Theo các nghiên cứu trước đây tiến hành khảo sát trên 4 phương pháp để phân lập piperin thô và đưa ra kết luận phân lập piperin bằng dd NaOH 10%/ ethanol 96%: cho dd NaOH 10%/ ethanol 96% vào cắn chiết, vừa khuấy vừa thêm nước vào. Sau đó lọc thu lấy piperin thô. Piperin thô được đem hòa tan trong ethanol 96%, tẩy màu bằng than hoạt, lọc, để kết tinh thu piperin tinh khiết. Hiệu suất của giai đoạn tinh chế là 45,8%. Phương pháp này có quy trình chiết đơn giản nhất, hóa chất thông dụng và tương đối thân thiện với môi trường. Tuy nhiên các thông số của quá trình chưa được khảo sát nên chúng tôi tiến hành khảo sát phương pháp này nhằm tìm ra các thông số để thu được hiệu suất cao nhất.
Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi nhận thấy rằng chỉ cần để cắn chiết ở nhiệt độ phòng sau 24giờ thì piperin trong cắn chiết đã gần như kết tinh hoàn toàn và chỉ cần dùng 1 lượng vừa đủ dung dịch NaOH/ ethanol 96% để loại tạp, sau đó lọc là có thể thu được piperin thô với hiệu suất cao, giúp tiết kiệm dung môi hóa chất. Do đó chúng tôi đi sâu vào nghiên cứu các thông
số trong quá trình bao gồm: nồng độ và thể tích dung dịch NaOH/ ethanol 96%.
3.4.1.1. Xác định nồng độ dung dịch NaOH/ethanol 96%.
Mục đích: xác định nồng độ dung dịch NaOH/ethanol 96% thích hợp để có hiệu suất cao nhất, tốn ít hóa chất. Theo các nghiên cứu trước đây mới chỉ tiến hành ở nồng độ dd NaOH 10 % /ethanol 96% nên chúng tôi tiến hành khảo sát ở 3 nồng độ khác nhau của dung dich NaOH/ethanol 96% là 5%, 10%, 15 % nhằm tìm ra nồng độ thích hợp.
Cách tiến hành : Cân 10g cắn chiết (có hàm lượng piperin là 32,2%), thêm vào đó 20 ml dd NaOH/ ethanol 96%. Đem khuấy từ trong 1 giờ, lọc thu được piperin thô. Piperin thô được sấy ở 500C. Sau đó cân xác định khối lượng piperin thô. Tiến hành làm 3 mẫu với dung dịch NaOH/ ethanol 96% có nồng độ khác nhau.
Kết quả: được thể hiện ở bảng 3.2
Bảng 3.2: Hiệu quả phân lập piperin của các dung dịch natrihydroxyd có nồng độ khác nhau.
Nồng độ NaOH/ ethanol 96% 5% 10% 15%
Khả năng lọc khó lọc lọc được dễ lọc
Màu sắc sản phẩm vàng đậm vàng nhạt vàng nhạt
Khối lượng piperin thô 5,7g 4,1g 3,5g Hàm lượng piperin trong piperin
thô 51,5% 70,6% 72% Hiệu suất giai đoạn phân lập 91% 90,5% 78%
Nhận xét:
Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi nhận thấy dùng dung dich NaOH 15%/ ethanol 96 % dễ hòa tan cắn, dễ lọc, hàm lượng piperin trong tủa thô cao nhưng khối lượng tủa thô thấp, hiệu suất đạt 78%. Với dung dịch NaOH 5% /ethanol 96% tốn nhiều thời gian, rất khó lọc, dễ bị tắc thiết bị, có hiệu suất cao là 91% nhưng không loại được tạp thể hiện qua hàm lượng piperin thấp 51,5%. Chính vì vậy chúng tôi quyết định lựa chọn dung dịch NaOH 10%/ ethanol 96 % để phân lập piperin thô với hiệu suất 90,5%, với hàm lượng piperin cao 70,6% tạo thuận lợi cho quá trình tinh chế piperin thô tạo sản phẩm.
