1. 6 Ảnh hưởng của giống tiền lên men trong lên men acid
2.2.4. Chọn chủng có hoạt tính kháng sinh cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên
nhiên
Tiến hành theo phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên để chọn chủng có hoạt tính tốt nhất từ chủng gốc 10.19 để tiến hành nghiên cứu tiếp theo. Kết quả được trình bày ở bảng 5.
Bảng 5: Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên
Ký hiệu biến chủng Kết quả Ký hiệu biến chủng Kết quả
sta Shi sta Shi
D(mm) s D(mm) s D(mm) s D(mm) s 1 14,90 0,69 14,95 0,30 12 10,34 0,52 13,64 0,65 2 13,09 0,62 15,67 0,26 13 10,92 0,66 15,62 0,96 3 16,30 0,43 16,72 0,14 14 11,67 0,58 15,06 0,32 4 13,68 0,76 15,11 0,76 15 17,06 0,22 19,89 0,15 5 11,70 0,14 13,03 0,67 16 12,51 0,37 14,56 0,47 6 14,12 0,75 14,68 0,25 17 16,45 0,32 18,69 0,18 7 15,94 0,42 16,92 0,56 18 11,10 0,71 13,6 0,41 8 11,78 0,15 13,43 0,77 19 17,40 0,21 20,42 0,42 9 14,30 0,38 14,63 0,89 20 9,05 0,78 12,71 0,68 10 13,76 0,26 16,22 0,85 21 14,80 0,42 16,04 0,69 11 11,92 0,35 15,26 0,23 22 10,25 0,27 14,10 0,67
Nhận xét:
Nhìn vào bảng 5, nhận thấy chủng 15, 17, 19 có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao. Chọn chủng 15 tiến hành đột biến và lên men chìm để lựa chọn môi trường lên men tối ưu nhất.
2.2.5. Kết quả đột biến bằng ánh sáng u v - Độ sống sót sau đột biến : 0,06%
- Kết quả sàng lọc sau đột biến được trình bày ở bảng 6 và hình 3 (phần phụ lục).
Bảng 6: Các biến chủng có % biến đổi hoạt tính (+) cao sau đột biến
Biến chủng Shi % biến đổi
hoạt tính
sta % biến đổi
hoạt tính D(mm) s D(mm) s 1 5 . 8 20,38 0,85 131,65 15,52 0,22 115,74 1 5 . 9 18,50 0,63 119,98 15,96 0,90 121,36 15 . 1 0 21,05 0,23 135,98 15,70 0,14 119,39 15. 11 20,26 0,98 130,87 15,41 0,97 117,18 15.13 19,90 0,11 128,55 16,36 0,24 124,41 15.18 23,70 0,53 153,10 17,26 065 131,25 15 . 2 0 22,74 0,17 146,89 17,46 0,77 132,77 1 5 . 2 2 24,73 0,60 159,75 17,60 0,65 133,84 15 . 2 3 23,26 0,49 150,25 17,36 0,91 132,01 1 5 . 2 6 21,90 0,61 141,47 15,93 0,75 121,14 Chứng 15,48 0,67 13,15 0,85 Nhận xét:
- Như vậy sau đột biến khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của biến chủng 15 tăng lên rõ rệt.
- Biến chủng 15. 22 có % biến đổi hoạt tính dương cao nhất cả đối với Sh. Flexleri và St. aureus.
2.2.6. Kết quả lựa chọn môi trường lên men
Tiến hành lên men chìm biến chủng 15 trên máy lắc để lựa chọn môi trường lên men tốt nhất, kết quả được giói thiệu ở bảng 7.
