2.3.1.Tổng hợp hóa học và kiể tr độ tinh khiết
- Nghiên cứu tổng hợp 4 chất trong mục tiêu bằng phương pháp hóa học.
- Dùng TLC để theo dõi tiến trình của phản ứng.
- Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng TLC v đo nhiệt độ nóng chảy.
2.3.2. Xác định cấu trúc
Các chất tổng hợp được xác định cấu trúc bằng các loại phổ sau: phổ hồng ngoại (IR), phổ hối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ proton (1
H-NMR), phổ cộng hưởng từ carbon (13C-NMR).
Phổ hồng ngoại (IR): phổ hồng ngoại được ghi tại Khoa Hóa - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (KHTN) H Nội – Đại học Quốc Gia Hà Nội, trên máy Per in Elmer với ĩ thuật viên nén KBr trong vùng 4000-600cm-1. Các m u rắn được phân tán trong KBr đã sấy hô với t lệ 1:200 rồi ép ưới ạng film mỏng ưới áp lực cao có hút chân hông để loại bỏ hơi ẩm.
Phổ hối (MS): phổ hối lượng các chất được ghi tại Khoa Hóa, Trường Đại học KHTN H Nội với chế độ đo EI v Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam với chế độ đo ESI.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1
H-NMR, 13C-NMR) được ghi trên máy Bru er V-500 tại Viên H n lâm Khoa học v Công nghệ Việt Nam ùng DMSO l m ung môi, chất chuẩn nội l tetramethylsilan (TMS).
2.3.3. Thử tác dụng độc t nh tế o in itro
Th hoạt t nh háng tế b o ung thư (độc t nh tế b o) in vitro được thực hiện tại hoa Dược, Trường Đại học uốc gia Chungbu , Cheongju, H n uốc theo phương pháp MTT v giá trị IC50 được t nh trên phần mềm GraphPad Prism.
Dòng tế b o th nghiệm: tế b o ung thư đại tr ng (SW620). Dòng tế b o ung thư được s dụng từ Ngân h ng tế b o ung thư của Viện nghiên cứu sinh học v công nghệ sinh học H n uốc (KRIBB) v được nuôi cấy trong môi trường DMEM (Dulbecco s mo ifie ) hoặc RPMI bổ sung 10 FBS (huyết thanh b o thai bò).
Độc t nh tế b o của các chất được th bằng phương pháp MTT theo các bước sau:
ư c hu n ị
Các tế b o ở pha logarit được tripsin hóa v phân tán v o hỗn ịch đơn tế b o trong môi trường DMEM hoặc RPMI bổ sung 10 FBS. Điều chỉnh nồng độ hoảng 1,5x104 đến 3,5x104 tế b o, sau đó chia đều v o các giếng của đĩa 96 giếng, mỗi giếng 200 L, các đĩa sau đó được ủ ở 37oC trong điều iện 5% CO2.
Sau 2 giờ ủ, các m u th được chuẩn bị trong 20 L môi trường DMEM/RPMI bổ sung 10 FBS từ ung ịch gốc 10 mg/mL trong dimethyl sulfoxid (DMSO) rồi thêm 2 L m u th v o các giếng ở nhiều nồng độ hác nhau. Các đĩa n y sau đó được ủ thêm 8 giờ. Tất cả các m u được chuẩn bị sau cho nồng độ cuối cùng của DMSO hông quá 0,1%.
ư c Tiến h nh th
Sau 8 giờ ủ, thêm v o mỗi giếng 20 L thuốc nhuộm MTT (nồng độ MTT 5 mg/ mL trong muối đệm phosphat – PBS). Các đĩa được ủ thêm 3 giờ ở 37oC trong điều iện 5% CO2. Tiếp theo mỗi giếng được cho 100 µL dung dịch DMSO, để 5 phút cho MTT formazan được hòa tan. Độ hấp thụ được đọc ở bước sóng 510 nm.
Giá trị IC50 l nồng độ của m u th m ở đó, độ hấp thụ giảm đi 50 so với nhóm chứng (trắng âm t nh l giếng chỉ thêm môi trường nuôi cấy). Kết quả cuối cùng l giá trị trung bình của lần đo độc lập với giá trị độ hấp thụ khác nhau hông quá 5 . Giá trị IC50 được t nh ựa trên phần mềm GraphPa Prism. Trong phương pháp th n y, IC50 20 g/mL được coi l có hoạt t nh.
2.3. . Đánh giá ức độ giống thuốc củ các ẫn chất tổng hợ được.