Hình 3.4 :Khối lượng và hàm lượng piperin thô phân lập bằng dung dịch natrihydroxyd với các nồng độ khác nhau
3.3.1.2 Xác định thể tích dung dịch NaOH10%/ ethanol 96%
Mục đích: nhằm xác đinh lượng dung dịch NaOH 10%/ethanol 96% vừa đủ để hòa tan hết lượng nhựa trong cắn chiết mà không làm hòa tan piperin đã kết tinh.
Cách tiến hành: Cân 10 g cắn chiết (hàm lượng piperin là 32,2%), cho vào cốc có mỏ, thêm vào đó dung dịch NaOH10%/ethanol 96%, khuấy trong 1giờ. Sau đó lọc và thu lấy piperin thô. Piperin thô được sấy ở 500C. Sau đó cân xác định khối lượng piperin thô. Tiến hành làm 3 mẫu với 3 thể tích dung dịch NaOH 10%/ ethanol 96% khác nhau.
Kết quả : thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3: Hiệu quả phân lập piperin của các dung dịch natrihydroxyd 10%/ ethanol 96% với các tỉ lệ khác nhau.
Thể tích dung dịch NaOH10%/ ethanol 96% 10ml (1:1) 20ml (1:2) 30ml (1:3) Khả năng lọc khó lọc lọc được dễ lọc
Màu sắc piperin thô vàng đậm vàng vàng nhạt
Khối lượng piperin thô 5,3g 4,1g 3,7 g
Hàm lượng piperin trong piperin thô 55,7% 71% 72%
Hình 3.5: Khối lượng và hàm lượng piperin thô phân lập bằng dung dịch natrihydroxyd 10%/ ethanol 96% với tỉ lệ khác nhau
Nhận xét : Với thể tich dung dịch NaOH 10%/ ethanol 96% thêm vào là 10ml sản phẩm lẫn nhiều tạp, tốn nhiều thời gian do khó lọc, lượng piperin thô lớn nhưng hàm lượng thấp piperin 55,7% , hiệu suất là 91,4%. Với thể tích dung dịch NaOH 10%/ ethanol 96% thêm vào là 20ml, sản phẩm có chất lượng tốt hơn, hàm lượng piperin 71%, hiệu suất cao nhất là 91%. Với thể tich NaOH 10%/ ethanol 96% thêm vào là 30ml, lượng piperin thô ít 3,7g nhưng hàm lượng piperin cao 72% và hiệu suất đạt 82%.
Chính vì vậy chúng tôi quyết định lựa chọn sử dụng dung dịch NaOH 10%/ ethanol 96% để phân lập piperin, với hiệu suất và hàm lượng piperin cao giúp thuận lợi cho quá trinh tinh chế piperin thô tạo sản phẩm: với tỷ lệ 20 ml dung dịch NaOH 10%/ethanol 96% cho 10g cắn chiết (tương đương khoảng 100 dược liệu).
3.4.2. Tinh chế piperin thô
Mục đích : theo các nghiên cứu trước đây tinh chế piperin thô sử dụng dung môi ethanol 96%, chính vì vậy chúng tôi tiếp tục nghiên cứu các phương pháp khác tinh chế khác nhằm so sánh để tìm ra phương pháp có hiệu suất cao nhất và ít độc hại nhất. Theo các nghiên cứu trước đây piperin có thể kết tinh bằng cách hòa tan trong dung môi ethanol 96%, isopropanol rồi để kết tinh thu sản phẩm, hoặc hòa tan trong aceton sau đó pha loãng bằng nước để thu sản phẩm. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành khảo với 3 dung môi: ethanol 96% , isopropanol, aceton .
