2.3.1. Xác định tính đúng của các dược liệu
- Mô tả hình thái dược liệu: Quan sát, mô tả đặc điểm bên ngoài, mùi, vị dược liệu, đối chiếu với tiêu chuẩn DĐVN IV.
- Định tính bằng phản ứng hóa học.
2.3.2. Nghiên cứu thành phần hóa học chế phẩm Tọa An.
Định tính:
- Kiểm tra sự có mặt của một số nhóm chất chính trong chế phẩm bằng các phản ứng hóa học.
- Kiểm tra sự có mặt của dược liệu trong chế phẩm bằng SKLM.
Định lượng cắn phân đoạn EtOAc bằng phương pháp cân
Lấy chính xác một lượng bột thuốc. Loại tạp và chiết kiệt với EtOAc. Gộp dịch chiết và cô cách thủy tới cắn. Sấy khô cắn ở nhiệt độ thấp tới khối lượng không đổi, cân cắn và tính kết quả hàm lượng cắn theo công thức (1).
% F= ắ
. x 100 (1)
Trong đó: %H: hàm lượng cắn chiết được phân đoạn EtOAc. mcắn: khối lượng chất chiết được.
mb.th: khối lượng bột thuốc.
Tiến hành song song 3 mẫu để lấy kết qủa trung bình .
Định lượng rutin, quercetin trong chế phẩm Tọa An bằng HPLC
Tiến hành theo chương trình HPLC định lượng các flavonol trong viên Gingko biloba [27].
Hàm lượng rutin, quercitin tính trên viên tính theo công thức (2):
Trong đó:V là hàm lượng rutin, quercetin trong viên (kl/viên). mc, mt lần lượt là khối lượng cân của chất đối chiếu và chất thử. St, Sclần lượt là diện tích peak của mẫu thử và mẫu đối chiếu h là hàm lượng chất đối chiếu
f là tỷ lệ hệ số pha loãng của mẫu đối chiếu và mẫu thử mtbv : khối lượng trung bình viên thuốc
Hàm lượng phần trăm theo khối lượng rutin, quercetin(X%) trong viên tính theo công thức (3):
2.3.3. Thử tác dụng dược lý
2.3.3.1.Thử tác dụng cầm máu
Chuột nhắt trắng được chia thành 3 lô[3], [22]: - Lô chứng: uống nước muối sinh lý.
- Lô TA1: uống Toạ An mức liều 1.25g/kg chuột. - Lô TA 2: uống Toạ An mức liều 2.50 g/kg chuột.
Cho chuột uống nước muối sinh lý hoặc thuốc nghiên cứu trong 5 ngày liên tục.Ngày thứ 5, sau khi uống thuốc 1 giờ, gây mê cho chuột bằng tiêm màng bụng thiopental liều 30mg/kg chuột. Khi chuột đã mê, cắt đuôi chuột 2mm tính từ chóp đuôi, nhúng ngay vào nước ấm 37oC, xác định thời gian máu chảy bằng đồng hồ bấm giây.
Thông số nghiên cứu:
- Thời gian chảy máu: được tính từ khi máu bắt đầu chảy cho tới khi máu ngừng chảy.
- Mức độ rút ngắn thời gian chảy máu của lô thử so với lô chứng theo công thức (4).
X (%) = × 100 (4)
Trong đó: X (%): mức độ rút ngắn thời gian chảy máu của lô thử so với lô chứng. Tc: thời gian chảy máu trung bình của lô chứng.
Tt: thời gian chảy máu trung bình của lô thử.
Để đánh giá tác dụng chống viêm cấp của viên nang Toạ an, chúng tôi đã sử dụng mô hình gây phù bằng carrageenan theo Winter và cộng sự[3], [12], [22], [46], [47].
Chuột cống trắng sau khi nuôi ổn định 3 ngày trong điều kiện phòng thí nghiệm, được chia ngẫu nhiên thành 4 lô, thiết kế như sau:
- Lô chứng: uống nước muối sinh lý 1ml/100g chuột. - Lô indomethacin: uống indomethacin liều10mg/kg chuột. - Lô TA 1: uống cốm ToạAn 1.25g/kg chuột.
- Lô TA 2: uống cốm Toạ An 2.5g/kg chuột.
