Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được dựa trên kết quả phân tích các phổ IR, MS , 1H-NMR và 13
C-NMR.
2.4.3. Thử tác dụng gây độc tế bào a) Nguyên tắc thử
Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư (thử độc tính tế bào) in vitro được thực hiện tại Khoa Dược, Trường Đại học Quốc gia Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc theo phương pháp MTT và giá trị IC50 được tính trên phần mềm GraphPad Prism [26].
Dòng tế bào thử nghiệm: SW620: tế bào ung thư đại tràng.
Các dòng tế bào ung thư được lấy từ Ngân hàng tế bào ung thư của Viện nghiên cứu sinh học và công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) và được nuôi cấy trong môi trường DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium) (với dòng tế bào MCF-7) hoặc RPMI (với dòng 4 tế bào còn lại) bổ sung 10 FBS (huyết thanh bào thai bò).
Độc tính tế bào của các chất được thử bằng phương pháp MTT theo các bước sau:
Chuẩn bị: Các tế bào ở pha logarit được trypsin hóa và phân tán vào hỗn dịch đơn tế bào trong môi trường DMEM hoặc RPMI bổ sung 10% FBS và điều chỉnh đến nồng độ khoảng 1,5.104 đến 3,5.104
tế bào, sau đó chia đều vào các giếng của đĩa 96 giếng, mỗi giếng 200 L. Các đĩa sau đó được ủ ở 370Ctrong điều kiện 5% CO2. Sau 24 giờ ủ, các mẫu thử được chuẩn bị trong 20 L môi trường DMEM/RPMI bổ sung 10% FBS từ dung dịch gốc 10 mg/mL trong dimethyl sulfoxid (DMSO) rồi thêm 2 L mẫu thử vào các
giếng ở nhiều nồng độ khác nhau, các đĩa này sau đó được ủ thêm 48 giờ. Tất cả các mẫu được chuẩn bị sao cho nồng độ cuối cùng của DMSO không quá 0,1%.Tiến hành thử: Sau khi ủ 48 giờ, thêm vào mỗi giếng 20 L thuốc nhuộm MTT (nồng độ MTT 5 mg/mL trong muối đệm phosphat - PBS). Các đĩa được ủ thêm 3 giờ ở 370
Ctrong điều kiện 5% CO2. Tiếp theo, mỗi giếng được cho 100 L dung dịch DMSO, để 5 phút cho MTT formazan được hòa
tan. Độ hấp thụ được đọc ở bước sóng 510 nm.
b) Tính kết quả
Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu thử mà ở đó, độ hấp thụ giảm đi 50 so với nhóm chứng (trắng âm tính là giếng chỉ thêm môi trường nuôi cấy): kết quả cuối cùng là giá trị trung bình của 4 lần đo độc lập với giá trị độ hấp thụ khác nhau không quá 5 .
Giá trị IC50 được tính dựa trên phần mềm GraphPad Prism. Trong phương pháp thử này, IC50 20 g/mL được coi là có hoạt tính.
2.4.4. Nghiên cứu docking các chất
Việc nghiên cứu sơ bộ tương tác của các chất 5a, 5b, 5c, 5d với HDAC (docking) được tiến hành tại phòng nghiên cứu cấu trúc Đại học quốc gia Seoul Hàn Quốc .
HDAC được tiến hành nghiên cứu kỹ nhất là HDAC8. Cấu trúc này có sự tương đồng cao với HDAC4 với điểm DALY Z=40,4 (Z-score,điểm đánh giá độ giống) và độ lệnh r.m.s.d=2,1, thứ tự acid amin giống nhau là 46% .Tiến hành nghiên cứu docking giữa HDAC8 và SAHA bằng chương trình Autodock Vina cho thấy sự lắp ráp thực tế của SAHA và HDAC8 tương tự như mô hình nghiên cứu với sự sai khác nhỏ. Tiếp theo chúng tôi dự đoán năng lượng liên kết từ sự lắp ráp trên.
Kết quả sẽ được mô tả bằng hình ảnh mô hình tương tác và năng lượng liên kết.
2.4.5. Giá trị LogP và đánh giá mức độ giống thuốc của các dẫn chất tổng hợp được
Tính các giá trị logP bằng phần mềm EPIsuite cung cấp bởi US Environmental Protection Agency’s office of Pollution Prevention and Toxics and Syracuse Research Corporation (SRC).
