m u) v i thu c th Folin-Ciocalteau cho sản phẩm có màu xanh lam. So màu trên máy quang phổ UV VIS 1000 ở λ= 765 t chuẩn là acid gallic [26].
Các bước ti n hành như sau
- Chuẩn b mẫu đ nh lượng và hóa ch t
Dung d ch acid gallic: 0,5 g acid gallic + 10 ml C2H5OH + 90 ml H2O bảo quản l y d ch chuẩn g c acid gallic có nồ 5 mg/ml.
Dung d ch Na2CO3: 200 g Na2CO3 + 800ml H2 t vài tinh th Na2CO3. sau 24 giờ c và d c c t t i 1000ml.
Dung d ch m u c ợng.
- Ti n hành xây d ng đường chuẩn acid gallic
Chuẩn b ợng theo s ợng dung d ch g : 0, 1, 2, 3, 5 10 c c t t 100μ ợc các nồ 0, 50, 100, 150, 250 và 500 mg/l acid gallic.
Cho vào mỗ 20 μ u th (dung d ch acid gallic chuẩn ở các nồ hoặc d ch chi á p n) + 1,58 ml H2 + 100 μ c th Folin- 30 8 p 300 μ 2CO3 hỗn hợp dung d ch phản ng trong 2 giờ ở 200C rồ á nh ở c sóng 765nm. Ti ợn d ờng chuẩn.
- Đ nh lượng phenolic c a m u nghiên c u bằng cách l 20 μ 0,02 ) ợ i m u chuẩn acid gallic.
2.2.3. iên c u tác d n c các p ân o n d c c i t t t u en (Vigna cylindrica) lên trọn l n và t s c ỉ s ó sin áu c c u t béo p ì t ực n iệ .
2 2 3 1 Thử đ c t nh c p, xác đ nh D50
Xá nh LD50 c a d ch chi t bằ ờng u ng theo p p áp [22]. Chu t nh 12 ờ thí nghi ợc phân lô ng u nhiên N = 10 và cho u ng theo liề n 8 g/kg (th tích và kh ợng t p p) u hi n và s chu t ch t trong 72 giờ á á c c a d ch chi t .
2 2 3 2 X y d ng mô hình chu t b o phì th c nghiệm
Chu t nh t tr ng ch ng Swiss, sau khi mua về ợ ở ều ki ờng trong 3- 4 thích ng v ờng m chúng tôi ti n hành phân chu t thành hai nhóm v i hai ch ỡng :
Nhóm 1- h m đối chứng: các con chu t ti p tụ ợ ằng th ờng (do Vi n V sinh D ch tễ p).
Nhóm 2- Nhóm nuôi béo: các con chu ợ ằng th giàu lipid và cholesterol do chúng tôi ph i tr n các th c phẩ ỡng.
Các nhóm chu ợc theo dõi trong vòng 6 tu n, tr ợng c a các con chu ợc ki m tra hàng tu n. Vào tu n cu i cùng thời gian thí nghi m, á nh tr ợng, chúng tôi ti n hành l a ch n ng u nhiên t mỗi nhóm ra 10 con chu t, l y máu tổng s và phân tích m t s ch s lipid máu. Các s li ợc thu th p và ti n hành x lí th ng kê.
2.2.4. Nghiên c u tác d ng h ờng huy t c a d ch chi t t u en chu t nhắt ây ĐTĐ bằng STZ
tìm hi u tác dụng h ờng huy t c a d ch chi t c tiên chúng tôi ti n hành gây mô hình chu á á ờng mô ph ng type 2 d a trên ch t béo k t hợp v i STZ liề a Srinivasan [27].
Phương ph p g đ i th o đường thực nghiệm ằng STZ
Streptozotocin (STZ:2 – deoxy – 2 - (3 – metyl – 3 - nitrosoureido) – D - glucopyranose) ợ
Streptomyces achromogens ả Z ợ p á 1963 Z ợ ụ p 1 p 2 p ụ ụ á ề [17], [18].
