4.1. Phương pháp phân lập và giám ựịnh vi khuẩn:
Các phương pháp nuôi cấy và giám ựịnh vi khuẩn ựược thực hiện theo quy trình nghiên cứu thường quy của Bộ môn Vi trùng, Viện Thú Y.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 33 Lactose - Lactose +
Hinh 2.1. Quy trình phân lập vi khuẩn ựường ruột
(Bộ môn Vi trùng Ờ Viện Thú Y)
4.2. Phương pháp xác ựịnh serotyp của vi khuẩn E. Coli và Salmonella phân lập ựược
Xác ựịnh serotyp của các chủng E. Coli, Salmonella phân lập ựược bằng các phản ứng ngưng kết trên phiến kắnh và trong ống nghiệm bằng kháng huyết thanh chuẩn của Nhật Bản ựối với kháng nguyên thân O và kháng nguyên lông H. Trên cơ
Oxidase âm tắnh E. coli K. pneumoniae Enterobacter aerogenes Salmonella Edwardsiella Proteus Thạch DHL Thạch BG Nước thịt PBW Thạch DHL Thạch BG 37oC/24- 48h/hiếu khắ 37oC/24- 48h/hiếu Salmonella R/Y/H2S Mọc trên thạch MacConkey KL ựen trên DHL KL ựỏ trên BG Enterobacteriaceae TSI Lên men Lên men Lên men
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 34 sở kết quả thu ựược, tiến hành ựịnh danh chủng vi khuẩn kiểm tra dựa vào bảng phân loại Kauffmann và White (Popoff, 2001).
4.3. Phương pháp xác ựịnh các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn phân lập ựượcbằng kỹ thuật PCR
+ Xác ựịnh các yếu tố gây bệnh (ựộc tố và yếu tố bám dắnh) của vi khuẩn E. coli bằng phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction).
Bảng 2.1. Các cặp primer do công ty fermentis cung cấp ựể xác ựịnh các yếu tố ựộc lực và bám dắnh của vi khuẩn E. coli
Yếu tố gây bệnh Mã primer Trình tự DNA Kắch thước (bp) STa-1 5Ỗ TCT TTC CCC TCT TTT AGT CAG 3Ỗ
STa
STa-2 5Ỗ ACA GGC AGG ATT ACA ACA AAG 3Ỗ
166
STb-1 5Ỗ ATC GCA TTT CTT CTT GCA TC 3Ỗ STb
STb-2 5Ỗ GGG CGC CAA AGC ATG CTC C 3Ỗ
172
LTa-1 5Ỗ GGC GAC AGA TTA TAC CGT GC 3Ỗ LT
LTa-2 5Ỗ CCG AAT TCT GTT ATA TAT GTC 3Ỗ
696
F4-Fw 5Ỗ GGT GAT TTC AAT GGT TCG 3Ỗ F4
F4-Rv 5Ỗ ATT GCT ACG TTC AGC GGA GCG 3Ỗ
601
FedA-1 5Ỗ GTG AAA AGA CTA GTG TTT ATT TC 3Ỗ F18
FedA-2 5Ỗ CTT GTA AGT AAC CGC GTA AGC 3Ỗ
510
VT2-Fw 5Ỗ CTT GGG TAT CCT ATT CCC GG 3Ỗ VT2e
VT2-Rv 5Ỗ CTG CTG TGA CAG TGA CAA AAC GC 3Ỗ
482
+ Phương pháp xác ựịnh một số yếu tố gây bệnh (ựộc tố ựường ruột (Stn), yếu tố xâm nhập (InvA) và gen kháng kháng sinh DT104) của các chủng
Salmonella bằng phương pháp PCR dựa trên các nghiên cứu ựã ựược công bố của các tác giả: Suzuki và cs, 1994; Pritchett và cs, 200]; Saitoh và cs, 2005; Cloeckaert và cs, 2006; Cortez và cs, 2006; Skyberg và cs, 2006.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 35
Bảng 2.2. Trình tự các cặp mồi và kắch cỡ sản phẩm dùng ựể xác ựịnh một số yếu tố gây bệnh của các chủng Salmonella phân lập ựược
Ký hiệu mồi Trình tự mồi Sản phẩm (bp) Stn- F Stn- R 5Ỗ- CTTTGGTCGTAAATAAGGCG- 3Ỗ 5Ỗ- TGCCCAAAGCAGAGAGATTC- 3Ỗ 259 InvA- F InvA- R 5Ỗ- TTGTTACGGCTATTTTGACCA- 3Ỗ 5Ỗ- CTGACTGCTACCTTGCTGATG- 3Ỗ 521
