Tiến hành gây sỏi tiết niệu trên chuột cống trắng bằng mô hình ethylen glycol được mô tả bởi Jie Fan 1999 [33] với một số thay đổi cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm và mục đích nghiên cứu.
Nguyên tắc của phương pháp là sử dụng ethylen glycol - một chất tiền chuyển hóa của oxalat - để gây tăng bài tiết oxalat niệu, từ đó hình thành sỏi calci oxalat tại thận. Trong mô hình này, ethylen glycol có thể được dùng kết hợp với amoni clorid để làm tăng khả năng kết tập sỏi calci oxalat vào mô thận.
2.3.1. Khảo sát nồng độ ethylen glycol, amoni clorid để gây sỏi tiết niệu trên chuột cống trắng
2.3.1.1. Thiết kế thí nghiệm
Chuột cống trắng được chia thành 5 lô sao cho có sự đồng đều giữa các lô về tỉ lệ đực - cái và khối lượng cơ thể.
- Lô 1: sử dụng làm lô chứng, chế độ ăn và nước uống bình thường
- Lô 2: nước uống hàng ngày được bổ sung ethylen glycol đến nồng độ 1%.
- Lô 3: nước uống hàng ngày được bổ sung ehylen glycol và amoni clorid đến nồng độ tương ứng là 1% và 0,5%.
- Lô 4: nước uống hàng ngày được bổ sung ehylen glycol và amoni clorid đến nồng độ 1% đối với cả hai chất.
- Lô 5: nước uống hàng ngày được bổ sung ehylen glycol và amoni clorid đến nồng độ tương ứng là 1% và 2%.
Thời gian gây sỏi dự kiến 28 ngày.
- Thu nước tiểu xác định tinh thể niệu - Lấy thận làm mô bệnh học Giai đoạn thích nghi
Uống hóa chất gây sỏi hàng ngày
Bắt đầu Kết thúc
Thu nước tiểu xác định tinh thể niệu Chia lô ngẫu nhiên
-1 0 1 2 3 4
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình thực nghiệm thăm dò liều của hóa chất và thời gian gây sỏi
2.3.1.2. Các thông số đánh giá
Khối lượng cơ thể chuột
Tất cả chuột được cân vào ngày trước khi tiến hành thí nghiệm và hàng tuần trong suốt quá trình thí nghiệm để theo dõi ảnh hưởng của hóa chất gây sỏi lên khối lượng cơ thể (KLCT) của chuột. Mức độ tăng KLCT được tính theo công thức:
Độ tăng KLCT (%) = (m2 - m1) x 100/m1
Trong đó, m1 là KLCT trước khi tiến hành thí nghiệm, m2 là KLCT tại thời điểm xác định trong quá trình thí nghiệm.
Thể trạng của chuột cũng được theo dõi chặt chẽ.
Số lượng và thành phần tinh thể calci oxalat trong nước tiểu
Mẫu nước tiểu được gom vào ngày trước khi tiến hành thí nghiệm và các ngày thứ 7, 14, 21, 28 trong quá trình thí nghiệm. Chuột được nhốt riêng vào các lồng hứng nước tiểu để gom mẫu nước tiểu trong vòng 5 giờ. Trong thời gian gom mẫu, cho chuột uống nước (loại nước uống đã được quy định cho từng lô) bằng kim đầu tù với lượng 1ml/giờ, không cung cấp thức ăn trong quá trình lấy mẫu để tránh nhiễm tạp vào mẫu.
Mẫu nước tiểu thu được được đem li tâm, hút bỏ phần dịch bên trên với lượng chính xác là 95% tổng thể tích đem li tâm. Phần cặn còn lại được đưa vào buồng đếm Neubauer và quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại x 400. Quan sát trên 3 vi trường để xác định số lượng tinh thể calci oxalat trong mẫu nước tiểu, bao gồm COD và COM.
Số lượng tinh thể COD, COM được đánh giá theo thang điểm như sau:
-Không có tinh thể nào: 0 -Từ 1 - 3 tinh thể/vi trường : 1
-Từ 4 - 6 tinh thể/vi trường : 2
-Trên 6 tinh thể/vi trường : 3
Số lượng tinh thể calci oxalat niệu bằng tổng số lượng của COD và COM.
Khối lượng thận và tiêu bản mô bệnh học thận
Kết thúc thí nghiệm, giết chuột bằng ether mê và giải phẫu lấy cả hai thận. Cân khối lượng từng thận, sau đó thận phải được bảo quản trong dung dịch formol 10% để làm xét nghiệm mô bệnh học.
Quá trình làm tiêu bản mô thận được thực hiện tại Bộ môn Gải phẫu bệnh - Trường đại học Y Hà Nội. Quy trình làm tiêu bản mô thận được mô tả tóm tắt như sau: cố định thận bằng parafin, cắt lát 5 µm, sau đó nhuộn màu bằng hematoxylin và eosin. Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại x 100 và x 400 để đánh
giá số lượng các tinh thể kết tập. Mức độ kết tập sỏi calci oxalat tại thận được đánh giá theo thang điểm như sau:
-Không thấy tinh thể kết tập : 0
-Có một số tinh thể nhỏ nằm rải rác: 1
-Tinh thể kết tập thành nhiều đám nhỏ: 2
-Tinh thể kết tập thành nhiều đám lớn : 3
Nồng độ của hóa chất gây sỏi được lựa chọn là nồng độ tại đó, tỉ lệ chuột bị sỏi thận cao và ít ảnh hưởng đến thể trạng chuột. Thời gian gây sỏi căn cứ vào thể trạng của chuột và sự thay đổi bài tiết tinh thể calci oxalat trong nước tiểu.