Bảng 7. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh khi lên men chìm của biến chủng 15
Môi trường lên men sta Shi
D (min) s D (mm) s MT1 dd 12,33 0,05 15,40 0,34 MT2 dd 12,93 0,32 14,03 0,59 MTỔdd 12,06 0,92 14,90 0,31 MT5 dd 19,16 0,46 24,16 0,25 Nhận xét:
Nhìn vào bảng 7 nhận thấy MT5 dd là môi trường lên men chìm tốt nhất. Như vậy chủng Streptomyces 10.19 cỏ khả năng sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất khi lên men bề mặt và lên men chìm ở MT5, MT5 dd. Đó là những môi trường giàu nguồn carbon như đường sacaroza và nguồn nitơ như: Bột đậu tương. Chọn MT5 dd làm môi trường lên men chìm cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.2.7. Lựa chọn biến chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh caonhất khi lên men chìm nhất khi lên men chìm
Dùng môi trường lên men là MT5 dd để tiến hành lên men chìm cho 3 biến chủng 15, 17, 19. Kết quả trình bày ở bảng 8.
Bảng 8. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của 3 biến chủng 1 5 ,1 7 ,1 9 sau khỉ lên men chìm. Biến chủng Slta SIli D (mm) s D (mm) s 15 19,82 0,23 24,14 0,15 17 11,22 0,67 14,02 0,82 19 10,68 0,23 • 12,23 0,52 Nhận xét:
Nhìn vào bảng 8 nhận thấy biến chủng 15 có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao nhất. Trong khi đó biến chủng 19 khi lên men bề mặt sinh tổng hợp kháng sinh cao nhưng khi lên men chìm lại cho giá trị thấp nhất. Giữ lại dịch lọc của biến chủng 15 để tiến hành nghiên cứu tiếp theo.
2.2.8. Ảnh hưởng của pH đến độ bền vững của kháng sinh
Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp giếng thạch sau khi thay đổi pH: 1 ngày và 5 ngày. Kết quả được trình bày ở bảng 9.
_ ọ
Bảng 9. Anh hưởng của pH đến độ bên vững của kháng sinh
pH
Đường kính vòng vô khuẩn (mm)
Sau 1 ngày Sau 5 ngày
sta Shi sta Shi
1 0,00 0,00 0,00 0,00 2 0,00 0,00 0,00 0,00 3 8,81 12,43 0,00 0,00 4 13,98 16,57 10,68 12,84 5 14,13 17,15 12,34 14,96 6 12,53 13,07 10,23 1 2 , 7 5 7 11,40 13,30 12,43 12,69 8 6,68 9,10 0 , 0 0 0,00 9 0,00 0,00 0,00 0,00 10 0,00 0,00 0,00 0,00 11 0,00 0,00 0 , 0 0 0 , 0 0 1 2 0 , 0 0 0 , 0 0 0 , 0 0 - 0 , 0 0 Nhận xét:
- Kháng sinh do chủng Streptomyces 10.19 tổng hợp bền vững trong một khoảng pH hẹp.
- Sau 1 ngày, pH = 1,2, pH 9 —> 12 mất hoạt tính. - Sau 5 ngày pH = 3, 8 bắt đầu mất hoạt tính.
- Kháng sinh bền vững nhất ở pH = 5. Giữ dịch lên men ở pH = 5 để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
2.2.9. Lựa chọn dung môi chiết thích hợp của dịch lên men
Sử dụng các dung môi chiết khác nhau. Tiến hành chiết 1 lần pH = 4, 7 ,10. Đánh giá hoạt tính kháng sinh ở pha dung môi hữu cơ (dmhc), pha dịch lọc (N). Kết quả trình bày ở bảng 10a, 10b.
Bảng 10a. Hoạt tính kháng sình sau khi chiết bằng dung môi hữu cơ đối với St.aureus
pH
Đường kính vòng vô khuẩn (mm)
Butyl acetat Cloroform Ethyl acetat
N dmhc N dmhc N dmhc
4 0,00 12,68 8,90 0,00 9,13 0,00
7 11,83 0,00 9,30 0,00 8,36 0,00
10 11,45 0,00 7,13 0,00 8,96 0,00
Bảng 10b. Hoạt tính kháng sinh sau khi chiết bằng dung môi hữu cơ đối với Sh.flexneri
pH
Đường kính vòng vô khuẩn (mm)
Butyl acetat Cloroform Ethyl acetat
N dmhc N dmhc N dmhc
4 0,00 13,36 10,77 0,00 9,23 0,00
7 12,35 0,00 9,90 0,00 9,40 0,00
Nhận xét:
- Cloroform, Ethyl acetat không chiết được kháng sinh từ dịch lọc ở tất cả các pH.