T nh giá trị logP của các n chất tổng hợp được bằng phần mềmEPIsuite. uy trình bao gồm vẽ cấu trúc 2D, tạo Smiles notation bằng phần mềm Chems etch .0 của CD labs sau đó đưa Smile notation v o phầm mềm
EPIsuite để t nh các giá trị logP.
Đánh giá mức độ giống thuốc của các n chất ựa trên quy tắc Lipins y - Khối lượng phân t của chất phải nhỏ hơn 500 g/mol.
- Số trung tâm nhận liên ết hy ro (N, O) phải nhỏ hơn 10. - Số trung tâm cho liên ết hy ro (NH, OH) phải nhỏ hơn 5. - Cân bằng giữa t nh thân nước/ ầu: logP <5.
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1.HÓA HỌC
3.1.1. Tổng hợp hóa học
Quá trình tổng hợp 4 chất trong khóa luận n y được tiến h nh theo sơ đồ 3.1 OH O Cl + NH2 NH2 S iv S NH O NH H+ S NH O O R S Cl O O i R S NH O O Br R S NH O O O CHO ii R S NH O O O S N H O O ii i
Sơ đồ 3.1:Quy trình tổng hợp chung
Tác nhân v điều kiện: i) 2-bromoethanamin, DMF, TEA, 25o
C, 24h; ii) p-hydroxy benzaldehyd, MeOH, K2CO3, 80oC, 24h; iii) thiazolidin-2,4-dion, EtOH, piperazin, 80oC, 24h; iv) HCl, H2O, 100oC, 2h. 3.1.1.1. Tổng hợp thiazolidin-2,4-dion Sơ đồ phản ứng: OH O Cl + NH2 NH2 S iv S NH O NH H+ S NH O O
Sơ đồ 3.2: Quy trình tổng hợp thiazolidin-2,4-dion
Tác nhân v điều kiện :iv) HCl, H2O, 100oC, 2h.
Tiến hành phản ứng:
thioure vào bình cầu 500 ml. Thêm tiếp 100 ml nước cất, lắp sinh h n, đun hồi lưu bằng bếp điện có áo bọc.
- Sau khi dung dịch sôi khoảng 1h, rót tiếp 10 ml HCl 10% qua sinh hàn vào bình cầu. Tiếp tục hồi lưu thêm 2h nữa.
- Kiểm tra phản ứng bằng TLC với pha động DCM:MeOH:AcOH = 90:10:1.
Xử lý hỗn hợ thu được:
- Rót hỗn hợp phản ứng vào cốc có mỏ, để vào tủ lạnh, sẽ xuất hiện các tinh thể.
- Để kết tinh lạnh trong 24h.
- Lọc tủa qua phễu lọc Buchner, r a 2 lần với 50ml nước cất lạnh.
- Tẩy màu: chất rắn sau hi thu được, được hòa tan trong 50ml nước nóng, thêm 50 mg than hoạt, ùng đũa thủy tinh khấy nóng 10 phút. Lọc qua phễu lọc Buchner, r a 2 lần với 10ml nước nóng. Dịch lọc thu được đổ vào cốc có mỏ, để vào tủ lạnh trong 24h. Sản phẩm sẽ kết tinh, màu trắng ánh vàng. Lọc dung dịch qua phễu lọc Buchner, r a tủa 3 lần với 10ml nước lạnh.
Kết quả:
Hiệu suất: 72% (8.4g).
Cảm quan: tinh thể màu trắng .
Tonc: 124.5-126.2oC.
3.1.1.2.Tổng hợp (Z)-N-(3-(4-((2,4-dioxothiazolidin-5-yliden)methyl) phenoxy) propyl)benzensulfonamid (4a)
Để tổng hợp chất 4a chúng tôi tiến hành quy trình phản ứng gồm 4 giai đoạn tương tự trong sơ đồ phương pháp chung.
S Cl O O S NH O O Br N H2 Br + i Sơ đồ 3.3: Quy trình tổng hợp chất 2a
Tác nhân và điều kiện : i) DMF, TEA, 25oC, 24h.
Tiến hành phản ứng
-Cho 0.3ml d= 1.184g/ml (2mmol) benzensulfoclorid (1a), 2ml DMF vào bình cầu dung tích 50ml, làm lạnh dung dịch bằng nước đá.
-Thêm 482 mg (2.2 mmol) 3-bromopropanamin hydrobromid vào bình cầu.
