a. Phổ đạo hàm bậc 1
Với CP: Tiến hành khảo sát mối quan hệ giữa giá trị PĐH bậc 1 và nồng độ CP (10 - 35 mg/l) tại λ = 286,0 nm. Kết quả thể hiện ở Bảng 3.1 và Hình 3.5.
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của CP với giá trị PĐH bậc 1
Nồng độ (mg/l) Giá trị PĐH bậc 1 10 – 0,543 15 – 0,836 20 – 1,089 25 – 1,371 30 – 1,640 35 – 1,899 y = –0,0541x –0,0116 r = –0,9998 -2,5 -2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 5 10 15 20 25 30 35 40 Giá trị PĐH bậc 1 Nồng độ (mg/l)
Với SB: Tiến hành khảo sát mối quan hệ giữa giá trị PĐH bậc 1 và nồng độ SB (10 - 35 mg/l) tại λ = 228,0 nm. Kết quả thể hiện ở Bảng 3.2 và Hình 3.6.
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của SB với giá trị PĐH bậc 1
Nồng độ (mg/l) Giá trị PĐH bậc 1 10 – 0,141 15 – 0,218 20 – 0,283 25 – 0,358 30 – 0,427 35 – 0,500 y = –0,0143x –0,0001 r = –0,9998 -0,6 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0,0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Gi á trị PĐH bậc 1 Nồng độ (mg/l)
b. Phổ đạo hàm tỷ đối
Với CP: Tiến hành khảo sát mối quan hệ giữa giá trị PĐHTĐ bậc 1 và nồng độ CP (10 - 35 mg/l) tại λ = 260,9 nm. Kết quả thể hiện ở Bảng 3.3 và Hình 3.7.
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của CP với giá trị PĐHTĐ bậc 1
Nồng độ (mg/l) Giá trị PĐHTĐ bậc 1 10 23,646 15 35,721 20 46,128 25 58,499 30 70,279 35 80,954 y = 2,3005x + 0,7769 r = 0,9998 0 20 40 60 80 100 5 10 15 20 25 30 35 40 Giá trị PĐHTĐ bậc 1 Nồng độ (mg/l)
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn đƣờng chuẩn của CP (10 - 35 mg/l) với giá trị PĐHTĐ bậc 1
Với SB: Tiến hành khảo sát mối quan hệ giữa giá trị PĐHTĐ bậc 1 và nồng độ SB (10 - 35 mg/l) tại λ = 236,6 nm. Kết quả thể hiện ở Bảng 3.4 và Hình 3.8.
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của SB với giá trị PĐHTĐ bậc 1
Nồng độ (mg/l) Giá trị PĐHTĐ bậc 1 10 – 0,353 15 – 0,532 20 – 0,699 25 – 0,872 30 – 1,032 35 – 1,193 y = – 0,0336x – 0,0251 r = – 0,9998 -1,4 -1,2 -1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 5 10 15 20 25 30 35 40 Giá trị PĐH TĐ bậ c 1 Nồng độ (mg/l)
Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn đƣờng chuẩn của SB (10 - 35 mg/l) với giá trị PĐHTĐ bậc 1
Tóm lại, mối quan hệ giữa nồng độ của CP và SB với giá trị PĐH, ĐHTĐ tại các bƣớc sóng định lƣợng đƣợc trình bày trong Bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của CP và SB
Phƣơng pháp Hoạt chất Bƣớc sóng (nm) Khoảng tuyến tính (mg/l)
Phƣơng trình hồi quy
Hệ số tƣơng quan r PĐH bậc 1 CP 286,0 10 - 35 Y = 0,0541x 0,0116 0,9998 SB 228,0 10 - 35 Y = 0,0143x 0,0001 0,9998 PĐHTĐ CP 260,9 10 - 35 Y = 2,3005x + 0,7769 0,9998 SB 236,6 10 - 35 Y = 0,0336x 0,0251 0,9998
3.1.1.4. Độ lặp và độ đúng của phƣơng pháp
Độ lặp và độ đúng của phƣơng pháp đƣợc xác định dựa trên kết quả định lƣợng của 6 hỗn hợp tự tạo CP 20 mg/l + SB 20 mg/l trong cùng điều kiện (Bảng 3.6).