4.4. Phương pháp kiểm tra ựộc lực của vi khuẩn phân lập ựược trên chuột bạch: bằng phương pháp tiêm truyền.
+ Phương pháp xác ựịnh ựộc lực của vi khuẩn E. coli, Salmonella trên chuột nhắt trắng
+ Xác ựịnh ựộc lực của các chủng vi khuẩn E. coli, Salmonella nghiên cứu trên chuột nhắt trắng theo phương pháp của Carter (1995).
+ Phương pháp gây bệnh thực nghiệm trên lợn
* Chuẩn bị:
- động vật thắ nghiệm: Lợn 35 ngày tuổi khỏe mạnh, chưa ựược tiêm vacxin phòng bệnh phù ựầu, tiêu chảy, bại huyết có thành phần kháng nguyên E. coli, Salmonella.
- Chủng vi khuẩn E. coli, Salmonella ựược nuôi cấy trong môi trường nước thịt, bồi dưỡng ở 37oC trong 24 giờ. Xác ựịnh số lượng vi khuẩn có trong 1 ml canh trùng bằng phương pháp ựếm số lượng khuẩn lạc trên thạch.
* Tiến hành:
- Mỗi lợn ựược tiêm canh trùng vào thực quản và xoang phúc mạc. - Theo dõi thời gian chết, mổ khám bệnh tắch và phân lập lại vi khuẩn
4.5. Phương pháp chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh tiêu chảy, phù ựầu và bại huyết cho lợn
+ Lựa chọn chủng vi khuẩn E. coli, Salmonella ựể chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh tiêu chảy, phù ựầu và bại huyết cho lợn
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 36 Tiến hành lựa chọn các chủng vi khuẩn E. coli, Salmonella thuộc serotype ựặc trưng, mang ựầy ựủ các yếu tố gây bệnh và có ựộc lực cao ựể sử dụng làm giống chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh phù ựầu, tiêu chảy, bại huyết cho lợn.
+ Phương pháp chế tạo thử nghiệm vacxin
Vacxin ựược chế tạo thử nghiệm theo quy trình sản xuất vacxin vô hoạt toàn khuẩn có bổ trợ keo phèn, bằng phương pháp lên men sục khắ tại Bộ môn Vi trùng- Viện Thú y. Quy trình tóm tắt ựược trình bày ở hình 3.2.
+ Kiểm tra vô trùng, an toàn và hiệu lực của vacxin chế tạo ựược
Do hiện nay chưa có quy trình kiểm nghiệm riêng cho vacxin phù ựầu, tiêu chảy, bại huyết vô hoạt có bổ trợ keo phèn, nên vacxin sau khi chế tạo ựược tiến hành kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn 10 TCN 160-92 và 10 TCN 161-92 (2003) ựối với vacxin vô hoạt có bổ trợ keo phèn (Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y trung ương I).
- Phương pháp phân tắch số liệu
+ Tắnh liều LD50 theo Reed & Muench (1938).
