- Mẫu thử: cắn phân đoạn n-butanol từ dịch chiết nước Rau đắng biển Bacopa monieri (Linn.) Pennell thu thập ở Nghệ An, do Viện dược liệu trung ương cung cấp.
2.2. Động vật thí nghiệm
- Chuột nhắt trắng cung cấp bởi Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương.
+ Chuột dùng cho thí nghiệm đánh giá khả năng học tập của mẫu nghiên cứu: được nuôi ổn định ít nhất 1 tuần, đạt đến trọng lượng 23-25g trước khi tiến hành phẫu thuật.
+ Chuột dùng cho thí nghiệm đánh giá tác dụng của mẫu nghiên cứu lên tế bào thần kinh nguyên phát: chuột nhắt trắng mang thai khoảng 18-19 ngày tuổi.
2.3. Hóa chất, trang thiết bị
- Thuốc chuẩn: Tacrine do hãng Sigma cung cấp. - Hệ thống mê lộ nước Morris bao gồm:
+ Bể bơi: là một bể hình trụ, đường kính 1.1m và cao 30 cm. Lượng nước trong bể duy trì ở mức 15cm, nhiệt độ khoảng 200C trong suốt quá trình thí nghiệm. Mê lộ được đặt trong phòng kín, có đặt sẵn những hình ảnh định hướng không gian, những hình ảnh này không được thay đổi trong suốt quá trình thí nghiệm. Một bến đỗ hình trụ có đường kính 7,5 cm, trong suốt, đặt trong một góc ¼ của mê lộ.
+ Camera được kết nối với máy tính và phần mềm phân tích kết quả dựa được thiết kế dựa trên phiên bản PanLab (Tây Ban Nha) do công ty phát triển dịch vụ công nghệ An Nhân cung cấp.
- Bộ hóa chất tách và nuôi cấy tế bào (Hãng Gibco, Mỹ)
- Hóa chất khác: MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2,5-diphenyltetrazolium bromide]; beta-amyloid 25-35 protein; trypan blue; dimethylsulfoxid (DMSO) đạt tiêu chuẩn thí nghiệm.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh của cắn phân đoạn n- butanol chiết từ Rau đắng biển trên tế bào vỏ não nguyên phát gây độc bằng beta-amyloid
2.4.1.1. Phương pháp tách và nuôi cấy tế bào thần kinh vỏ não nguyên phát
Nguyên tắc [17], [60], [61]:
Vỏ não tách từ một cơ thể sống (thường là chuột), xử lý bằng enzym và biện pháp cơ học nhằm phân cắt các mô liên kết thu được các tế bào thần kinh và một lượng nhỏ tế bào đệm riêng lẻ. Bổ sung chất diệt tế bào đệm mà không làm ảnh hưởng các tế bào thần kinh. Nuôi cấy trong môi trường và điều kiện thích hợp.
Quy trình tách và nuôi cấy tế bào thần kinh vỏ não phôi thai chuột nguyên phát gồm các bước cơ bản sau:
- Giết chuột mẹ mang thai khoảng 18-19 ngày tuổi.
- Mổ tách vùng vỏ não, đặt vào môi trường nuôi cấy (môi trường Neuronbasal bổ sung 12% huyết thanh ngựa, 0,6% glucose, 200 mM L-glutamin và 1 µg/ml minomycin (được gọi là môi trường Glu (+))
- Bóc tách màng vỏ não và các mạch máu bám trên bề mặt.
- Cắt nhỏ mô vỏ não, sau đó ủ với 2 ml trypsin 0,05 % (ở 37°C trong 15 phút) để phân tách các mô vỏ não, ly tâm thu được những hạt nhỏ.
- Ủ với enzym deoxyribonuclease (100 U/ml DNase I trong 2 ml đệm phosphat). để phân cắt acid deoxyribonucleic ngoài tế bào.
- Lấy một ít huyền dịch tế bào, nhuộm bằng tripan blue và đếm trên kinh hiển vi để xác định mật độ tế bào và khả năng sống sót của tế bào.