O OH OH OH N H C H2 C N N O O CH3 HO Streptozotocin ề ợ Z á ờ p 1 p 2 ĐTĐ type 1: ở ề 40 – 60 mg/kg th ặ ở ề 100 – 150 / ĐTĐ type 2: Z ề 100 / ỡ ợ ỡ Z ề 50 - 100mg/kg. Z ợ p β 2 ổ Z ặ ở 6 Z ) ổ β ặ á ả ụ ả ả ổ á ồ ờ p ò ặ á ờ p p ổ ờ ả á p ả anion superoxyde (O2 -)
superoxyde sinh ra hydrogen peroxide (H2O2) - ). Các p ả ũ p p á ữ ổ ợ á ò p ) ổ ở Z ờ á ợp - ) + p á ữ ổ ợp β [20]. Aconitase MIT ATP XOD O2- H2O2 OH- ONOO NO NO NDA damage
Poly (ADP - ribosylation)
NAD+ ATP
DNA alkylation STZ
H nh…. Cơ chế g độc củ STZ lên tế ào β củ tụ đảo chuột
MIT- ty thể, XOD – xanthine oxidase
2.2 4 1 hư ng pháp g y ĐTĐ th c nghiệm mô phỏng type 2
Chu p ợ á á ờng type 2 bằng tiêm STZ 110 / p m citrate 0,01M, pH = 4,3) i màng bụng, gây r i lo ổi glucose máu c a chu t BP th c nghi m nhằm t o mô hình chu t p 2 p á n t c khi thí nghi m cho chu t nh 12 ờ ợc ti p nh c và th ờng. Sau t 3- 4 ngày
Hình 2.2. Cơ chế g độc của STZ lên tế ào β của tụ đảo chuột
những con chu t này b b nh v i nồ glucose huy ợ á ≥ 18mmol/l [7], [8]. Ti n hành phân các lô chu b nghiên c u khả ờng huy t khi s dụ á p n d ch chi t t .
Lô 1 Z ề Lô 2 Z ề ằ Lô 3 Z ề ằ p E Lô 4 Z ề ằ p -hexan Lô 5 Z ề ằ p chloroform Lô 6 Z ề ằ p E Lô 7 Z ề ằ p
Chu t b b nh u ều tr á p n d ch chi t t và ợc ti ồ glucose huy t c a chu t ở các thờ m khác nhau 7 14 21 ) trong vòng 21 ngày (3 tu n).
2.2.4.2. Thử khả năng h glucose huy t của các ph n đo n d ch chi t h t đậu đen trên mô hình chu t ĐTĐ type 2 đen trên mô hình chu t ĐTĐ type 2
Các lô chu p 2 10 / ) ợ ờ ều tr hằng ngày bằng cách cho u p n d ch chi t t v i liều 2000 / ờng huy t c a các con chu ợ t thờ m trong ngày và sau khi nh 12 ờ ở các ngày th 0 ều tr ), ngày th 7, 14. 21 ều tr .
2.2.5. Sử d n p ơn p áp ó sin - y d c: ợ ờng huy t
[19] và m t s ch s n r i lo ổi lipid [12] ở chu ều tr bằ á p n d ch chi t t .
2.2.5.1. hư ng pháp đ nh lượng glucose huy t * Nguyên tắc
ợ ằ p p áp ợng glucose huy t. + Phản ng 1: khi máu ti p xúc v i bề mặt c a vùng phản ng que th , á ặc hi u c a glucose oxidase (GOD) có trong kít th , glucose trong máu phản ng v i oxy (không khí) t o thành acid gluconic và hydro peroxide (H2O2).
+ Phản ng 2: hydro peroxide v a t o ra s phản ng v i O-Dianisidin t o ph ợc thi t b c trong máy One Touch Ultra chuy ợng bi u th bằng s mmol/l hoặc mg/dl glucose.
* Ti n hành
ều khi khở ng máy. G n que th vào máy. Dùng kim châm chuyên dụng châm vào m ch máu ở máu chảy t nhiên, th m b gi u tiên, l y gi t máu th 2. M u máu dùng cho vi 1µl, phải là gi á ò y, ph kín gi t máu lên vùng phản ng c a que th . Sau 5 giây, k t quả nồ ờng huy t s hi n th trên màn hình.
Hình 2.3: P ơn p áp lấy áu o lucose uy t
2.2.5.2 Đ nh lượng m t số chỉ số lipid trong huy t thanh
Các ch s lipid huy t thanh (cholesterol toàn ph n, triglycerid, HDL-c, LDL- ) ợ á nh trên máy xét nghi m sinh hóa t ng (Phòng hóa sinh – B nh vi n Hữu ngh Vi t - Xô). Nguyên t á :
. Định lượng triglycerid
Thuỷ phân triglycerid bằ p ợng glycerol giải phóng ra bằ p p áp u c a quynonimin t o thành t 4- aminoantipyrin và 4-chlorophenol phản ng v i peroxide hydrogen theo các phản ng sau:
quang h c quynonimin ở c sóng 546nm (máy Olympus AU400) rồi so v i chuẩ tính k t quả.