Cách tiến hành: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
• Dung môi là ethanol và isopropanol:
Cho 5g piperin thô vào 30 ml dung môi, vừa cho vừa khuấy, đun cách thủy. Thêm 0,25 g than hoạt vào, khuấy đều trong vòng 10 phút. Lọc nóng lấy dịch lọc. Để kết tinh ở nhiệt độ 100C trong vòng 24giờ , lọc sấy ở 500
C. Cân xác định khối lượng piperin kết tinh.
• Dung môi aceton:
Cho 5g piperin thô vào 30 ml dung môi, vừa cho vừa khuấy, đun cách thủy. Thêm 0,25 g than hoạt vào, khuấy đều trong vòng 10 phút. Lọc nóng lấy dịch lọc. Thêm từ từ 200ml nước. Lọc lấy tủa, đem sấy ở 500
C. Cân xác định khối lượng piperin kết tinh.
Kết quả: thể hiện ở bảng 3.4 Nhận xét :
Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi nhận thấy dùng dung môi aceton có ưu điểm tốn ít thời gian hơn do không phải để kết tinh qua đêm nhưng hàm lượng piperin thấp 75% do có lẫn nhiều tạp, hiệu suất là 84,5%. Với dung môi isopropanol thì chất lượng sản phẩm tốt với hàm lượng piperin cao 97,7%, hiệu suất 76,4%. Với dung môi là ethanol 96%, chất lượng sản phẩm tốt, hàm
lượng piperin là 98%, hiệu suất tinh chế cao nhất là 82,8%. Chính vì vậy chúng tôi quyết đinh sử dụng dung môi ethanol 96% để tinh chế piperin thô tạo sản phẩm với hiệu suất cao và chất lượng sản phẩm tốt với tỷ lệ 30ml ethanol 96% cho 5g piperin thô.
Hiệu suất cả quá trình chiết và tinh chế là 67,8%.
Bảng 3.4: Hiệu suất và độ tinh khiết của piperin kết tinh từ các dung môi khác nhau.
Ethanol 96 % IPA Aceton Khối lượng piperin thô 5g
Hàm lượng piperin trong piperin thô 71%
Khối lượng sản phẩm 3g 2,8 g 4 g Nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm. 130,20C 130,10C 1280C Hàm lượng piperin trong sản phẩm 98% 97,7 % 75% Hiệu suất giai đoạn tinh chế 82,8% 76,4% 84,5%
(a) (b) (c)
Hình 3.6: Hình ảnh sản phẩm piperin tinh khiết.
(a): Hình ảnh piperin tinh khiết tinh chế bằng dung môi ethanol 96%. (b): Hình ảnh piperin tinh khiết tinh chế bằng dung môi isopropanol. (c): Hình ảnh piperin tinh khiết tinh chế bằng dung môi aceton.
3.5. Chiết xuất piperin quy mô 700g/mẻ.
• Từ kết quả thực nghiệm trên, chúng tôi đề xuất phương pháp chiết xuất piperin từ hồ tiêu bằng aceton, phân lập piperin bằng dd NaOH 10%/ ethanol 96%, tinh chế thu sản phẩm bằng ethanol 96%.
Phương pháp được sơ đồ hóa trong hình 3.6
• Sau khi khảo sát các thông số của quá trình chúng tôi tiến hành với lượng dược liệu lớn hơn nhằm xác định được tính ổn định của quy trình chiết xuất
Tiến hành : Cân 700 g dược liệu, ngâm trương nở dược liệu với 700ml dung môi aceton trong vòng 2 giờ để dược liệu trương nở hoàn toàn. Cho tiếp 700ml dung môi aceton ngâm trong vong 4 giờ, rút lấy dịch.
Tiến hành chiết 2 lần nữa như trên, mỗi lần 700 ml. Gộp dịch chiết lại, đem cất thu hôi dung môi ở 500C dưới áp suất giảm đến cắn có thể chất sánh đặc. Xác định khối lượng cắn. Để cắn ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ cho piperin kết tinh.