- Tế bào được phân tán lại trong môi trường Glu (+) và chia vào 96 giếng (giếng được tráng poly-D-lysin) và nuôi cấy ở 37°C, trong môi trường không khí có chứa 10% khí CO2.
- Thay môi trường Glu (+) bằng môi thường Glu (+) không có huyết thanh ngựa, có bổ sung thêm B-27 (để hạn chế sự phát triển của tế bào thần kinh đệm) sau khi cấy 2 ngày/ lần.
2.4.1.2. Đánh giá độc tính của mẫu thử trên tế bào thần kinh vỏ não nguyên phát
Quy trình tiến hành:
- Cắn phân đoạn n-butanol Rau đắng biển được pha trong dimethylsulfoxid (DMSO).
- Ủ tế bào thần kinh vỏ não nguyên phát đã được tách và nuôi cấy (ở trên) với mẫu thử sao cho nồng độ mẫu thử cuối cùng trong các giếng nuôi cấy tế bào lần lượt là 50, 100, 200, 300, 400 μg/ml, tiếp tục nuôi cấy tế bào ở 37°C, trong môi trường không khí có chứa 10% CO2. Mỗi nồng độ mẫu thử được đánh giá trong 3 giếng, thí nghiệm được làm lặp lại 2 lần.
- Sau 24 giờ, định lượng số lượng tế bào sống sót bằng kỹ thuật định lượng MTT.
Nguyên tắc kỹ thuật định lượng MTT [60]: MTT là một muối tetrazolium hòa tan trong nước có màu vàng nhạt. Trong tế bào sống, enzym hydrogenase ở ty thể sẽ phân giải vòng tetratropium của MTT thành tinh thể formazal màu tím. Hòa tan tinh thể bằng dung môi thích hợp. Định lượng lượng chất phản ứng bằng đo độ hấp thụ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ánh sáng ở bước sóng 540nm. Độ hấp thụ của dung dịch là một hàm chuyển đổi tỷ lệ thuận với lượng tế bào sống.
Tiến hành định lượng MTT trên các giếng tế bào thử độc tính của cắn phân đoạn n-butanol Rau đắng biển:
+ Bổ sung 20 µl MTT (nồng độ 5mg/ml, trong đệm muối natri phosphate) vào mỗi giếng tế bào.
+ Tiếp tục ủ trong tủ nuôi cấy duy trì nhiệt độ 37°C, không khí có chứa 10% CO2 + Sau 2 giờ, hút loại bỏ môi trường, thêm vào 50µl DMSO vào mỗi giếng để hòa tan tinh thể. Đo độ hấp thụ ánh sang ở bước sóng 550nm bằng máy ELISA.
Chỉ tiêu đánh giá: Tỷ lệ tế bào sống sót sau nuôi cấy 24 giờ.
- Dựa vào kết quả định lượng tế bào sống sót, chọn nồng độ mẫu thử thích hợp để tiếp tục đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gây độc bằng beta-amyloid.
2.4.1.3. Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh của cắn phân đoạn n-butanol chiết từ Rau đắng biển trên tế bào vỏ não nguyên phát gây độc bằng βA 25-35
Nguyên tắc chung: Bổ sung mẫu thử ở nồng độ khác nhau vào môi trường nuôi cấy tế bào thần kinh nguyên phát trước khi gây độc bằng beta amyloid (βA 25- 35). Sau đó, tiến hành định lượng số lượng tế bào sống sót bằng kỹ thuật định lượng MTT.
Quy trình tiến hành:
- Thí nghiệm được tiến hành trên tế bào vỏ não nguyên phát sau khi tách và nuôi cấy 7 ngày. Các giếng tế bào được chia thành 3 nhóm, mỗi nhóm 3 giếng (bảng 2.1):
Bảng 2.1 Phân nhóm thử khả năng sống sót sau gây độc tế bào bởi βA25-35
Nhóm Thử thuốc
Chứng sinh lý DMSO 0.01%
Chứng bệnh lý DMSO 0.01% + βA 25-35
Thử Cắn BuOH Rau đắng biển 100µg/ml+ βA 25-35
- Chuẩn bị beta amiloid 25-35 (βA 25-35) kết tập: chuẩn bị dung dịch βA 25-35 trong nước vô khuẩn ở nồng độ 1mM và bảo quản ở - 200C. Trước khi gây độc tế bào, βA 25-35 được ủ ở 37°C trong 48 giờ để tạo βAP kết tập.