Bảng 3.6. Độ lặp và độ đúng của các phƣơng pháp quang phổ đạo hàm
Hàm lƣợng % tìm lại STT PĐH bậc 1 PĐHTĐ CP SB CP SB 1 100,3 100,1 100,2 100,2 2 99,7 101,8 101,8 97,1 3 101,3 100,7 101,9 101,9 4 101,6 102,9 101,6 101,9 5 102,2 102,1 100,5 101,8 6 101,3 105,0 99,9 101,9 TB 101,1 102,1 101,0 100,8 SD 0,9 1,7 0,9 1,9 RSD 0,9 1,7 0,9 1,9
3.1.2. Phƣơng pháp HPLC
3.1.2.1. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu
Dung môi: Nƣớc cất 2 lần loại bỏ ion
Dung dịch chuẩn và dung dịch thử: Các dung dịch chuẩn và thử sau khi đƣợc chuẩn bị nhƣ mô tả trong mục 3.1.1.2 đều đƣợc lọc qua màng có kích thƣớc lỗ lọc 0,20 µm. 3.1.2.2. Xây dựng phƣơng pháp HPLC - Điều kiện sắc ký: Cột: Apollo C18 150 mm x 4,6 mm; 5 µm Detector UV: 210 nm Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút
Pha động: hỗn hợp acetonitril - acid photphoric pH 3,2 (60 : 40, tt/tt) Thể tích tiêm mẫu: 20 µl
- Hình 3.9 biểu diễn sắc ký đồ của hỗn hợp chuẩn CP 20 mg/l + SB 20 mg/l. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Các thông số của quá trình sắc ký đƣợc trình bày trong Bảng 3.7.
Bảng 3.7. Thông số quá trình HPLC của hỗn hợp CP 20 mg/l + SB 20 mg/l STT Thông số CP SB 1 Độ lặp RSD < 2% 99 101% R2 > 0,990 AF = 1,2 2 Độ đúng 3 Khoảng tuyến tính 10 - 35 mg/l 4 Hệ số bất đối 5 Độ phân giải Rs = 12 6 Số đĩa lý thuyết/mét 44000 162000
3.1.3. Kết quả định lƣợng
Kết quả định lƣợng một số chế phẩm thuốc bột pha tiêm hiện đang lƣu hành trên thị trƣờng bằng quang phổ đạo hàm và HPLC đƣợc trình bày trong Bảng 3.8. Kết quả cho thấy không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) về độ đúng (ANOVA) và độ lặp (Bartlett) khi so sánh các số liệu của quang phổ đạo hàm và HPLC với các chế phẩm đem định lƣợng.
Bảng 3.8.Kết quả định lƣợng các chế phẩm bằng quang phổ đạo hàm và HPLC
Chế phẩm Hàm lƣợng % so với nhãn HPLC PĐH PĐHTĐ Cefactam CP 100,1 ± 1,1 99,4 ± 0,7 100,4 ± 0,9 SB 99,3 ± 1,2 98,5 ± 1,7 99,2 ± 0,8 Sulperazon CP 100,4 0,9 99,9 1,3 100,5 0,6 SB 100,3 1,2 99,4 1,8 99,7 1,3 Jincetam CP 99,8 0,7 100,6 1,0 100,0 0,8 SB 99,1 1,0 98,9 1,6 99,3 0,9 Bacamp CP 100,9 1,1 101,6 0,7 100,4 0,9 SB 100,8 0,8 101,2 1,3 100,5 1,2
3.2. BÀN LUẬN
Kết quả thực nghiệm đã cho thấy quang phổ đạo hàm có thể định lƣợng đƣợc đồng thời cefoperazon và sulbactam trong cùng hỗn hợp mà không cần chiết tách. Ngoài ra, việc sử dụng nƣớc làm dung môi là một ƣu điểm nổi bật của các phƣơng pháp này.
Với phƣơng pháp quang phổ đạo hàm, hai yếu tố chính ảnh hƣởng đến kết quả định lƣợng là bƣớc sóng định lƣợng và các thông số trong phép lấy đạo hàm, phép làm trơn phổ đồ.