Thêm 140 ml dung dich NaOH 10%/ ethanol 96% vào cắn, khuấy trong 1giờ. Lọc lấy tủa piperin thô. Piperin thô được sấy ở 500C . Xác định khối lượng piperin thô.
Hòa tan hoàn toàn piperin thô 200 ml dung môi EtOH 96%, đun cách thủy, thêm 1,7g than hoạt, khuấy đều trong vòng 10 phút. Để kết tinh ở 100
C trong 24 giờ, lọc, sấy ở 50oC. Cân xác định khối lượng piperin tinh khiết.
Tiến hành làm 3 mẻ, mỗi mẻ với 700g dược liệu. Kết quả : thể hiện ở bảng 3.5
Ngâm 2h Bã dược liệu
Hình 3.7: Sơ đồ quy trình chiết xuất piperin từ hồ tiêu. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bột hồ tiêu Dịch chiết Piperin thô Cắn chiết aceton Cô ở 500 C, hút chân không Để 24 giờ Dung dịch NaOH 10%/ ethanol 96% Bã dược liệu
Khuấy đều 1giờ
Lọc Dung dịch piperin/ ethanol 96% Than hoạt Dịch lọc Bã than Ethanol 96% Sản phẩm piprein Để kết tinh 24giờ, lọc,sấy ở 500 C Thu hồi dung môi Thu hồi dung môi
Hòa tan
Dịch lọc
khuấy trộn, cách thủy
Bảng 3.5: Hiệu suất và độ tinh khiết của piperin của 3 mẻ chiết.
Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Trung bình Khối lượng cắn chiết 68,0g 71,1g 67,6g 68,7g Khối lượng piperin thô
(g) 30g 29,5g 28,4g 29,3g Khối lượng piperin tinh
khiết 18,2g 18,8g 18g 18,3g Hàm lượng piperin trong
sản phẩm 97% 97,4% 98% 97,5% Hiệu suất cả quá trình
chiết và tinh chế 71,3% 73,9% 71,2% 72,1% Nhiệt độ nóng chảy 130,20C 130,40C 130,50C 130,40C
Nhận xét:
Tiến hành chiết với mẻ 700g thấy hiệu suất cả quá trình cao hơn 72,1% so với lượng dược liệu là 100g hiệu suất là 67,8% do làm giảm hao hụt trong quá trình chiết xuất. Giữa các mẻ ít có sự chênh lệch thể hiện quy trình có tính ổn định cao.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
I. KẾT LUẬN
1. Đã khảo sát hiệu quả chiết piperin từ hồ tiêu bằng 2 dung môi: aceton và ethanol 96%. Dung môi aceton có hiệu suất cao hơn, chọn lọc hơn dung môi ethanol 96%.
2. Đã cải tiến phương pháp phân lập piperin từ dịch chiết: thay vì hòa tan cắn chiết vào dung dịch NaOH 10%/ethanol 96% sau đó thêm nước để kết tủa piperin thô, chúng tôi tiến hành xử lý cắn chiết bằng cách để ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ để piperin kết tinh, sau đó tiến hành loại tạp bằng dung dịch NaOH 10%/ethanol 96% vừa đủ tránh hòa tan piperin đã kết tinh, sau đó lọc thu piperin thô giúp cho:
Hiệu suất của quá trình cao hơn là 67,8% so với 45,8 %.
Tốn ít dung môi hóa chất hơn.
3. Sử dung dung môi để kết tinh lại piperin bằng 3 dung môi : ethanol 96%, isopropanol, aceton. Kết quả cho thấy sử dụng ethanol 96% để kết tinh lại piperin cho hiệu suất và độ tinh khiết cao nhất.
4. Đã tiến hành chiết với mẻ 700 g dược liệu, hiệu suất đạt 72,1%, kết quả ít chênh lệch nhiều giữa các mẻ, thể hiện quy trình có tính ổn định cao.
