT nền + 2,0 mg/l GA3
Thớ nghiệm 4: Nghiờn cứu ảnh hưởng tổng hợp của nước dừa và GA3
CT1: MT nền + 0 % ND CT2: MT nền + 50 % ND CT3: MT nền + 100 % ND CT4: MT nền + 150 % ND CT5: MT nền + 200 % ND - Cỏc chỉ tiờu theo dừi:
Số chồi tạo thành
+ Hệ số nhõn chồi =
Số chồi ban đầu + Số mẫu tạo thành
• Giai đoạn nhõn nhanh cụm chồi
- Mẫu: cỏc chồi sinh trưởng bỡnh thường, cú đủ thõn và lỏ, khụng bị dị dạng.
- Mụi trường: MS, bổ sung Saccarose 3%, Agar 0,8%, pH = 5,7 và nồng độ GA3 tối ưu khảo sỏt ở thớ nghiệm 3 và bổ sung Kinetine, IAA (Indol acetic acid).
- Cỏc cụng thức thớ nghiệm được bố trớ ngẫu nhiờn hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, được tiến hành trờn 10 bỡnh, mỗi bỡnh cấy 1 chồi.
- Cỏc chỉ tiờu theo dừi: hệ số nhõn chồi, chiều dài chồi, số lỏ/chồi, chất lượng chồi.
- Cỏc thớ nghiệm tiến hành:
Thớ nghiệm 5: Nghiờn cứu ảnh hưởng của Kinetine đến sự sinh trưởng
và hệ số nhõn chồi khoai lang
CT1: MT nền + 0 mg/l Kinetine CT2: MT nền + 2 mg/l Kinetine CT3: MT nền + 4 mg/l Kinetine CT4: MT nền + 6 mg/l Kinetine
CT5: MT nền + 8 mg/l Kinetine
Thớ nghiệm 6: Nghiờn cứu ảnh hưởng của IAA đến sự sinh trưởng và
hệ số nhõn chồi khoai lang
CT1: MT nền + 0,0 mg/l IAA CT2: MT nền + 0,5 mg/l IAA CT3: MT nền + 1,0 mg/l IAA CT4: MT nền + 1,5 mg/l IAA CT5: MT nền + 2,0 mg/l IAA - Cỏc chỉ tiờu theo dừi:
∑ số chồi tạo thành
+ Hệ số nhõn chồi = ∑ số chồi cấy
+ Chiều dài chồi (cm)
+ Số lỏ/chồi (lỏ/chồi) hoặc số mắt ngủ/chồi
+ Chất lượng chồi: Chồi tốt: chồi mập, lỏ xanh thẫm Chồi khỏ: chồi bỡnh thường, lỏ xanh Chồi trung bỡnh: Chồi hơi gầy, lỏ xanh.
Chồi kộm: Chồi gầy, lỏ xanh nhạt, hoặc chồi bị dị dạng • Giai đoạn tạo cõy hoàn chỉnh (giai đoạn ra rễ)
Thớ nghiệm 7: Nghiờn cứu ảnh hưởng của nồng độ α - NAA (α-
Naphlene acetic acid) đến hiệu quả ra rễ của cõy khoai lang in vitro
- Mẫu nuụi cấy: Chồi cõy khoai lang khỏe mạnh cú từ 3 - 5 lỏ thu được từ quỏ trỡnh nhõn nhanh.
- Mụi trường nền (MT nền): MS (Murashige&Skoog, 1962) bổ sung 3% saccarose, 0,8% agar, pH = 5,7, 10% nước dừa. Chất điều tiết sinh trưởng sử dụng là α - NAA và than hoạt tớnh.
nhắc lại, tiến hành trờn 10 bỡnh, mỗi bỡnh cấy 3 cõy. - Cỏc cụng thức thớ nghiệm: CT1: MT nền + 0,0 mg α - NAA/l CT2: MT nền + 0,3 mg α - NAA/l CT3: MT nền + 0,5 mg α - NAA/l CT4: MT nền + 0,7 mg α - NAA/l CT5: MT nền + 1,0 mg α - NAA/l
Thớ nghiệm 8: Nghiờn cứu ảnh hưởng tổng hợp của α - NAA và than
hoạt tớnh đến hiệu quả ra rễ của cõy khoai lang invtro
- Mụi trường: MS + Saccarose 3% + Agar 0,8% + pH = 5,7 + α – NAA tối ưu khảo sỏt ở thớ nghiệm 7 và bổ sung than hoạt tớnh
CT1: MT nền + 0,0 g/l than hoạt tớnh CT2: MT nền + 0,5 g/l than hoạt tớnh CT3: MT nền + 1,0 g/l than hoạt tớnh CT4: MT nền + 1,5 g/l than hoạt tớnh CT5: MT nền + 2,0 g/l than hoạt tớnh - Cỏc chỉ tiờu theo dừi:
∑ số chồi bật rễ (chồi)
+ Tỷ lệ chồi ra rễ (%) = x 100 ∑ số chồi cấy (chồi)
∑ số rễ ra
+ Số rễ trung bỡnh/cõy (rễ) = ∑ số cõy tạo thành
+ Chiều dài rễ/cõy (cm): tớnh từ cổ rễ đến chúp rễ • Giai đoạn huấn luyện thớch nghi
Thớ nghiệm 9: Nghiờn cứu ảnh hưởng của loại giỏ thể đến sức sống của
cõy ex vitro trong điều kiện huấn luyện thớch nghi - Vật liệu: cõy khoai lang con sau nuụi cấy mụ.
- Phương phỏp ra cõy: trước khi đưa cõy con ra trồng ngoài tự nhiờn, người ta thường tiến hành huấn luyện để cõy quen dần với điều kiện mụi trường bờn ngoài. Thời gian này cú thể kộo dài khoảng 4 tuần và tăng dần cường độ vào những ngày cuối để tăng nhanh khả năng thớch nghi của cõy. Cõy con trong bỡnh cấy được rửa sạch những phần thạch hoặc đường bỏm vào vỡ chỳng thường là mụi trường thớch hợp cho nấm bệnh phỏt triển hoặc cụn trựng tấn cụng. Tiếp đú ngõm cõy vào nước để trỏnh hiện tượng mất nước, rồi đem trồng vào giỏ thể.
- Chế độ chăm súc cõy con trong giỏ thể: trong thời gian cõy ở trong giỏ thể, ngày tiến hành tưới phun 2 lần bằng nước sạch (giữ ẩm độ giỏ thể khoảng 75 - 85%), nguồn khoỏng bổ sung là dung dịch dinh dưỡng Knop phun lờn lỏ.
- Cỏc cụng thức được bố trớ theo kiểu ngẫu nhiờn hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 60 mẫu/CT.
- Cỏc cụng thức của thớ nghiệm: CT 1: Cỏt
CT 2: Đất thịt
CT 3: 1 cỏt + 1 đất thịt - Cỏc chỉ tiờu theo dừi: theo dừi 10 ngày/lần
∑ số cõy sống (cõy)
+ Tỷ lệ cõy sống (%) = x 100 ∑ số cõy ra ngụi (cõy)
+ Biến động chiều cao cõy = Chiều cao về sau – Chiều cao ban đầu + Số lỏ mới/cõy
+ Hỡnh thỏi cõy