+ Số liệu thu ựược trong các thắ nghiệm ựược xử lý theo phương pháp thống kê sinh vật học với sự hỗ trợ của phần mềm Excel.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
37 Kiểm tra thuần khiết
đếm số và kiểm tra thuần khiết
Kiểm tra vô trùng Giống vi khuẩn
Thạch máu
Giống nhỏ
Giống sản xuất
Lên men sục khắ
Vô hoạt bằng formol 0,5%
Bổ sung keo phèn 20%
Ra chai, dán nhãn
Thành phẩm
Kiểm tra an toàn
Kiểm tra vô trùng Kiểm tra hiệu lực
Kiểm tra thuần khiết
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
38
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Kết quả thu thập các chủng vi khuẩn E. coli, Salmonella phân lập ựược dùng cho nghiên cứu
để phục vụ cho nghiên cứu, chúng tôi ựã tiến hành lựa chọn các chủng vi khuẩn E. coli, Salmonella phân lập ựược từ lợn tại một số tỉnh phắa Bắc Việt Nam, các chủng này hiện ựang ựược lưu giữ tại Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y. Kết quả thu thập và lựa chọn các chủng vi khuẩn dùng cho nghiên cứu ựược trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1 Kết quả lựa chọn các chủng vi khuẩn dùng cho nghiên cứu
Chủng vi khuẩn Số chủng chọn địa phương phân lập
E. coli 50
Salmonella 50
Hà Nội, Hải Phòng, Thái Bình, Thái Nguyên, Bắc Giang
Các chủng ựược chọn gồm 50 chủng E. coli, 50 chủng Salmonella ựược phân lập từ lợn mắc bệnh phù ựầu, tiêu chảy, bại huyết tại một số tỉnh phắa Bắc Việt Nam như: Hà Nội, Hải Phòng, Thái Bình, Thái Nguyên, Bắc Giang. Trong khuôn khổ nghiên cứu, các chủng vi khuẩn này sẽ ựược giám ựịnh lại về các ựặc tắnh hình thái, tắnh chất nuôi cấy, ựặc tắnh sinh vật hóa học, xác ựịnh serotype, xác ựịnh ựộc lực và các yếu tố gây bệnh ựiển hình. Từ kết quả thu ựược sẽ tiến hành lựa chọn một số chủng vi khuẩn E. coli, Salmonella ựại diện, có các yếu tố gây bệnh ựiển hình, có ựộc lực cao và thuộc các serotype thường gặp gây bệnh cho lợn ở nước ta ựể làm giống chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh phù ựầu, tiêu chảy, bại huyết do các vi khuẩn này gây ra ở lợn.
3.2 Kết quả giám ựịnh, xác ựịnh serotype và một số yếu tố gây bệnh của các chủng E. coli nghiên cứu
Sau khi lựa chọn các chủng E. coli dùng cho nghiên cứu, chúng tôi tiến hành giám ựịnh lại các chủng vi khuẩn này qua các ựặc tắnh nuôi cấy trên một số môi trường ựặc biệt, ựặc tắnh sinh hóa, khả năng lên men ựường và bằng phương pháp
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
39 PCR. Sau ựó tiến hành xác ựịnh serotype và một số yếu tố gây bệnh ựiển hình của các chủng vi khuẩn này.
3.2.1 Kết quả giám ựịnh các chủng E. coli nghiên cứu
Sau khi lựa chọn ựược 50 chủng E. coli bước ựầu chúng tôi tiến hành kiểm tra một số ựặc tắnh nuôi cấy. Kết quả ựược trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2 . Kết quả kiểm tra một số ựặc tắnh nuôi cấy của các chủng vi khuẩn E. coli
Chỉ tiêu kiểm tra Số
chủng đặc ựiểm
Kết quả (+)
Tỷ lệ (%)
Nước thịt thường 50 Mọc tốt, ựục ựều, lắng cặn màu tro
nhạt ở dưới ựáy. 50 100,0
Thạch máu 50 Khuẩn lạc to, ướt lồi, viền không
gọn, màu xám nhạt. 50 100,0
Thạch thường 50
Khuẩn lạc tròn ướt, bóng láng không trong suốt, màu tro trắng nhạt hơi lồi.
50 100,0
Thạch MacConkey 50
Khuẩn lạc có màu hồng cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi, không nhầy, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường.
50 100,0
Thạch Simmon citrat 50 Khuẩn lạc không màu trên nền
xanh lục 50 100,0
Thạch Endo 50 Khuẩn lạc màu ựỏ 50 100,0
Thạch SS 50 Khuẩn lạc có màu ựỏ
Thạch EMB 50 Khuẩn lạc màu tắm ựen 50 100,0
Giám ựịnh ựặc tắnh sinh hoá các chủng vi khuẩn phân lập ựược nhằm phân loại và xác ựịnh ựúng loài, trên cơ sở ựó có những nghiên cứu tiếp theo.