Qua khảo sát, bƣớc sóng đƣợc lựa chọn để định lƣợng các chế phẩm thử trong phổ đạo hàm bậc 1 là 286,0 nm với cefoperazon và 228,0 nm với sulbactam. Về nguyên tắc có thể tiến hành định lƣợng cefoperazon tại nhiều bƣớc sóng (Hình 3.2), tuy nhiên bƣớc sóng 286,0 đƣợc lựa chọn vì sai số đinh lƣợng tại bƣớc sóng này là nhỏ nhất. Tƣơng tự, bƣớc sóng 228,0 nm đƣợc lựa chọn để định lƣợng sulbactam.
Thông số cho thuật toán đạo hàm bậc 1 đƣợc lựa chọn là: - Phép lấy đạo hàm: Order: 5; No of coefficient: 9. - Phép làm trơn: Order: 3; No of coefficient: 125.
Sự khác biệt về bƣớc sóng định lƣợng bằng phổ đạo hàm bậc 1 trong nghiên cứu này so với tài liệu tham khảo [8] có thể do sự khác nhau về cách xử lý phổ và lấy đạo hàm với từng loại máy đo quang đƣợc sử dụng.
Với phƣơng pháp PĐHTĐ, việc lựa chọn bƣớc sóng và nồng độ chất chuẩn làm mẫu số khi thực hiện phép chia ảnh hƣởng nhiều đến độ chính xác của kết quả. Tính thích hợp của thuật toán này đã đƣợc khẳng định qua sự trùng lặp về phổ đồ của dãy dung dịch một thành phần và dãy dung dịch hỗn hợp có nồng độ tƣơng ứng (Hình 3.3 và Hình 3.4). Qua khảo sát, bƣớc sóng λ = 260,9 nm và số chia nồng độ SB = 20 mg/l đƣợc lựa chọn để định lƣợng cefoperazon, còn bƣớc sóng λ = 236,6 nm và số chia nồng độ CP = 10 mg/l đƣợc lựa chọn để định lƣợng sulbactam.
Thông số của thuật toán đạo hàm bậc 1 phổ tỷ đối đƣợc lựa chọn cũng tƣơng tự nhƣ thuật toán đạo hàm bậc 1 đã nêu.
Kết quả thẩm định phƣơng pháp quang phổ đạo hàm cho thấy có sự phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ giữa tính hiệu đạo hàm và nồng độ CP và SB trong khoảng 10 - 35 mg/l (Bảng 3.5). Phƣơng pháp có độ đúng cao (tỷ lệ phần trăm tìm lại trong khoảng 100 - 102 %), độ lặp cao (RSD ≤ 2%).
Trong nghiên cứu này, HPLC đƣợc sử dung làm phƣơng pháp đối chiếu với quang phổ đạo hàm. Các điều kiện sắc ký đƣợc lựa chọn dựa vào các công trình nghiên cứu trƣớc đây đƣợc trình bày trong mục 3.1.2.2. Kết quả thẩm định cho thấy phƣơng pháp HPLC này đáp ứng đƣợc yêu cầu cho phép định lƣợng đồng thời CP và SB trong chế phẩm thuốc bột pha tiêm (Bảng 3.7).
Kết quả thống kê với độ tin cậy 95% cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa (p > 0,05) về độ đúng (ANOVA) và độ lặp (Bartlett) giữa quang phổ đạo hàm và HPLC. Do vậy, phƣơng pháp quang phổ đạo hàm đƣợc xây dựng hoàn toàn có thể thay thế HPLC để định lƣợng đồng thời cefoperazon và sulbactam trong các chế phẩm thuốc bột pha tiêm.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Dựa vào kết quả nghiên cứu của đề tài, chúng tôi rút ra một số kết luận nhƣ sau:
- Xây dựng đƣợc phép định lƣợng đồng thời cefoperazon và sulbactam trong các chế phẩm thuốc bột pha tiêm một cách trực tiếp (không cần qua giai đoạn chiết tách) bằng các phƣơng pháp: phổ đạo hàm bậc 1, phổ đạo hàm tỷ đối với độ lặp và độ đúng cao. Sự khác biệt về độ chính xác (độ lặp và độ đúng) của các phƣơng pháp đã nêu và HPLC không có ý nghĩa thống kê với mức tin cậy đạt 95%.