II. KIẾN NGHỊ:
Trong thời gian thực nghiệm chúng tôi nghiên cứu chỉ là những kết quả nghiên cứu bước đầu, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo. Chúng tôi đề nghị : tiếp tục nghiên cứu trên quy mô cỡ mẻ lớn hơn để cải tiến và hoàn thiện quy trình chiết xuất.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Văn Đàn, DS. Ngô Ngọc Khuyến (1999), Hợp chất thiên
nhiên dùng làm thuốc, Nhà xuất bản y học, Hà Nội, tr. 98-99.
2. Từ Minh Koóng (2007), Kỹ thuât sản xuât dược phẩm, Nhà xuất bản y học, Hà Nội , tr. 155-159.
3. Phạm Thanh Kỳ (2007), Dược liệu học (tập 2), Nhà xuất bản y học, Hà Nội, tr 42-43.
4. Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr. 371-372. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
5. Tôn Nữ Tuấn Nam ( 2008), Báo cáo đánh giá chất lượng và thị trường hồ tiêu tại Việt Nam.
6. Trần Thị Quỳnh Nga (2010), Nghiên cứu chiết xuất piperin từ hồ tiêu để
làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức năng, khóa luận tốt nghiệp
dược sĩ khóa 2005-2010, Trường Đại học Dược Hà Nội.
7. Lại Thị Nhung (2011), Nghiên cứu chiết xuất piperin từ hồ tiêu, khóa luận tốt nghiệp dược sĩ khóa 2005-2010, Trường Đại học Dược Hà Nội.
TIẾNG ANH
8. Badmae V., Majeed M., Norkus E.P. (1985), “Piperine, an alkaloid derived from black pepper increases serum response of beta-carotene during 14- days of oral beta-carotene supplementation”, J Pharmacol Ther Exp, 232, pp.258-262.
9. Bano G., Amla V., Raina RK., Zutshi U., Chopra C.L. (1987), “The effect of piperine on pharmacokinetics of phenytoin in healthy volunteers’’,
Planta Med, 62, pp.281–569.
10. Epstein W., Netz D. and Seidel J. (1993), “Isolation of piperine from black pepper”, American Chemical Society, 70, pp. 598-599.
11. Ikan R., (1991), Natural Products. A Laboratory Guide. Academic Press, New York, pp. 233-238.
12. Kanaki N. et al. (2008), “A rapid method for isolation of piperine from the fruits of Piper nigrum Linn” , J Nat Med, 62, pp. 281-283.
13. Mujumdar AM. Et al. (1990), “Anti-inflammatory activity of piperine” ,
Jpn J Med Sci Biol, 43, pp. 95-100.
14. Pradeep CR, Kuttan G (2002), “Effect of piperine on the inhibition of lung metastasis induced B16F-10 melanoma cells in mice’’, Int
Immunopharmacol, 4, pp.1795-1803.
15. Raman G., Gaikar G., (2002), “ Extraction of Piperine from Piper
nigrum (Black Pepper) by Hydrotropic Solubilization’’, Ind. Eng. Chem.
Res., 41, pp. 2966-2976.
16. Rathnawa M., Buckle K.A. (1983), “ Determination of piperine in
pepper (Piper nigrum) using high-performance liquid chromatography”
Journal of Chromatography, 264, pp.230-231.
17.2Shoba G, Joy D, Joseph T, Majeed M, Rajendran R, Srinivas PS (2002), “Influence of piperine on the pharmacokinetics of curcumin in animals and human volunteers” , Department of Pharmacology.
18. Srinivasan K(2007), “Black Pepper and its PungentPrinciple-Piperine: A Reviewof Diverse Physiological Effects” , Critical Reviews in Food
Science and Nutrition, 47, pp.735-748.
19. Taqvi T.S.H., et al. (2009), “Insight into the possible mechanism of antidiarrheal and antispasmodic activities of piperine”, Pharmaceutical
20. Zutshi RK, Singh R, Zutshi U, Johri RK, Atal CK (1985), “Influence of piperine on rifampicin blood levels in patients of pulmonary