Nhận xét mối liên quan giữa hoạt tính và cấu trúc cùng giá trị logP của các dẫn chất.
Đánh giá mức độ giống thuốc của các dẫn chất dụa vào quy tắc Lipinsky:
- Khối lượng mol phân tử của chất < 500 g/mol.
- Số trung tâm nhận liên kết hydro (N, O) phải <10.
- Số trung tâm liên kết hidro (NH, OH) < 5.
- Cân bằng hệ số thân dầu/nước: logP <5.
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1 Tổng hợp hóa học
Quá trình tổng hợp 4 chất trong khóa luận này được tiến hành theo sơ đồ hình 3.1:
Sơ đồ 3.1. Quy trình tổng hợp chung (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ác nhân và điều kiện: i) thiosemicarbazid, ethanol, acid acetic băng; ii)
FeCl3.12H2O, ethanol; iii) acid monomethyl suberic, carbonyl diimidazol, DMF; iv) hydroxylamin, NaOH, methanol.
3.1.1. Tổng hợp ”N1
-hydroxy-N8-(5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2- yl)octandiamid” (5a)
Để tổng hợp chất 5a chúng tôi tiến hành quy trình phản ứng gồm 4 giai đoạn tương tự trong sơ đồ phương pháp chung.
a. Tổng hợp chất 2a
Đầu tiên, để tổng hợp chất 5a cần tổng hợp 2- phenylidenhydrazincarbothioamid (2a). Tổng hợp chất 2a từ benzaldehyd
(1a) được chúng tôi thực hiện bằng phản ứng ngưng tụ với xúc tác là acid hữu cơ, tiến hành phản ứng như sau:
Tiến hành phản ứng:
Cho (0,2 ml; 2 mmol) benzaldehyd (1a) và (0,218 g; 2,4 mmol) thiosemicarbazid vào bình cầu 50 mL. Thêm 20 ml dung môi EtOH tuyệt đối và 2 giọt acid acetic băng làm xúc tác. Đun hồi lưu và khuấy 300 vòng/phút trong 4h.
Thu sản phẩm:
Cất thu hồi dung môi bằng máy cất quay ở nhiệt độ 400C trong 2 phút sau đó thêm 15mL nước cất để tủa sản phẩm. Lọc và rửa tủa 3 lần bằng 15mL nước cất. Sấy khô tủa ở 600C (trong khoảng 48h).
Kết quả:
Cảm quan: Bột tinh thể màu trắng .
Hiệu suất: 91,2% (0,326 g).
T0nc: 165-1660C.
Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,66. Toàn bộ sản phẩm 2a của phản ứng được chúng tôi dành để thực hiện các bước tiếp theo của quá trình tổng hợp chất 5a.
b. Tổng hợp chất 3a
Chúng tôi thực hiện việc tổng hợp chất 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2- amin (3a) từ 2a bằng phản ứng đóng vòng nội phân tử. Quá trình tổng hợp được thực hiện như sau:
Tiến hành phản ứng:
Cân hỗn hợp các chất phản ứng bao gồm: (0,178 g; 1 mmol) chất 2a và (0,81 g; 3 mmol) muối sắt FeCl3.12H2O. Hòa tan hoàn toàn lượng muối sắt bằng 3 mL dung môi EtOH trong bình cầu 50 mL, gia nhiệt đến hồi lưu. Đồng
thời hòa tan hoàn toàn lượng chất 2a bằng 20 mL dung môi EtOH tuyệt đối trong cốc có mỏ, đến khoảng 70ºC.
Đổ dung dịch chất 2a từ cốc có mỏ vào bình phản ứng, giữ nhiệt độ hồi lưu và khuấy 300 vòng/phút. Kết thúc phản ứng sau 30 phút.
Thu sản phẩm:
Cất thu hồi bớt dung môi bằng máy cất quay ở nhiệt độ khoảng 400C trong 2 phút sau đó pha loãng hỗn hợp phản ứng bằng nước cất. Kiềm hóa hỗn hợp bằng khoảng 10 mL dung dịch NaOH 30% (kiểm tra bằng giấy quỳ vạn năng).