. Định lượng cholesterol toàn phần
Thuỷ phân cholesterol este bằng enzyme cholesterol esterase (CHE) và oxy hoá bằ ) quang c a quynonimin t o nên t phản ng c a hydrogen peroxide v i 4-aminophenazone và phenol nhờ xúc tác c a peroxydase. Các phản ng:
quang c a Quynonimin ở c sóng 546nm (bằng máy Olympus AU400), so v i ng chuẩ tính k t quả.
c. Định lượng HDL-c
Nguyên tắc: xét nghi m gồ c c th nh t cholesterol trong chylomicron, VLDL, LDL b lo i b và phá h y bằng các phản ng enzyme ặc hi c th ợ ợng bằng phản
ng enzyme v i s có mặt c a ch ặc hi u cho HDL c 1
2
2.2.6. P ơn pháp xử lý s liệu
Ch s glucose huy ợc so sánh giữa thờ m c và sau nghiên c u; so sánh giữa các lô dùng thu i ch ng ở cùng thờ m.
* Tỷ lệ tăng glucose huy t được tính theo công thức
Tỷ l % t:
X1 – Tỷ l % t
A – Ch s glucose huy t t i thờ u B – Ch s glucose huy t t i thờ á á
S khác bi ợc ki nh bằng thu t toán t- test student v i p< 0,05 ĩ ng kê.
* Tỷ lệ h glucose huy t, (CHL, HDL-C, LDL-C, TG) được tính theo công thức dưới đ y
X2 – Tỷ l % h glucose huy t
A – Ch s glucose huy t t i thờ u B – Ch s glucose huy t t i thờ á á
S khác bi ợc ki nh bằng thu t toán t- test student v i p< 0,05 có ĩ ng kê
CHƯ NG 3. T QUẢ NGHI N CỨU VÀ THẢO LU N
3.1. T ch chiết định tính định lượng c c hợp ch t tự nhiên từ hạt đ u đen (Vigna cylindrica)
3.1.1. K t quả tác c i t các p ân o n
Hình 3.1. Mô hình chiết rút c c ph n đoạn hợp ch t tự nhiên từ hạt đ u đen (Vigna cylindrica)
á ợp ợ : 3000 ề 10 ồ 96% ò 2 ở p ò p ụ ồ 2 ữ ợ 194 68 ồ ổ 20% ồ ổ 38,94 ) ồ ò ồ 3 -hexan theo ỷ 1:1 ề p p - ợ 40,15 p - hexan p p ò chloroform ỷ 1:1 ề ặp 2 ữ ) p p chloroform ợ 21 79 p chloroform p p ụ ặp 2 ữ ) p p ợ 13 58 p p ò ợ 62 45 p
V i quy trình chi ợc hi u su t chi t rút á p n hợp ch t t nhiên t 3000 gam b t m n ảng 3.1.
Bảng 3.1. Hiệu su t chiết rút c c ph n đoạn từ hạt đ u đen
Phân o n Mẫu b n ầu (g) Hiệu suất chi t rút (%)
Cao ethanol 194,68 6,49 Cao n – hexan 40,15 1,34 Cao chloroform 21,79 0,73 Cao ethylacetate 13,58 0,45 62,45 2,08 ở p 6,49%) ợn 3000 p p (2,08%) p n–hexan là (1,34%), p chloroform là
(0,73%), p ở p ethylacetate (0,45%) ả ợ á ợp ợ á ợp p ỷ á ề ợ ở ả ợ á p .