- Cắn phân đoạn n-butanol chiết từ Rau đắng biển được hòa tan trong DMSO và bổ sung vào các giếng nuôi cấy tế bào đến nồng độ đã được chọn sau khi đánh giá độc tính (mục 2.4.1.2).
- Sau 15 phút, bổ sung βA 25-35 trực tiếp vào môi trường nuôi cấy của lô chứng bệnh lý và lô thử thuốc để đạt được nồng độ cuối cùng là 10 µM và ủ trong tủ nuôi cấy đảm bảo nhiệt độ 37°C và không khí có chứa 10% CO2.
- 48 giờ sau khi thêm βA 25-35, tiến hành định lượng tế bào sống sót ở các lô thí nghiệm bằng định lượng MTT.
+ Bổ sung 20 µl MTT (nồng độ 5mg/ml, trong đệm muối natri phosphate) vào mỗi giếng tế bào.
+ Tiếp tục ủ trong tủ nuôi cấy duy trì nhiệt độ 37°C, không khí có chứa 10% CO2 trong 2 giờ
+ Hút loại bỏ môi trường, thêm vào 50µl DMSO vào mỗi giếng để hòa tan tinh thể. Đo độ hấp thụ bằng đo quang ở bước sóng 550nm bằng máy ELISA.
Thí nghiệm lặp lại 3 lần trong cùng điều kiện nghiên cứu.
Hình 2.1. Các bước đánh giá khả năng sống sót trên tế bào gây độc bằng βA 25-35 2.4.2. Đánh giá tác dụng cải thiện khả năng học tập và ghi nhớ in vivo
2.4.2.1. Phương pháp gây thiếu máu não cục bộ tam thời theo mô hình 2VO + hypo
- Chuột nhắt trắng sau khi đã nuôi ổn định trong phòng thí nghiệm 5 ngày được chia làm 2 nhóm: nhóm thử và nhóm chứng sinh lý.
- Gây mê chuột bằng pentobarbital (liều 50mg/kg) tiêm phúc mạc. - Sau khi chuột bị gây mê, bộc lộ 2 động mạch cảnh.
+ Đối với nhóm thử: kẹp động mạch cảnh bằng 2 kẹp động mạch trong 30 phút, đồng thời gây hạ huyết áp bằng cách rút 0.2ml máu đuôi chuột trong thời gian kẹp động mạch
+ Đối với nhóm chứng sinh lý: Chuột được mổ bộc lộ 2 động mạch nhưng không kẹp động mạch và không rút máu đuôi.
- Chuột ở cả hai nhóm được ủ ấm ở 370C cho đến khi tỉnh dậy. 2.4.2.2. Thử nghiệm mê lộ nước Morris (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nguyên tắc [6], [9], [20], [79]:
Mê lộ Morris (Morris water maze) là mô hình đánh giá khả năng học tập không gian cho động vật gặm nhấm định hướng từ vị trí bắt đầu xung quanh chu vi của
một khu vực bơi để xác định vị trí một bến đỗ (platform) để tránh khỏi ngập nước dựa trên các dấu hiệu gợi ý ngoại vi.