- Các phƣơng pháp quang phổ đạo hàm đã nêu có kỹ thuật đơn giản, chỉ sử dụng dung môi và hóa chất thông thƣờng (nƣớc cất 2 lần) nên dễ thực hiện và tiết kiệm kinh phí. Do đó, quang phổ đạo hàm có khả năng ứng dụng trong công tác kiểm nghiệm bột thuốc pha tiêm có chứa cefoperazon và sulbactam.
- Không có sự sai khác đáng kể giữa hàm lƣợng thực tế của các mẫu thuốc đƣợc định lƣợng với hàm lƣợng ghi trên nhãn.
Trên cơ sở kết quả đạt đƣợc, chúng tôi kiến nghị một số vấn đề sau:
- Tiếp tục nghiên cứu ứng dụng các phƣơng pháp quang phổ đạo hàm vào kiểm nghiệm các dạng bào chế đa thành phần khác có khả năng hấp thụ UV-Vis.
- Ứng dụng các phƣơng pháp quang phổ đạo hàm đã nêu để định lƣợng đồng thời cefoperazon và sulbactam trong các chế phẩm thuốc bột pha tiêm chứa tại các cơ sở kiểm nghiệm có trang bị máy quang phổ hiện đại.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt:
1. Bộ y tế (2007), Hóa phân tích, tập 2, Nhà xuất bản y học, Hà Nội. 2. Bộ y tế (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất bản y học, Hà Nội. 3. Bộ y tế (2008), Vật lý đại cương, Nhà xuất bản y học, Hà Nội.
4. Bộ Y tế, Viện kiểm nghiệm, Phân viện kiểm nghiệm (1998), Tài liệu tập huấn kỹ thuật kiểm nghiệm thuốc, tr. 1 - 15.
5. Đào Hữu Hồ (2007), Xác suất thống kê, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội, tr. 126 - 133, tr. 168 - 185.
Tài liệu tiếng Anh: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
6. Abdel Fattah M. El Walily, Azza Abdel - Kader Gazy, Saied F. Belal and Essam F. Khamis (1999), “Selective spectrofluorimetric determination of phenolic ß - lactam antibiotics through the formation of their coumarin derivatives”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Vol.20, pp. 643 - 653.
7. Absalla Ahmed El - Shanawani (1988), “HPLC determination of sulbactam, sultamicillin tousylate, cefaclo, ampicillin and cefoperazone in pharmaceutical preparation”, Acta Poloniae Pharmaceutical - Drug Research, Vol.55(1), pp. 9 - 14.
8. Alberto Parra, Javier Garcia - villanova, Vicente rodenas and M. Dolores Gomez (1994), “First and second derivative spectrophotometric determination of cefoperazone and sulbactam in injections’’, Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis, Vol.12(5), pp. 653 - 657.
9. AzzaM. M. Ali, Nagwa Abo El - Maali, and Mahmoud A. Ghandour (1993), “Determination of cefobid using adsorptive stripping voltammetric technique in different media”, Electroanalysis, Vol.5, pp. 85 - 89.
10. Burcu Dogan, Aysegul Golcu, Mustafa Dolaz and Sibel A. Ozkan (2009), “Electrochemical behaviour of the bactericidal Cefoperazone and its selective voltammetric determination in pharmaceutical dosage forms and human serum”,Current Pharmaceutical Analysis, Vol.5, pp. 179 - 189.
11. Dhandapani B., Thirumoorthy N., Harun Rasheed Shaik.,Rama Kotaiah M., and Chanadrasekhar K. B. (2010), “RP - HPLC method development and parenteral preparation”. Journal of Pharm Tech Research, Vol.2(1), pp. 752 - 755.
12. Ehab F. Elkady and Samag S. Abbas (2011), “Development and validation of a reversed - phase column liquid chromatographic method for the determination of five cephalosporins in pharmaceutical preparation”, Journal of AOAC International, Vol.94(5), pp. 1440 - 1446.