3.1.2. K t quả nh tính m t s nhóm h p chất tự nhiên trong các phân o n d ch chi t t t u en i n cylindric )
á nh thành ph n hợp ch t t nhiên có trong d ch chi t các phân ) ồm có: Cao EtOH, n- hexan, CHCl3. EtOAc . Chúng tôi ti nh tính thành ph n m t s hợp ch t t nhiên thông qua các phản ng hóa h c và m t s thu c th ng. K ả ả 3 2
Bảng 3.2. Kết quả định tính c c ph n đoạn dịch chiết hạt đ u đen Nhóm
ch t
Phản ứng đặc trưng
ẫu
EtOH n- hexan chloroform ethylacetat Nước
Flavonoid Shinoda ++ + +++ +++ + Diazo +++ + +++ + + H2SO4 đặc ++ +++ +++ + ++ Catechin Vanilin/HCl(đ) ++ + ++ + - Tannin Vanilin +++ + +++ ++ + Gelatin/NaCl ++ ++ +++ + + Acetat chì +++ + +++ ++ + Polyphenol khác NaOH 10% ++ - ++ + + FeCl3 5% ++ ++ ++ ++ + Glycoside Keller-killian + + + - - Alkaloid Mayen + ++ + + + Dragendroff ++ + ++ + ++ Bouchardat + + + ++ +
Chú thích: (-): Không phản ứng (+): Phản ứng (++): Phản ứng mạnh (+++): Phản ứng r t mạnh T k t quả các phản nh tính cho th p á ợp á p p ồm: Flavonoid, tannin, glycoside, alkaloid, p p á ả 5 p E -hexan, CHCl3. EtOAc p ề á p ợ á ây là những dung môi khá phù hợp chi t rút các hợp ch t th sinh t p ả p –hexan, p p ũ á p ả ở p ả Ở p ồ p chloroform p ả á p p á p ả . K t quả nh tính này giúp chúng tôi có những ti p tục nghiên c u ở m
3.1.3. Phân tích thành phần các h p chất tự n iên tron các p ân o n d ch chi t t t u en i n cylindric ) bằng sắc kí lớp mỏng
n hành ch y s c kí bản m ng tráng sẵn Silicagel Merck Alufolien 60 F254 v i nhiều h dung môi khác nhau :
1 (Toluen-Ethylacetate-Acetone-Acid Formic) : (5:3:1:1) 2 (Chloroform- Ethylacetate-Methanol) : (1:24:4)
3 (n-hexan:acetone) : (5:2)
4 (Chloroform- Methanol) : (9:1) 5 (n-hexan: Ethylacetate) : (2:1)
H nh 3.2. Sắc ký đồ ở một số hệ dung môi kh c nh u
ò -hexan:E ) : 2:1) ả ợ
K t quả s ồ hình 3.3. cho th y bản s c ký xu t hi n nhiề v ch có màu s c khác nhau. Chú thích: 1: Cao n-hexan 2: Cao EtOH 3: Cao EtOAc 4. Cao CHCl3 5, C o PĐ nước Chạ ở hệ dung môi (n-hexan: Ethylacetate) : (2:1)
H nh 3.3. Sắc ký đồ c c ph n đoạn dịch chiết hạt đ u đen
ả 3.3 p E p chloroform ề á ồ – p ethylacetate á ) màu xanh (tanin) ồ ) á ở á p p p ả á ợ ỷ á .
ề p ề ợ á á ả ợ ề ờ á ợ ờ ề p p ả á á á ờ
3.1.4. Đ n l n à l n polyp enol tổn s tron c o d c c i t các p ân o n t t u en i n cylindric )
Chúng tôi ti á ợng polyphenol tổng s trong các p n d ch chi t bằ p p áp - Ciocalteau.
3.1.4 1 t quả x y d ng đường chuẩn acid gallic
ờng chuẩ ợc xây d ng bằng cách chuẩn b các dung d ch acid gallic ở các nồ 50, 100, 150, 250, 500mg/l, ti n hành trên máy ERMA ở c sóng 765nm. K t quả ợc th hi n ở bảng 3.3 và hình 3.4.
Bảng 3.3. Kết quả xây dựng đường chuẩn acid gallic
TT acid gallic (mg/l) OD (765nm) 1 0 0,009 2 50 0,062 3 100 0,119 4 150 0,168 5 250 0,265 6 500 0,519
Hình 3.4: Đồ thị đường chuẩn cid g llic
3 1 4 2 Đ nh lượng polyphenol tổng số theo phư ng pháp Folin- Ciocalteau
ợng polyphenol c a d ch chi á p n bằ p pháp Folin - Ciocalteau. D ch chi t m u cho phản ng v i thu c th Folin - Ciacalteau t o ra sản phẩm có màu xanh lam [26]. So màu trên máy ERMA ở λ = 765 t chuẩ ợng polyphenol. K t quả ợc trình bày ở bảng 3.4.