Kết quả giám ựịnh ựặc tắnh sinh hoá của 50 chủng vi khuẩn E. coli phân lập ựược ựược trình bày tại bảng 3.3.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
40
Bảng 3.3. Kết quả giám ựịnh một số ựặc tắnh sinh hoá của vi khuẩn E. coli
TT Chỉ tiêu kiểm tra Số lượng mẫu Kết quả (+) Tỷ lệ (%) Theo Sokol (1979) 1 Indol 50 50 100,0 + 2 H2S 50 0 0,00 - 3 Di ựộng 50 50 100,0 + 4 Lactose 50 50 100,0 + 5 Glucose 50 50 100,0 + 6 Galactose 50 50 100,0 + 7 Maltose 50 50 100,0 + 8 Fructose 50 50 100,0 + 9 Dulcitol 50 0 100,0 - 10 Manitol 50 50 100,0 + 11 Dextrose 50 50 100,0 + 12 Saccarose 50 0 100,0 -
Theo kết quả của bảng 3.2 và 3.3 ta thấy:
+ 50 chủng E. coli phân lập ựều có ựặc tắnh nuôi cấy như các nghiên cứu trong và ngoài nước.
+ 100% các chủng E. coli ựược kiểm tra cho phản ứng sinh Indol và MR dương tắnh, còn các phản ứng VP và Citrat thì ựều cho kết quả âm tắnh. Tỷ lệ các chủng lên men ựường Lactose, Maltose, Mannitol, Mannose, Sorbitol, Xylose là 100%. Riêng với ựường Inositol, tất cả các chủng ựều cho kết quả âm tắnh.
So sánh kết quả giám ựịnh ựặc tắnh sinh hoá của 50 chủng vi khuẩn E. coli
phân lập ựược với bảng sinh hoá chuẩn của các loại vi khuẩn này thì thấy các chủng vi khuẩn phân lập ựược ựều có các ựặc ựiểm chung, rất ựiển hình của vi khuẩn E. coli như ựã ựược các tài liệu trong và ngoài nước mô tả.
3.2.2. Kết quả xác ựịnh serotyp của các chủng E. coli phân lập ựược:
Serotyp O của 50 chủng vi khuẩn E. coli ựã ựược xác ựịnh bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kắnh. Kết quả ựược trình bày ở bảng 3.4
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
41
Bảng 3.4: Kết quả xác ựịnh serotyp kháng nguyên O của các chủng vi khuẩn
E. coli phân lập ựược
Kết quả TT Serotyp O Số chủng dương tắnh Tỷ lệ (%) 1 O141 8 16,00 2 O149 8 16,00 3 O8 10 20,00 4 O115 6 12,00 5 O169 3 6,00 6 O15 4 8,00 7 O125 1 2,00 8 O28a,c 2 4,00 9 O143 1 2,00 10 O63 1 2,00 11 KXđ 6 12,00 Cộng 50 100
Kết quả bảng 3.4 cho thấy có 44 chủng vi khuẩn E. coli cho phản ứng dương tắnh với 1 trong 10 serotyp kháng huyết thanh O, 6 chủng không xác ựịnh. Trong ựó, số chủng thuộc serotyp O8 là 10 chủng, chiếm tỷ lệ cao nhất 20,0%. Các serotyp O141 và O149 lần lượt chiếm các tỷ lệ tương ứng là 16,0%, các serotyp O125, O143, O63 có tỷ lệ thấp nhất, chỉ chiếm 2,0%.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
42
Hình 3.1. Tỷ lệ kháng nguyên O của các chủng E. coli phân lập ựược
Theo Fairbrother. J. M (1992) các seroyp O138, O139, O141 và O149 thuộc nhóm vi khuẩn ETEC và VTEC là các nhóm thường hay gặp nhất gây tiêu chảy cho lợn con sau cai sữa.