Chiết thu sản phẩm 3 lần bằng cloroform (mỗi lần 5-10 mL), thu lớp dưới. Gộp dịch chiết của 3 lần chiết lại với nước muối bão hòa. Cất thu hồi dung môi của dịch chiết bằng máy cất quay ở nhiệt độ 400 C đến khi hết dung môi thu sản phẩm 3a. Sấy sản phẩm ở 600C trong 4h.
Kết quả:
Cảm quan: Bột kết tinh màu vàng nhạt.
Hiệu suất: 72,5% (0,128 g).
T0nc: 196-1970C. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,54.
c. Tổng hợp chất 4a
Chất methyl 8-oxo-8-(5’-phenyl-1’,3’,4’-thiadiazol-2’- ylamino)octanoat (4a) được tổng hợp từ chất 3a bằng phản ứng acyl hóa của chất 3a với acid monomethyl suberic. Quy trình tổng hợp được thực hiện như sau:
Tiến hành phản ứng:
Cho (0,162 g, 1 mmol) 1,1’-carbonyldiimidazol (CDI) và hút (1 mL, 1 mmol ) acid monomethyl suberic vào bình cầu 50 mL. Thêm 3 mL dung môi DMF. Để hoạt hóa trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.
Sau khi hỗn hợp trong bình phản ứng đã hoạt hóa đủ thời gian, cho (0,177 g, 1 mmol) chất 3a vào bình phản ứng, gia nhiệt lên 600C, khuấy 300 vòng/phút trong vòng 24h.
Thu sản phẩm:
Làm lạnh bình phản ứng bằng nước đá. Đổ từ từ 15 mL dung dịch HCl loãng, lạnh vào bình phản ứng, vừa đổ vừa lắc. Để yên 15 phút.
Lọc và rửa tủa 3 lần bằng 15 mL dung dịch acid HCl loãng, lạnh. Sấy tủa ở 600C trong 24h.
Kết quả:
Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng hơi hồng.
Hiệu suất: 58,2% (0,202 g).
T0nc: 236-2380 C.
Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,82.
d.Tổng hợp chất 5a
Chất đích thứ nhất N1-hydroxy-N8-(5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2- yl)octandiamid (5a) được tổng hợp bằng phản ứng tạo dẫn xuất của acid hydroxamic giữa chất 4a với hydroxylamin hydroclorid. Tổng hợp chất 5a
được thực hiện như sau:
Tiến hành phản ứng:
Cho (0,173 g; 0,5 mmol) chất 4a và (0,33 g; 5 mmol) hydroxylamin hydroclorid vào bình cầu 50 mL, thêm 20 mL dung môi MeOH, dùng siêu âm để tạo hỗn dịch đồng nhất. Đặt bình phản ứng trong hỗn hợp nước đá và muối ăn, duy trì nhiệt độ dưới 00
C, khuấy 300 vòng/phút.
Hòa tan (0,4 g; 10 mmol) NaOH trong 5 ml nước cất trong ống nghiệm và làm lạnh xuống dưới 00C trong hỗn hợp nước đá muối ăn. Đổ dung dịch
NaOH vào bình phản ứng, giữ nhiệt độ dưới 00C, phản ứng kết thúc sau 1h 30 phút. Chúng tôi theo dõi tiến trình phản ứng và xác định thời điểm kết thúc bằng cách dùng dung dịch FeCl3 và TLC, cụ thể làm như sau:
- Acid hóa khoảng 0,1 mL hỗn hợp phản ứng bằng 1 giọt dung dịch HCl loãng trên khay sứ, sau đó nhỏ 1 giọt dung dịch FeCl3 5%, xuất hiện màu đỏ vang chúng tỏ đã có acid hydroxamic được tạo ra.
- Acid hóa khoảng 0,1 mL hỗn hợp phản ứng trong vial, kiểm tra TLC với pha động DCM : MeOH (9:1). Kết thúc phản ứng khi kết quả cho thấy đã phản ứng hết ester ban đầu.
Xử lý phản ứng:
Acid hóa hỗn hợp phản ứng bằng dung dịch 20 mL dung dịch HCl loãng, lạnh điều chỉnh pH về khoảng 4-5 (kiểm tra bằng giấy quỳ vạn năng). Để yên 15 phút sau đó lọc và rửa tủa 3 lần bằng 15 mL dung dịch HCl loãng. Sấy tủa ở 600C trong 24h.