Ở tất cả các lô nghiên cứu, chuột được cho uống nước muối sinh lý, thuốc đối chiếu hoặc chế phẩm nghiên cứu với cùng thể tích 1 ml/100g chuột liên tục trong 5 ngày. Ngày thứ năm, sau khi chuột uống nước muối sinh lý, thuốc đối chiếu hoặc chế phẩm nghiên cứu, chuột được tiêm 0,05ml carrageenan 1% trong nước muối sinh lý vào gan bàn chân sau phải. Sử dụng máy đo độ phù Plethysmometer (UGO BASILE) để đo thể tích bàn chân sau phải của từng chuột tại thời điểm 1 giờ, 3 giờ, 5 giờ, 7 giờ sau khi gây viêm.Quy trình tiến hành thí nghiệm được mô tả ở hình 2.1.
Kĩ thuật đo độ phù bàn chân chuột
Dùng bút đánh dấu cố định mặt bên khớp gối chân sau phải của chuột. Nhúng bàn chân sau phải vào dung dịch đo đến đúng vị trí đã đánh dấu, đọc kết quả hiển thị trên thiết bị đo. Kĩ thuật đo được thực hiện bởi cùng một kĩ thuật viên và là phép đo mù.
- Chỉ tiêu quan sát: Thể tích bàn chân sau phải của chuột. - Chỉ tiêu đánh giá:
+ Độ phù bàn chân chuột được tính theo công thức (5) ΔV (%)= × 100 (5)
Trong đó:ΔV: độ phù bàn chân chuột tại thời điểm t giờ sau khi gây viêm. Vo, Vt: thể tích bàn chân chuột trước khi gây viêm và thời điểm t.
t o
o V V
V
+ Phần trăm ức chế phù của các lô thử so với lô chứng được tính theo công thức (6):
I (%) = × 100 (6)
Trong đó:I (%): phần trăm ức chế phù của lô thử so với lô chứng. ΔVc: độ phù chân chuột trung bình của lô chứng.
ΔVt: độ phù chân chuột trung bình của lô thử.
Hình 2.1. Qui trình thí nghiệm tác dụng chống viêm cấp trên mô hình gây phù bàn chân chuột
2.2.3.3.Xử lý số liệu
Các số liệu thử nghiệm dược lý ( 2.2.3.1, 2.2.3.2) đượcbiểu diễn dưới dạng M±SE ( M: là giá trị trung bình, SE: sai số chuẩn). So sánh giá trị trung bình giữa các lô bằng one-way ANOVA, dùng hậu kiểm Dunnett test để so sánh giá trị trung bình của các lô thử so với lô chứng. Phân tích thống kê bằng phần mềm SPSS 16.0. Sự khác biệt giữa các lô thử có ý nghĩa thống kê khi p< 0.05.
c t c V V V Nhịn ăn - Uống thuốc - Gây viêm V0 V1 V3 V5 ---1,5 giờ---
CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM, KẾT QỦA, BÀN LUẬN 3.1. Thực nghiệm, kết quả
3.1.1. Xác định tính đúng các dược liệu 3.1.1.1. Diếp cá
a) Đặc điểm hình thái
Thân hình trụ tròn hay dẹt, cong, dài 20 – 35cm, đường kính 2 – 3mm. Mặt ngoài màu vàng nâu nhạt, có vân dọc nhỏ và có mấu rõ. Chất giòn, dễ gãy. Lá mọc so le, hình tim, đầu lá nhọn, phiến lá gấp cuộn lại, nhàu nát, cuống đính ở gốc ládài chừng
2 – 3cm, gốc cuống rộng thành bẹ mỏng. Mùi tanh cá. Vị hơi chát, se(Hình 3.1).
Nhận xét: Phù hợp với mô tảdược liệu diếp cá trong DĐVN IV [10].
Hình 3.1. Ảnh dược liệudiếp cá
b)Đặc điểm bột
Bột màu lục vàng, vị hơi mặn, hơi cay, mùi tanh.Soi trên kính hiển vi thấy: Mảnh biểu bì trên và biểu bì dưới gồm tế bào hình nhiều cạnh thành hơi dày, mang tế bào tiết (1,2). Biểu bì dưới có lỗ khí, tế bào tiết tròn, chứa tinh dầu màu vàng nhạt hay vàng nâu, bề mặt có vân, xung quanh có 5-6 tế bào xếp toả ra (2). Lỗ khí có 4-5 tế bào kèm nhỏ hơn (2).Lông che chở đa bào(6).Hạt tinh bột hình trứng, hình tròn hay hình chuông(3). Mảnh thân gồm tế bào hình chữ nhật thành mỏng và tế bào tiết(5). Mảnh mạch xoắn (4)(Hình 3.2).