- Butyl acetat chiết được kháng sinh từ dịch lọc ở pH = 4.
Như vậy kháng sinh là 1 chất phân cực và chỉ có thể chiết được bằng dung môi phân cực ở pH thấp.
2.2.10. Thử hoạt tính kháng sinh trong sinh khối
Nghiền lượng sinh khối với khối lượng lg, tỷ lệ dung môi 5ml, ngâm sinh khối trong butyl acetat. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khoanh giấy lọc. Kết quả được trình bày ở bảng 11.
Bảng 11. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh trong sinh khối
Mẫu thử sta Shi
D(inm) s D(mm) s
Dịch chiết sinh khối
7,50 0,15 10,97 0,45
Nhận xét:
- Chủng streptomyces 10.19 có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cả ngoại bào lẫn nội bào. Tuy nhiên phần kháng sinh nội bào là rất nhỏ so với kháng sinh ở ngoại bào.
2.2.11. Hoạt tính chống nấm của chủng Streptomyces 10.19
Đánh giá hoạt tính chống nấm bằng phương pháp giếng thạch kết quả được trình bày ở bảng 12.
Bảng 12. Kết quả thử hoạt tính chống nấm của chủng streptomyces 10.19 Mẫu thử Cd As D(mm) s D(rnm) s Dịch lọc lên men 16,57 0,68 0,00 0,00 Nhận xét:
- Như vậy ngoài hoạt tính kháng khuẩn, chủng Streptomỵces 10.19 còn có hoạt tính chống nấm, đặc biệt là nấm Candida albicans, không có tác dụng với nấm
Aspeginus niger
2.2.12. Kết quả sắc ký lớp mỏng
Dịch chiết butyl acetat ở được sử dụng để chấm sắc ký lớp mỏng. Sau khi sử dụng 25 hệ dung môi chọn được 5 hệ tách tốt, có thành phần như sau:
Hệ 1 : Butanol: E thanol: dimethylformamit : 3: 1 : 1 Hệ 2 : Butyl acetat: methanol: aceton : 16 : 4 : 2 Hệ 3 : Cloroform: methanol: amoniac 25% : 8 : 2 :0,05 Hệ 4 : Ethyl acetat: Ethanol: acid acetic : 5 : 3 :0,5 Hệ 5 : Dicloromethan: aceton : 12 : 8 Kết quả được giói thiệu ở bảng 13 và hình 4 (phần phụ lục).
Bảngl3 . Kết quả sắc ký lớp mỏng Hệ dung môi Rf u y v s v Hệ 1 0,83 0,83 Hệ 2 0,76 0,76 Hệ 3 0,91 0,91 Hệ 4 0,52 0,52 Hệ 5 0,66 0,66
Nhận x é t : Kết quả sắc ký phát hiện khi soi đèn tử ngoại và phương pháp
hiện màu hoá học cho 1 vết tương đương có màu vàng. Như vậy sơ bộ kết luận, trong dịch chiết có 1 thành phần chất kháng sinh.
PHẦN 3
KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 3.1. Kết luận:
- Qua kết quả thực nghiệm, lần đầu tiên đã xác định rằng chủng Streptomyces
10.19 có đặc điểm giống như Streptomyces tendae. Như vậy sơ bộ kết luận tên khoa
học của stretomyces 10.19 là Streptomyces tendae.
- MT5 là môi trường Streptomyces 10.19 có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất.
- Sau khi cải tạo giống bằng phương pháp đột biến, hoạt tính kháng sinh tăng lên rõ rệt.
- Trong số dung môi khảo sát thì butyl acetat là dung môi chiết tốt nhất khi pH = 4.
- Streptomyces 10.19 vừa có khả năng chống vi khuẩn (đặc biệt đối với vi
khuẩn G (-)), vừa có khả năng chống nấm (đối với Candida albicans).