ảng 3.4. Định lượng pol phenol tổng số c c ph n đoạn dịch chiết từ hạt đ u đen (Vigna cylindrica)
OD765nm ồ / ) ỷ %) polyphenol Cao EtOH 0,683 670,2 6,702 Cao n-hexan 0,114 101,2 1,012 Cao CHCl3 0,301 288,2 2,882 Cao EtOAc 0,125 112,2 1,122 0,095 82,2 0,822
ả ả 3 4 ợ p p ổ p EtOH 6,702%) p chloroform (2,882%) p - p EtOAc ợ p p 1,012% và 1,122% ) p p (0,822%) ả ằ p ề ợp ả chloroform. ề p ợp p p p p p p ả ợ p ợp ả ở 3.2. ết quả x c định liều độc c p Xá 50 ổ ằ ờ p p áp [22] 12 ờ ợ p ỗ 10 ợ ề 8 / 72 ờ á á .
ảng 3.5. ết quả thử độc tính c p theo đường uống
Liều uống mg/kg Tổng số chuột Số chuột chết % chuột chết
6500mg/kg 10 0 0% 7000mg/kg 10 0 0% 7500mg/kg 10 0 0% 8000mg/kg 10 0 0% 72 ờ á ề 6500, 7000, 7500 / ề 8000 / ũ ợ 50, ng ĩ
á p ở ề ờ
3.3. ết quả tạo mô h nh chuột o ph thực nghiệm, t c dụng củ c c ph n đoạn dịch chiết từ hạt đ u đen đến trọng lượng củ chuột o ph
3.3.1. K t quả t o ìn c u t béo p ì t ực n iệ
) w ợ 17 - 20 ) ợ 8
1: ờ ễ )
Lô 2-8: p và cholesterol cao.
6 ợ ả á ề ờ lipid và cholesterol cao.
A – Chuột o – Chuột thường H nh 3.5. Chuột o và chuột thường s u 6 tuần nuôi
ả ổ ợ ợ ở ả 3 6 3 6.
ảng 3.6. Trọng lượng trung nh (tính theo g m) củ h i nhóm chuột nuôi bằng h i chế độ dinh dưỡng kh c nh u
Nhóm
Trọng lượng (g)
n đầu Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 Tuần 5 Tuần 6
Ă ờ 17,93 19,97 22,78 25,52 28,95 31,54 34,72 ±1,12 ±0,41 ±0,49 ±0,58 ±1,25 ±1,03 ±0,98
Ăn béo 18,09 23,57 28,75 35,49 41,89 47,84 52,92 ±1,35 ±1,72 ±1,38 ±1,74 ±1,68 ±1,45 ±1,81
Hình 3.6. iểu đồ iểu diễn sự tăng trọng lượng củ c c nhóm chuột với 2 chế độ dinh dưỡng kh c nh u trong vòng 6 tuần.
p 6 p y á ề ợ ằ
p ằ ờ ụ : ằ ờ 16,79 193,64% ờ 16,79 193,64% ằ p ợ thêm 34,83 292,54% p 2,07 ờ C 10 12 ờ á ổ p á á á ả ở p
ảng 3.7. So s nh một số chỉ số lipid m u giữ chuột nuôi thường và nuôi o ph thực nghiệm. C c chỉ số lipid (mmol/l) TC TG HDL-c LDL-c Glucose ờ 4,16* 1,18* 1,64* 2,83* 6,15* ±0,44 ±0,2 ±0,2 ±0,32 ±0,37 6,03* 2,54* 0,97* 3,91* 8,93* ±0,31 ±0,21 ±0,2 ±0,37 ±0,35 So sánh lô / ờ ↑1,45 ↑2,15 ↓1,69 ↑1,38 ↑1,45 (*) với p<0,05
H nh 3.7. iểu đồ so s nh một số chỉ số lipid m u giữ chuột nuôi thường và nuôi o ph thực nghiệm.
ả ả 3 7 ình 3.7 á
á ữ ờ ụ :
ợng glucose c a chu t béo phì là 8,93 / 45 2% so v i chu ờng (6,15mmol/l) v i m ĩ p<0,05, Nồ cholesterol c a chu t béo phì là 6,03 mmol/l, 44 95% so