Tác giả Vũ Khắc Hùng và cộng sự (2004) khi xác ựịnh serotyp kháng nguyên O của các chủng E. coli phân lập từ lợn con bị tiêu chảy ở Cộng hoà Slovakia lại thấy rằng: Serotyp O149 chiếm tỷ lệ cao nhất (77%) trong tổng số 220 chủng vi khuẩn ựược kiểm tra, serotyp O141 có tỷ lệ thấp hơn 4,5%. Các serotyp O2, O15, O101 và O157 có cùng tỷ lệ là 1,8%, còn lại các serotyp O8, O54, O84, O147 chiếm các tỷ lệ tương ứng là 6,3%; 2,2%; 2,7%; 2,2%.
Cũng xác ựịnh serotyp kháng nguyên O của các chủng E. coli phân lập ựược ở lợn sau cai sữa ở những ựịa ựiểm lấy mẫu khác là khu vực ựồng bằng sông Cửu Long, Nguyễn Khả Ngự (2000) cho biết, trong số 11 serotyp ựược xác ựịnh, O26 chiếm tỷ lệ cao nhất 27,8%, tiếp theo là O139 chiếm tỷ lệ 13,9%, các serotyp O127, O111, O124, O125, O126, O86, O149 ựều chiếm tỷ lệ 8,3%, còn serotyp O55, O128 chỉ chiếm tỷ lệ 2,8%.
Ở tỉnh Tiền Giang, các tác giả Bùi Trung Trực và cs (2004) lại thấy các serotyp O8, O64, O142, O138 và O139 là phổ biến, trong ựó O139 chiếm tỷ lệ cao
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
43 nhất. Tác giả cũng ựã suy luận là ựàn lợn của tỉnh Tiền Giang có nguy cơ mắc bệnh phù ựầu
Theo thống kê của các nhà nghiên cứu nước ngoài thì các chủng vi khuẩn E. coli thuộc nhóm huyết thanh O139 và có mang kháng nguyên bám dắnh F18 chủ yếu gây tiêu chảy cho lợn sau cai sữa ở Úc, còn ở Châu Âu thì ựại ựa số các chủng vi khuẩn có cấu trúc kháng nguyên ựó lại gây bệnh phù ựầu.
Như vậy, các serotyp kháng nguyên O tìm thấy có sự sai khác ở các vùng với các vị trắ ựịa lý khác nhau, thường gắn liền với loại bệnh và ựộ tuổi khác nhau của lợn
3.2.3. Kết quả xác ựịnh các yếu tố ựộc lực của các chủng E. coli nghiên cứu bằng PCR
Các yếu tố gây bệnh của 50 chủng E. coli phân lập ựược, bao gồm: các yếu tố bám dắnh F4, F18 và ựộc tố chịu nhiệt STa, STb, ựộc tố không chịu nhiệt LT và ựộc tố verotoxin VT2e ựã ựược xác ựịnh bằng phản ứng PCR. Kết quả ựược trình bày ở bảng 3.5.
Bảng 3.5: Tỷ lệ các chủng vi khuẩn E. coli mang các gen quy ựịnh sinh tổng hợp các yếu tố gây bệnh
Số chủng mang gen quy ựịnh sinh tổng hợp các yếu tố gây bệnh Các yếu tố gây bệnh Số chủng dương tắnh/ Tổng số chủng kiểm tra Tỷ lệ (%) F4 16/50 32,0 Yếu tố bám dắnh F18 25/50 50,00 STa 28/50 56,0 STb 17/50 34,0 LT 26/50 52,0 độc tố VT2e 37/50 74,0
Kết quả cho thấy: cả 50 chủng vi khuẩn E. coli ựược kiểm tra ựều cho kết quả dương tắnh ựồng thời với 1 hoặc nhiều yếu tố gây bệnh. Các gen quy ựịnh sinh tổng
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
44 hợp 2 loại kháng nguyên bám dắnh (F4 và F18) và 4 loại ựộc tố (STa, STb, LT và VT2e) ựều ựã ựược phát hiện thấy trong số các chủng E. coli phân lập ựược.
Hình 3.2. Sản phẩm PCR xác ựịnh yếu tố gây bệnh của E. coli
- Trong 2 loại kháng nguyên bám dắnh, số chủng mang F18 chiếm tỷ lệ