- Tiếp tục thêm từ từ 0.6ml TEA, lắc đều trong hỗn hợp nứơc đá sao cho màu của dung dịch hông được đậm lên.
-Phản ứng được tiến hành trong nhiệt độ phòng, kết hợp khuấy từ, thời gian 24h.
- Kiểm tra phản ứng bằng TLC với pha động DCM:MeOH = 40:1.
Xử lý hỗn hợ thu được:
- Thêm dần 10ml dung dịch nước lạnh, tiếp tục acid hóa với 10ml dung dịch HCl 5% (kiểm tra bằng giấy quỳ vạn năng).
- Chiết thu sản phẩm 3 lần bằng dung môi dicloromethan , mỗi lần 5-10ml dung môi. Thu lớp dung môi, làm khan bằng Na2SO4. Gộp dịch chiết của 3 lần.
- Cất quay thu hồi dung môi bằng máy cất quay chân không ở 40oC đến hi thu được sản phẩm.
- Sấy sản phẩm ở 60oC trong 4h.
Kết quả:
Hiệu suất: 75% ( 0.41g)
Tonc : 123,2-125,4oC. b. Tổng h p chất 3a S NH O O Br S NH O O O CHO ii O H CHO + Sơ đồ 3.4: Quy trình tổng hợp chất 3a
Tác nhân v điều kiện: ii) MeOH, Na2CO3, 80oC, 24h.
Tiến hành:
- Cân hỗn hợp phản ứng gồm 240mg (2 mmol)p-hydroxyl benzaldehyd cùng 220mg K2CO3 vào trong bình cầu 50ml.
- Thêm tiếp 10ml dung môi MeOH và gia nhiệt lên 80oC. Quá trình hoạt hóa diễn ra trong vòng 30-60 phút.
- Hòa tan 1 mmol (0,28g) tinh thể N-(3-bromopropyl)benzen sulfonamide (2a) trong 10ml ung môi MeOH, ùng pipet hút v đưa từ từ vào dung dịch đã được hoạt hóa. Giữ nhiệt độ ở 80oC, khấy từ, hồi lưu trong khoảng 24h.
- Kiểm tra phản ứng bằng TLC với pha động DCM:MeOH= 40:1.
Xử lý hỗn hợp phản ứng:
- Cất thu hồi bớt dung môi bằng máy cất quay ở nhiệt độ 40oC. - Thêm từ từ 20ml dung dịch aci HCl 5 đã được làm lạnh vào hỗn hợp phản ứng, ùng đũa thủy tinh khuấy đều, xuất hiện tủa màu trắng ngà.
- Lọc tủa qua phễu thủy tinh, r a 3 lần với 15ml nước cất nóng đến khi dịch lọc trung tính (th với giấy quỳ vạn năng). Sấy khô tủa ở 60o
C trong khoảng 24h.
Hiệu suất: 60% (0.41mg). Cảm quan: tinh thể trắng ngà. Tonc: 188,0-190,9oC. c.Tổng h p chất 4a S NH O O O CHO S NH O O O S N H O O iii S N H O O + Sơ đồ 3.5: Quy trình tổng hợp chất 4a
Tác nhân v điều kiện: iii) EtOH, piperazin, 80o
C, 24h.
Tiến hành:
- Cân 200mg chất 3a cùng với 120mg thiazolidin-2,4-dion vào bình cầu 50ml.
-Thêm tiếp 5ml EtOH khan và 0.12ml piperazin vào binh cầu. - Gia nhiệt 80oC, khuấy từ, lắp sinh hàn, hồi lưu trong 24h.
-Kiểm tra phả ứng bằng TLC với pha động DCM: MeOH:AcOH= 90:5:1.
Xử lý hỗn hợp phản ứng:
- Cất thu hồi bớt dung môi bằng máy cất quay ở nhiệt độ 40oC. - Đổ hỗn hợp phản ứng ra cốc có mỏ đã có sẵn 10ml HCl 5 được làm lạnh, tạo tủa màu vàng.
- Lọc tủa, r a tủa bằng nước lạnh tới khi dịch lọc trung tính. - Sản phẩm được kết tinh lại trong dung môi EtOH. Tinh thể thu được đem sấy khô ở 60o
C trong 48 giờ.
Kết quả:
Hiệu suất: 91% (0.38g).
Cảm quan: tinh thể màu vàng .
Dữ liệu phổ được trình bày ở bảng 3.3, 3.4, 3.5, 3.6.