13. Fardous A. Mohamed, Gamal A. Saleh, Salwa R. El - Shaboury and Azza H. Rageh (2008), “Selective densitometric analysis of cephalosporin using dragendorff's reagent”, Chromatographia, Vol.68, pp. 365 - 374.
14. Gamal A. Saleh, Hassan F. Askal , Mohamed F. Radwan and Mahmoud A. Omar (2001), “Use of charge-transfer complexation in the spectrophotometric analysis of certain cephalosprins”, Talanta, Vol.54, pp. 1205 - 1215.
15. Gamal A. Saleh, Salwa R. El - Shaboury, Fardous A. Mohamed and Azza H. Rageh (2009), “Kinetic spectrophotometric determination of certain cephalosporins using oxidized quercetin reagent”, Spectrochimca Acta Part A,
16. Genowefa Pạjchel and Stefan Tyski (2000), “Adaptation of electrophoresis to the determination of selected cephalosporin for injection”, Journal of Chromatography A, Vol.895, pp. 27 - 31.
17. Hammam E., El-Attar M. A. and Betagi A. M. (2006), “Voltammetric studies on the antibiotic drug cefoperazone Quantification and Pharmacokinetic studies”, Journal of Pharmaceutical and Bioedical Analysis, Vol.42, pp. 523 - 527.
18. Hesham Salem and Hassan Askal (2002), “Colourimetric and AAS determination of cephalosporins using Reineck's salt”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Vol.29,pp. 347 - 354.
19. Hesham Salem (2004), “Selective spectrophotometric determination of phenolic ß – lactam antibiotic in pure forms and in their pharmaceutical formulations”, Analytica Chimica Acta, Vol.515,pp. 333 - 341.
20. Jane J. , Subrahmanyam E. V. S. and Sathyanarayana D. (2006), “Spectrophotometric determination of certain cephalosporin”, Asian Journal of Chemistry, Vol.18(1), pp. 721 - 723.
21. Liudmil A., Daniela N., (2000) “Resolution of overlapping UV-VIS absorption bands and quantitative analysis”, Chemical Society Reviews, Vol.29, pp. 217 - 227.
22. Lories I. Bebawy, Khadiga El Kelani and Laila Abdel Fattah (2003), “Flourimetric determination of some antibiotics in raw material and dosage forms through ternary complex formation with terbium (Tb3+)”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Vol.32, pp. 1219 - 1225.
23. Meyyanathan S. N., Gopinath R., Rajan S., Phanikumar Y. V., Muralidharan S., Krishnaveni N. and Suresh B. (2007), “A RP - HPLC method for simultaneous estimation of cefoperazone and sulbactam in pharmaceutical formulation”, Indian J.Pharm. Res., Vol.41(3), pp. 256 - 260.
24. Sabina Biillová - René Kizek - Frantisek Jelen (2003), “Square - wave voltammetric determination of cefoperazone in a bacterial culture, pharmaceutical drug, milk, and urine”, Anal Bioanal Chem, Vol.377, pp. 362 - 369.
25. Sathish Kumar Shetty A., Yashwanth R., Manzoor Ahmed, Sridhar. B. K. and Vijaya Kumar M. (2011), “Development and validation of RP – HPLC method for quantitative - estimation of cefoperazone in bulk and pharmaceutical dosage forms”, International Journal of Pharm Tech Research,
Vol.3(3), pp. 1075 - 1080.
26. Selavka C. M., Krull I. S. and Bratin K. (1986), “Analysis for penicillins and cefoperazone by HPLC - photolysis - electrochemical detection (HPLC - hv - EC)”, Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis, Vol.4(1), pp. 83 - 93. 27. Senthilraja M. and Sanjaypai P. N. (2006), “Spectrophotometric method for
the determination of cefoperazone sodium in pharmaceutical formulations”,
Indian Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol.68(3), pp. 384 - 385.
28. Tai-Li Tsou, Yu - Chuan Huang, Chiu - Wey Lee, An - Rong Lee, Hsian - Jenn Wang and Su - Hwei Chen (2007), “Simultaneous determination of ampicillin, cefoperazone, and sulbactam in pharmaceutical formulations by