Nhận xét: Phù hợp với mô tả bột diếp cá trong DĐVN IV [10].
c) Định tính
Quan sát thân và bột lá dưới đèn tử ngoại thấy phát quang màu nâu hung.
Định tính bằng phản ứng hóa học:
- Lấy khoảng 1g bột dược liệu vào ống nghiệm, dùng đũa thuỷ tinh ấn chặt xuống, thêm vài giọt dung dịch fuchsin đã khử màuđể làm ướt bột ở phía trên, để yên một lúc.
Kết quả: Bột ướt có màu hồng (phản ứng dương tính).
- Lấy 1g bột dược liệu, thêm 10ml EtOH, đun hồi lưu trên cách thuỷ 10 phút, lọc. Lấy 2ml dịch lọc, thêm ít bột Magnesi và 3 giọt HCl, đun nóng trên cách thuỷ. Kết quả: Xuất hiện màu đỏ (phản ứng dương tính).
Nhận xét: Các hiện tượng phù hợp với mô tả trong DĐVN IV[10].
3.1.1.2. Trắc bách diệp a)Đặc điểm hình thái
Dược liệu phân thành nhiều nhánh, các cành nhỏ dẹt, phẳng. Các lá hình vẩy nhỏ, xếp đối chéo chữ thập, dính sát vào cành, màu xanh lục thẫm hoặc xanh lục hơi vàng. Chất giòn, dễ gãy. Có mùi thơm nhẹ, vị đắng, chát và hơi cay (Hình 3.3)
Nhận xét: Phù hợp với mô tả dược liệu trắc bách diệp trong DĐVN IV [10]
b) Đặc điểm bột
Bột màu xanh lục hơi vàng. Soi dưới kính hiển vi thấy: Các tế bào biểu bì trên của lá hình chữ nhật, thành hơi dày lên (1,2).Tế bào biểu bì dưới hình gần vuông, có nhiều lỗ khí(4). Các tế bào mô mềm chứa các giọt dầu nhỏ (5). Nhiều bó sợi (3) (Hình 3.4).
Hình 3.4. Ảnh đặc điểm bột trắc bách diệp
Nhận xét: Phù hợp với mô tả bột trắc bách diệp trong DĐVN IV [10] .
3.1.1.3. Thăng ma a) Đặc điểm hình thái
Vị thuốc là thân rễ, kích thước không đều. Mặt ngoài màu nâu đen, thô. Chất nhẹ, cứng, giòn. Mặt bẻ gãy không phẳng, có xơ, màu trắng đục. Mùi hắc nhẹ, vị hơi đắng (Hình 3.5).
Nhận xét: Không phù hợp với mô tả dược liệu thăng ma
b) Đặc điểm bột
Bột màu vàng nhạt. Soi dưới kính hiển vi thấy: Khối tinh bột bị hồ hóa(1). Mảnh mạch (2,3). Hạt tinh bột hình đa giác, hình tròn, có rốn hạt, đứng riêng lẻ hay tụ lại thành đám (4,5). Sợi thành dày (6) ( Hình 3.6).
Hình 3.6. Ảnh đặc điểm bột thăng ma
Nhận xét: Không phù hợp với mô tả bột thăng ma do có các khối tinh bột bị hồ hóa, tinh bột có rốn hạt [10].
c) Định tính
Alcaloid [3].
Cân 5g dược liệu, cho vào bình nón dung tích 100ml. Thêm 15ml dd H2SO4 1N. Đun đến sôi, để nguội, lọc. Kiềm hóa dịch lọc bằng dd NH3 6N đến pH= 8 - 9. Cho dịch lọc vào bình gạn. Lắc, chiết với CHCl3 3 lần, mỗi lần 10ml. Gộp các dịch chiết CHCl3, loại nước bằng Na2SO4 khan. Lắc, chiết với H2SO4 1N 3 lần, mỗi lần 10ml. Chia dịch chiết vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml.