3.1.1.3.Tổng hợp (Z)-N-(3-(4-((2,4-dioxothiazolidin-5-yliden)methyl) phenoxy)propyl)-4-methylbenzenesulfonamid (4b)
a. Tổng h p chất 2b
Quy trình tiến h nh tương tự với quy trình tổng hợp chất 2a, đi từ 0.40g (2mmol) chất 4-methylbenzen-1-sulfonyl chlorid (1b). Kết quả như sau:
Hiệu suất: 79% (0.46g).
Cảm quan: tinh thể màu trắng ánh vàng
Tonc: 135,6-137,1oC.
b. Tổng h p chất 3b
Chất N-(3-(4-formylphenoxy)propyl)-4-methylbenzensulfonamid (3b) được tổng hợp từ 0.30g (1mmol) N-(3-bromopropyl)-4-methylbenzen
sulfonamid (2b) với p-hy roxybenzal ehy theo phương pháp tương tự như tổng hợp chất 3a. Kết quả như sau:
Hiệu suất: 61% (0.20g).
Cảm quan: tinh thể màu trắng .
Tonc: 199,1-201,6oC
c. Tổng h p chất 4b
Chất N-(3-(4-((2,4-dioxothiazolidin-5-yliden)methyl)-2-methyl phenoxy) propyl)-4-methylbenzensulfonamid (4b) được tổng hợp từ 0.32g (1mmol) chất N-(3-(4-formylphenoxy)propyl)-4-methylbenzensulfonamid (3b). Quá trình tổng hợp tương tự như tổng hợp chất 4a. Kết quả như sau:
Hiệu suất: 90% (0.38g).
Cảm quan: tinh thể màu vàng.
Tonc : 250,6-251,3 oC.
Dữ liệu phổ được trình bày ở bảng 3.3, 3.4, 3.5, 3.6.
phenoxy)propyl)-4-methoxylbenzensulfonamid (4c)
a. Tổng h p chất 2c
Quy trình tiến h nh tương tự với quy trình tổng hợp chất 2a, đi từ 0.42g (2mmol) chất 4-methoxybenzen-1-sulfonylchlorid (1c). Kết quả như sau:
Hiệu suất: 81% (0.49g).
Cảm quan: tinh thể màu vàng.
Tonc : 140,1-142,7 oC.
b. Tổng h p chất 3c
Chất N-(3-(3-formylphenoxy)propyl)-4-methoxybenzensulfonamid (3c) được tổng hợp từ 0.31g (1mmol) N-(3-bromopropyl)-4-methoxybenzen sulfonamid (2b) và p-hy roxybenzal ehy . Phương pháp tổng hợp tương tự như với chất 3a. Kết quả như sau:
Hiệu suất: 62% (0.21g).
Cảm quan: tinh thể màu trắng ngà.
Tonc : 205,6-207,8oC
c. Tổng h p chất 4c
Chất(Z)-N-(3-(4-((2,4-dioxothiazolidin-5-yliden)methyl)phenoxy)
propyl)-4-methoxybenzensulfonamid (4c) được tổng hợp từ 0.34g (1mmol) chất N-(3-(4-formylphenoxy)propyl)-4-methoxybenzensulfonamid (3c) và thiazolidin-2,4-dion. Quy trình tổng hợp tương tự như với chất 4a. Kết quả như sau:
Hiệu suất: 89% (0.39g).
Cảm quan: tinh thể màu vàng nhạt.
Tonc: 260,6-261,7oC
Dữ liệu phổ được trình bày ở bảng 3.3, 3.4, 3.5, 3.6.
3.1.1.5. Tổng hợp (Z)-N-(3-(4-((2,4-dioxothiazolidin-5-yliden)methyl) phenoxy) propyl)-4-clorobenzensulfonamid (4d)
a. Tổng h p chất 2d
Quy trình tiến h nh tương tự với quy trình tổng hợp chất 2a, đi từ 0.42g (2mmol)chất 4-clorobenzen-1-sulfonylchlorid (1d). Kết quả như sau:
Hiệu suất: 70% (0.43g).
Cảm quan: tinh thể màu vàng.
Tonc: 143,5-145,7oC.
b. Tổng h p chất 3d
Quá trình tổng hợp chất N-(3-(4-formylphenoxy)propyl)-4-cloro- benzensulfonamid (3d) đi từ 0.31g (1mmol) chất N-(3-bromopropyl)-4- chlorobenzensulfonamid (2d) cùng với 4-hydroxy benzaldehyd. Quá trình tổng hợp tương tự như với chất 3a. Kết quả như sau:
Hiệu suất: 59% (0.2g).