Kết quả:
Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng.
Hiệu suất: 52,0% (0,090 g).
T0nc: 202-2040C. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kiểm tra bằng TLC và xác định cấu trúc: (kết quả cụ thể được trình bày trong phần 3.1.5 và phần 3.2).
3.1.2. Tổng hợp N1-hydroxy-N8-[5-(3’,4’,5’-trimethoxyphenyl)-1,3,4- thiadiazol-2-yl]octandiamid (5b)
Để tổng hợp chất 5b chúng tôi tiến hành theo quy trình phản ứng được trình bày trong sơ đồ chung.
a.Tổng hợp chất 2b
Đầu tiên để tổng hợp chất 5b chúng tôi cần tổng hợp chất 2-(3’,4’,5’- trimethoxybenzylidin)hydrazincarbothioamid (2b). Quá trình tổng hợp chất
2b từ (0,3920 g; 2 mmol) chất 3,4,5-trimethoxybenzaldehyd (1b) được thực hiện tương tự như tổng hợp chất 2a. Kết quả như sau:
Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng .
Hiệu suất: 92,2% (0,496 g).
T0nc: 145-1470C.
Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,65.
b.Tổng hợp chất 3b
Tổng hợp chất 5-(3’,4’,5’-trimethoxyphenyl)-1,3,4-thiadiazol-2-amin
(3b) từ (0,269 g; 1mmol) chất 2b được tiến hành tương tự như tổng hợp chất
3a. Kết quả như sau:
Cảm quan: Bột kết tinh màu vàng nâu.
Hiệu suất: 70,5% (0,188 g).
T0nc: 173-1740C.
Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,53.
c. Tổng hợp chất 4b
Tổng hợp chất methyl 8-oxo-8-[5’-(3’’,4’’,5’’-trimethoxyphenyl)- 1’,3’,4’-thiadiazol-2’-ylamino]octanoat (4b) từ (0,267 g; 1 mmol) chất 3b
được tiến hành tương tự như tổng hợp chất 4a. Kết quả của quá trình như sau:
Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng .
Hiệu suất: 52,3% (0,2285 g).
Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,8.
d.Tổng hợp chất 5b
Tổng hợp chất đích thứ hai N1-hydroxy-N8-[5-(3’,4’,5’- trimethoxyphenyl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octanediamid (5b) từ (0,2185 g; 0,5 mmol) chất 4b được tiến hành tương tự như tổng hợp chất 5a. Kết quả như sau:
Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng.
Hiệu suất phản ứng: 53,5% (0,117 g).
T0nc: 177-1780C.
Kiểm tra bằng TLC và xác định cấu trúc: (kết quả cụ thể được trình bày trong phần 3.1.5 và 3.2). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.1.3. Tổng hợp chất N1-hydroxy-N8-[5-(2’,3’,4’-trimethoxyphenyl)-1,3,4- thiadiazol-2-yl]octandiamid (5c)
Để tổng hợp chất 5c chúng tôi tiến hành theo quy trình phản ứng được trình bày trong sơ đồ chung.
a.Tổng hợp chất 2c
Đầu tiên để tổng hợp chất 5c chúng tôi cần tổng hợp chất 2-(2’,3’,4’- trimethoxybenzylidin)hydrazincarbothioamid (2c). Quá trình tổng hợp chất
2c từ (0,3920 g; 2 mmol) chất 2,3,4-trimethoxybenzaldehyd (1c) được thực hiện tương tự như tổng hợp chất 2a. Kết quả như sau:
Cảm quan: Sản phẩm thu được là bột kết tinh màu trắng.
Hiệu suất: 90,5% (0,487 g).
T0nc: 146-1480C.
Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,65.
Tổng hợp chất 5-(2’,3’,4’-trimethoxyphenyl)-1,3,4-thiadiazol-2-amin
(3c) từ (0,269 g; 1 mmol) chất 2c được tiến hành tương tự như tổng hợp chất
3a. Kết quả như sau:
Cảm quan: Bột kết tinh màu vàng nhạt.
Hiệu suất: 71,3% (0,190 g).
T0nc: 173-1750C.
Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,53.
c. Tổng hợp chất 4c
Tổng hợp chất methyl 8-oxo-8-[5’-(2”,3”,4”-trimethoxyphenyl)-1,3,4- thiadiazol-2’-ylamino]octanoat (4c) từ (0,267 g; 1 mmol) chất 3c được tiến hành tương tự như tổng hợp chất 4a. Kết quả của quá trình như sau:
Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng hơi hồng.
Hiệu suất: 54,5% (0,238 g).
T0nc: 210-2120C.
Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,8
d.Tổng hợp chất 5c
Tổng hợp chất đích thứ ba N1-hydroxy-N8-[5-(2’,3’,4’- trimethoxyphenyl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid (5c) từ (0,2185 g; 0,5 mmol) chất 4c được tiến hành tương tự như tổng hợp chất 5a. Kết quả của quá trình như sau:
Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng.
Hiệu suất phản ứng: 53,6% (0,117 g).
T0nc: 175-1760C.
Kiểm tra bằng TLC và xác định công thức: (kết quả cụ thể được trình bày trong phần 3.1.5 và 3.2).
3.1.4. Tổng hợp chất N1-hydroxy-N8-[(5-benzo[d][1’,3’]-dioxo-5’-yl)-1,3,4- thiadiazol-2-yl]octandiamid (5d)
Để tổng hợp chất 5d chúng tôi tiến hành theo quy trình phản ứng được trình bày trong sơ đồ chung. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
a.Tổng hợp chất 2d
Đầu tiên để tổng hợp chất 5d chúng tôi cần tổng hợp chất 2- (benzo[d][1’,3’]-dioxo-5’-yl-idin)hydrazincarbothioamid (2d). Quá trình tổng hợp chất 2d từ (0,300 g; 2 mmol) chất 3,4-methylendioxybenzaldehyd (1d) được thực hiện tương tự như tổng hợp chất 2a. Kết quả như sau:
Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng hơi vàng.
Hiệu suất: 89,3% (0,398 g).
T0nc: 162-1640C.
Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,65.
b.Tổng hợp chất 3d
Tổng hợp chất (5-benzo[d][1’,3’]-dioxo-5’-yl-1,3,4-thiadiazol)-2-amin
(3d) từ (0,223 g; 1 mmol) chất 2d được tiến hành tương tự như tổng hợp chất
3a. Kết quả như sau:
Cảm quan: Bột kết tinh màu vàng nhạt.
Hiệu suất: 71,8% (0,159 g).
T0nc: 192-1950C.
Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,54.
c. Tổng hợp chất 4d
Tổng hợp chất methyl 8-oxo-8-(5’-benzo[d][1”,3”]-dioxo-5”-yl- 1’,3’,4’-thiadiazol-2-ylamino)octanoat (4d) từ (0,381 g; 1 mmol) chất 3d
được tiến hành tương tự như tổng hợp chất 4a. Kết quả như sau:
Cảm quan: Bột màu trắng hơi hồng.
Hiệu suất: 56,2% (0,220 g).
Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,8.
d.Tổng hợp chất 5d
Tổng hợp chất đích thứ tư N1-hydroxy-N8-(5-benzo[d][1’,3’]-dioxo-5’- yl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)octandiamid (5d) từ (0,195 g; 0,5 mmol) chất 4d
được tiến hành tương tự như tổng hợp chất 5a. Kết quả như sau:
Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng.
Hiệu suất phản ứng: 54,3% (0,106 g).
T0nc: 190,5-1920C.
Kiểm tra bằng TLC và xác định công thức: (kết quả cụ thể được trình bày trong phần 3.1.5 và phần 3.2).
3.1.5. Kiểm t a độ tinh khiết
Chúng tôi đã kiểm tra độ tinh khiết các chất 5a-d bằng TLC và đo nhiệt độ nóng chảy (To
nc) của chúng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
TLC được tiến hành trên bản nhôm tráng sẵn silicagel Merck 70-230 mesh, quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm. Hòa tan trong dung môi DMF và sau đó khảo sát với các hệ dung môi triển khai. Kết quả thu được trên các sắc ký đồ đều thấy một vết rõ, gọn khi soi dưới ánh sáng đèn tử ngoại.
Đo nhiệt độ nóng chảy: 4 chất sau khi được tinh chế bằng cách kết tinh lại đều có dạng tinh thể rắn được đo nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện (Electrothermal digital).
Nhiệt độ nóng chảy và giá trị Rf của các chất với 3 hệ dung môi triển