- Ống 1: Thêm 2 – 3 giọt thuốc thử Mayer. Kết quả: Không thấy tủa (phản ứng âm tính). - Ống 2: Thêm 2 -3 giọt thuốc thử Bouchardat. Kết quả: Không thấy tủa(phản ứng âm tính). - Ống 3: Thêm 2 -3 giọt thuốc thử Dragendorff
Kết quả: Không thấy tủa(phản ứng âm tính).
Flavonoid [3].
Cân 2g dược liệu. Thêm 20ml EtOH 90%. Đun sôi cách thủy 10 phút, lọc.Thu dịch lọc để làm phản ứng:
- Phản ứng Cyanidin: Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết. thêm một ít bột Magnesi . Nhỏ từ từ 5-6 giọt HCl. Để yên 2 phút.
Kết quả: Dung dịch có màu vàng (phản ứng âm tính).
- Phản ứng với kiềm loãng: Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết. Thêm 3 giọt dd NaOH 10%.
Kết quả: Xuất hiện tủa màu vàng. Thêm 2ml nước cất, tủa tan và màu vàng của dung dịch được tăng nhẹ(phản dương tính).
- Phản ứng với NH3 : Nhỏ 2 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc. Sấy nhẹ đến khô. Hơ trên miệng lọ NH3 đặc.
Kết quả: Màu vàng vết dịch chiết khôngtăng thêm (phản ứng âm tính).
- Phản ứng với FeCl3: Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết. Thêm 2 giọt dd FeCl3
5%.
Kết quả: Không thấy xuất hiện tủa (phản ứng âm tính).
- Phản ứng diazo hóa: Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết. Kiềm hóa bằng dd NaOH 10%. Thêm 2- 3 giọt TT diazo mới pha, lắc đều, đun nóng nhẹ.
Kết quả: Xuất hiện tủa đỏ gạch (phản ứng dương tính).
Saponin [3].
- Hiện tượng tạo bọt: Lấy 2g bột dược liệu, thêm 10ml nước. Bịt đầu ống nghiệm, lắc mạnh 5 phút . Để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt.
Kết quả: Tạo bọt không bền vững(phản ứng âm tính).
- Phản ứng Salkowski: Lấy 2g dược liệu. Thêm 5ml H2SO4 đặc.
Kết quả: Dung dịch chuyển từ màu vàngvàng sang đỏ nhạt (phản ứngdương tính). - Phản ứng Liebermann – Burchardt: Lấy 2g dược liệu.Thêm 10ml nước. Đun sôi, lọc. Cho dịch lọc vào ống nghiệm, cô tới cắn. Thêm 1ml anhydrid acetic, lắc đều
cho tan hết. Nghiêng ống nghiệm 450, cho từ từ theo thành ống 0.5ml H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống nghiệm.
Kết quả: Không thấy xuất hiện vòng màu ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng(phản ứng âm tính).
Coumarin [3].
Chuẩn bị mẫu thử: Lấy 5g dược liệu. Thêm 30ml EtOH 90%. Đun sôi cách thủy 15 phút, lọc nóng. Dịch lọc tiến hành các phản ứng:
- Phản ứng đóng mở vòng lacton: Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 2ml dịch chiết: + Ống 1: Thêm 0.5ml dd NaOH 10%
+ Ống 2: Để nguyên
Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi, để nguội. Quan sát thấy: + Ống 1: Tủa đục vàng nhạt
+ Ống 2: Trong
Thêm vào mỗi ống nghiệm 2ml nước cất, lắc đều, thấy: + Ống 1: Trong suốt
+ Ống 2: Tủa đục
Thêm vài giọt HCl vào ống 1, xuất hiện tủa đục trở lại như ống 2 Kết quả: Phản ứng dương tính.
- Phản ứng diazo hóa: Cho vào ống nghiệm 1ml dịch lọc. Thêm 2ml dd NaOH 10%. Đun cách thủy 10 phút, để nguội. Thêm vài giọt thuốc thử diazo mới pha. Kết quả: Xuất hiện màu đỏ gạch (phản ứng dương tính).
- Phát huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại: Nhỏ 2 giọt dịch lọc lên giấy lọc. Nhỏ tiếp 3 giọt dd NaOH 10%, sấy nhẹ đến khô. Che nửa vết bằng đồng xu. Soi dưới đèn tử ngoại vài phút, bỏ đồng xu ra, thấy phần không bị che sáng hơn phần bị che. Tiếp tục chiếu sáng thấy 2 phần có huỳnh quang giống nhau.