Cảm quan: tinh thể màu vàng nhạt.
Tonc: 202,5-203,9oC.
c. Tổng h p chất 4d
Chất N-(3-(4-((2,4-dioxothiazolidin-5-yliden)methyl)phenoxy)propyl) - 4-cloro-benzensulfonamid (4d) được tổng hợp từ 0.34g (1mmol) chất N-(3- (4-formylphenoxy)propyl)-4-clorobenzensulfonamid (3d) và thiazolidin-2,4- dion. Quá trình tổng hợp diễn ra tương tự như tổng hợp chất 4a. Kết quả như sau:
Hiệu suất: 88% (0.39g).
Cảm quan: tinh thể m u v ng đậm.
Tonc: 232,7-233,6oC.
Dữ liệu phổ được trình bày ở bảng 3.3, 3.4, 3.5, 3.6.
Dưới đây l bảng tổng hợp các chỉ số lý hóa và hiệu suất tổng hợp của các chất 4a-d:
Bảng 3.1: Hiệu suất và các chỉ số hóa lý của các sản phẩm đư c tổng h p R S NH O O O S N H O O
CHẤT R MÀU SẮC HIỆU SUẤT(%)
4a H Vàng xỉn 91
4b 4-CH3 Vàng nhạt 90
4c 4-OCH3 Vàng nhạt 89
4d 4Cl V ng đậm 88
3.1.2. Kiể tr độ tinh khiết
Độ tinh khiết của các chất 4a-4b-4c-4d được kiểm tra bằng sắc kí TLC và đo nhiệt độ nóng chảy (Tonc) của chúng.
Sắc kí lớp mỏng (TLC): được tiến hành trên bản mỏng nhôm tráng silicagel Merck 70-230 mesh, quan sát vết sắc ưới đèn t ngoại bước sóng 254 nm. Dung môi hòa tan các chất là aceton. Kết quả thu được trên sắc đồ đều cho thấy một vết gọn, rõ hi soi ưới ánh sáng đèn t ngoại.
Đo n iệ độ nóng chảy: các chất sau hi được tinh chế bằng cách kết tinh lại đều có dạng tinh thể rắn được đo điểm nóng chảy bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện (Electrothermal digital). Nhiệt độ nóng chảy của các chất dao dộng trong khoảng 1-2oC.
Như vậy từ kết quả chạy sắc ký lớp mỏng v đo nhiệt độ nóng chảy của 4 d n chất 4a-d, chúng tôi khẳng định các chất tổng hợp được là tinh khiết và có thể s dụng để đo phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR
Bảng 3.2: Giá trị Rf và tonc của các sản phẩm cuối 4a-4d Chất R Ph động Rf Tonc(oC) 4a H DCM:MeOH= 9:1 0.40 230,6-231,9 4b 4-CH3 DCM:MeOH= 9:1 0.40 250,6-251,3 4c 4-CH3O DCM:MeOH= 9:1 0.39 260,6-261,7 4d 4-Cl DCM:MeOH= 9:1 0.41 232,7-233,6 3.1.3. Xác định cấu trúc
Để khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp được chúng tôi tiến hành ghi phổ khối lượng (MS) của d n chất aldehyd trung gian và ghi phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ proton (1H-NMR), phổ cộng hưởng từ carbon (13C-NMR) của các sản phẩm cuối. Kết quả phổ của các chất được trình bày cụ thể ở phần phân tích phổ và phụ lục.
Kết quả phân tích phổ các sản phẩm cuối 4a-d:
a) Phổ hồng ngoại IR
Bảng 3.3:Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của các chất 4a-d
R S NH O O O S N H O O CHẤT R Số sóng (cm-1) ứng với các o động
νC-O νC=C(Ar) νC=O νC-H(Ar) νCH(alken) νNH
4a H 1264 1604 1569;1514 1742 1694 2937 3243 3519 4b 4-CH3 1266 1594 1568;1513 1735 1691 3121 3291 3445 4c 4-OCH3 1269 1569 1588;1566 1736 1690 3970 3121 3293
4d 4-Cl 1254 1596 1571;1510
1741
1695 3036 3274 3446
Ghi chú: ν là dao động hóa trị
Nhận xét: Từ dữ liệu phổ IR bảng 3.4 và phổ đồ (phụ lục 5-8) cho thấy các chất đều có số sóng đặc trưng với các ao động của các nhóm liên kết.