- Đã chọn được 5 hệ dung môi tốt để chạy sắc ký, kết quả dựa trên phương pháp soi đèn tử ngoại và hiện hình v s v , chưa phát hiện được bằng phương pháp hiện màu hoá học. Chỉ phát hiện được 1 vết kháng sinh.
3.2. Đề xuất
- Tiếp tục nghiên cứu để xác định chính xác tên khoa học của chủng
Streptomyces 10.19.
- Tiếp tục nghiên cứu quy trình lên men đảm bảo tối ưu hoá, tăng khả năng sinh tổng hợp kháng sinh.
- Cần tiếp tục nghiên cứu quy trình chiết tách tinh chế kháng sinh trong dịch chiết Butyl acetat tại pH = 4 và xác định cấu trúc hoá học của hoạt chất này.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. Kiều Hữu Ảnh (1999), Giáo trình v s v học công nghiệp , NXB khoa học và kỹ thuật.
[2]. Bộ y tê (Hà Nội, 2002), Dược điển Việt Nam III.
[3]. Nguyễn Lân Dũng (1975), Vi sinh vật học, NXB Đại học và Trung học chuyên nghiệp
[4]. Kiều Khắc Đôn, Nguyễn Lệ Phi (Hà Nội, 1999), Vi sinh vật học, Trường Đại học Dược Hà Nội.
[5]. Đỗ Thu Hà (2002), Định loại chủng xạ khuẩn Streptomyces ĐN-05 sinh chất kháng sinh có hoạt phổ rộng được phân lập từ đất tỉnh Quảng Nam, Tạp chí
Sinh học, tập 24, số 1, trang 59 - 63.
[6]. Phạm Gia Huệ, Trần Tử An (Hà Nội, 1998), Hoá phân tích II, Trường Đại học Dược Hà Nội.
[7]. Từ Minh Koóng (1998), Bài giảng vê' kỹ thuật sản xuất thuốc kháng sinh,
Trường Đại học Dược Hà Nội.
[8], Lương Đức Phẩm (1998), Công nghệ v s v , NXB Nông nghiệp.
[9]. Hồ Viết Quý (Hà Nội, 2000), Chiết tách, phân chia, xác định các chất bằng
dung môi hữu cơ, tập 1, NXB khoa học và kỹ thuật.
[10]. Trần Thị Thanh (2001), Công nghệ Vi sinh, NXB khoa học và kỹ thuật. [11]. Cao Văn Thu (1998), Bài giảng kháng sinh và Vitamin.
[12]. André A. Neves, Luis M. Vieira and Jose' C.Menezes (2001), “Effect of Preculture Variability on Clavulanic Acid Fermentation”, Biotechnology and
Bioengineering, Vol. 72, No. 6, p. 628 - 632.
[13]. Chang Joon Kim, Yong Keun Chang, Gie - Taek Chun, Yeon Ho Jeong and Sang Jong Lee (2001), “Continuous Culture of Immobilized Streptomyces Cell for Kasugamycin Production”, Biotechnology
[14]. E. B Shirling & D. Gottlieb (1966), “Methods for characterozation of Streptomyces Species”, Int. J.Syst. Bacteriol, Vol. 16, No. 3, p. 313 - 340. [15]. E. B Shirling & D. Gottlieb (1968), “Cooperative description of type culture of
streptomyces”, Int. J. Syst. Bacteriol, Vol. 18, No. 2, p. 69-189.
[16]. Johanes A. Roubos, Preben Krabben, Wim, T.A. M. Delaat, Robert Babuska and Joseph J.Heijnen (2002). “Clavulanic Acid Degradation in Streptomyces clavuligerus Fed - Batch Cultivations”, Biotechnology Pregress, vol. 18, No. 3, P. 451 - 457.
PHỤ LỤC
í t *
~ H ình 1: H ình dạng chuôi bào tử (độ phóng đại 7 5UU lẩn)
bơo^nv
H ình 3: K ết quả thử h oạt tính kháng sinh sau khi đột biến bằng ánh sáng u v .