Kết quả: Có huỳnh quang sáng (phản ứng dương tính).
Tanin [3].
Chuẩn bị mẫu thử: Cân 3g dược liệu. Thêm 20ml nước cất. Đun cách thủy 3 phút, lọc lấy dịch. Dịch lọc cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 2ml để tiến hành phản ứng:
- Ống 1: Thêm 2 giọt FeCl 5%.
Kết quả: Không xuất hiện tủa (phản ứng âm tính). - Ống 2: Thêm 2 giọt chì acetat 10%.
Kết quả: Xuất hiện kết tủa bông trắng (phản ứng dương tính). - Ống 3: Thêm 5 giọt gelatin 1%.
Kết quả: Không thấy xuất hiện tủa bông trắng (phản ứng âm tính).
Acid amin
Cân 5g dược liệu. Thêm 30ml nước cất, đun sôi 10 phút, lọc lấy dịch. Lấy 2ml dịch lọc, thêm 3ml TT Ninhydrin 3%, đun cách thủy trong 2 – 3 phút.
Kết quả: Xuất hiện màu tím sẫm (phản ứng dương tính).
Đường khử
Cân 5g dược liệu. Thêm 15ml nước cất. Đun cách thủy 10 phút. Để nguội, lọc. Cho vào ống nghiệm 2ml dịch lọc, 1ml TT Fehling A và 1ml TT Fehling B . Lắc kĩ, đun sôi cách thủy 10 phút.
Kết quả: Xuất hiện tủa đỏ gạch (phản ứng dương tính).
Polysaccharid
Cân 5g dược liệu. Thêm 30ml nước cất, đun sôi 2-3 phút, lọc lấy dịch, để nguội. Lấy 2ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm 2 giọt TT Lugol.
Kết quả: Dung dịch chuyển màu xanh đen(phản ứng dương tính).
Glycosid tim [3].
Cân 5g dược liệu. Thêm 30ml EtOH 25%. Ngâm 24h, lọc lấy dịch. Thêm vào dịch lọc 3ml dd chì acetat cho đến dư, khuấy đều, lọc lấy dịch. Lắc dịch lọc với CHCl3 2 lần, mỗi lần 5ml. Chiết lấy lớp CHCl3 , cho vào các ống nghiệm nhỏ, cô tới cắn. - Phản ứng Liebermann – Burchard: Thêm vào ống nghiệm 1ml anhydrid acetic, để nghiêng 450 , cho từ từ theo thành ống 0.5ml H2SO4 đặc.
Kết quả: Ở mặt tiếp xúc giữa hai chất lỏng có không thấy vòng màu (phản ứng âm tính).
- Phản ứng Baljet: Thêm vào 1ml EtOH 90%, lắc đều cho tan hết, nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha.
Kết quả: Dung dịch màu vàng, không đậm hơn khi so với ống chứng (phản ứng âm tính).
- Phản ứng Keller – Kiliani: Thêm vào 0.5ml EtOH 90%, lắc đều cho tan hết. Thêm vài giọt dd FeCl3 5%/ acid acetic, lắc đều, nghiêng ống nghiệm 450, thêm từ từ theo thành ống 0.5 ml H2SO4 đặc.
Kết quả: Ở mặt tiếp xúc 2 chất lỏng không thấy xuất hiện vòng màu (phản ứng âm tính).
Acid hữu cơ:
Cân 2g dược liệu. Thêm 20ml nước cất, đuncách thủy 5 phút. Lọc lấy dịch, để nguội. Lấy 2ml dịch lọc cho vào ống nghiệm. Thêm một lượng nhỏ Na2CO3, lắc nhẹ.
Kết quả: Không thấy có bọt khí (phản ứng âm tính).
Nhận xét: Trong dược liệu thăng ma này chứa các nhóm chất: Coumarin, đường khử, polysaccharid, acid amin (Bảng 3.1. tr.38).
3.1.1.4. Hòe hoa a) Đặc điểm hình thái
Nụ hoa hình trứng có cuống nhỏ, ngắn, một đầu hơi nhọn, dài 3 - 6 mm,