Thử thuốc:
Chuột được chia làm 5 lô thí nghiệm và cho uống mẫu thử như sau (bảng 2.2):
Bảng 2.2 Phân lô thí nghiệm và điều trị thử nghiệm đánh giá khả năng học tập và ghi nhớ in vivo
Lô n Mẫu thử/liều dùng Chế độ điều trị
Chứng sinh lý 8 Uống nước muối sinh
lý 0.9% - 1 giờ trước khi phẫu thuật
- 1 giờ trước khi tiến hành thí nghiệm hàng ngày
Chứng bệnh lý 9
Thử liều thấp 8 Uống cắn phân đoạn
BuOH liều 0.3g dl/kg
Thử liều cao 8 Uống cắn phân đoạn
BuOH liều 0.6g dl/kg
Tacrin 8
Tiêm phúc mạc Tacrin liều 2.5mg/kg
- 30 phút trước khi phẫu thuật
- 30 phút trước khi tiến hành thí nghiệm hàng ngày 2 ngày sau khi tiến hành phẫu thuật gây thiếu máu cục bộ tạm thời, chuột bắt đầu được tiến hành đánh giá hành vi bằng thử nghiệm mê lộ nước Morris. Tổng thời gian chuột phải học là 8 ngày. Các bài tập cụ thể và thời gian như sau:
- Bài tập nhìn thấy bến đỗ: 2 ngày sau phẫu thuật, chuột được học bài đầu tiên là bài tập nhìn thấy bến đỗ (visible trial). Bến đỗ được đặt cao hơn mặt nước 1 cm. Mỗi chuột được bơi để tìm thấy bến đỗ 1 lần. Nếu trong 60 giây, chuột tìm thấy bến đỗ, chuột sẽ được ở lại trong 10 giây. Nếu trong 60 giây chuột không tìm thấy bến
đỗ, chuột sẽ được hướng dẫn tìm đến bến đỗ và ở lại trong 15 giây. Sau đó chuột được lau khô, sưởi ấm và đưa về chuồng.
- Bài tập không nhìn thấy bến đỗ: từ ngày thứ 3 tới ngày thứ 8, chuột được tập nhớ không gian với bài tập không nhìn thấy bến đỗ (training trial), khi bến đỗ được đặt dưới mặt nước 1 cm. Mỗi ngày chuột được tập 3 lần, mỗi lần ở 3 góc ¼ còn lại trong mê lộ nước. Nếu 60s chuột không tìm thấy bến đỗ, chuột sẽ được hướng dẫn cách tìm bến đỗ và ở lại bến đỗ 20 giây. Khoảng cách giữa các lần tập là 1 phút, trong thời gian này chuột được lau khô và sưởi ấm. Toàn bộ quá trình sẽ được ghi lại bằng camera, thời gian tiềm tàng chuột có thể tìm thấy bến đỗ sẽ được tính toán. Số liệu mỗi ngày được tính toán bằng giá trị trung bình thời gian 3 lần tập đối với mỗi chuột.
- Bài tập không có bến đỗ: ngày thứ 9 sau khi gây mất trí nhớ, chuột sẽ được tập thử lại trí nhớ (probe trial). Trong bài tập này, bến đỗ được bỏ ra ngoài, chuột được bơi trong mê lộ một lần duy nhất trong 60 giây. Chuột sẽ nhớ lại vị trí của bến đỗ và có xu hướng bơi lâu hơn tại góc ¼ của mê lộ đặt bến đỗ ở những bài tập trước. Camera sẽ phân tích và ghi lại thời gian chuột bơi ở mỗi góc ¼ của mê lộ.
Hình 2.3 Mô hình thí nghiệm mê lộ nước Morris
Chỉ tiêu đánh giá: So sánh thời gian của lô chuột uống mẫu thử với lô chứng để đánh giá tác dụng của mẫu thử.
+ Thời gian tiềm tàng để tìm bến đỗ trong suốt quá trình tập luyện
+ Tỷ lệ thời gian chuột ở góc phần tư của mê lộ chứa bến đỗ khi không có bến đỗ
2.5. Xử lý số liệu
Số liệu được được xử lý bởi phần mềm excel 2010, biểu diễn dưới dạng trung bình ± sai số chuẩn. Kiểm nghiệm giả thiết thống kê sử dụng t-test, so sánh hai giá trị trung bình theo cặp. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p<0.05.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.1. Tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh trên mô hình gây độc tế bào bằng protein βA25-35 của cắn phân đoạn n-butanol chiết từ Rau đắng biển
3.1.1 Ảnh hưởng của mẫu nghiên cứu đối với khả năng sống sót của tế bào thần kinh vỏ não nguyên phát
Độc tính của mẫu nghiên cứu đối với tế bào thần kinh vỏ não nguyên phát nuôi cấy được đánh giá bằng cách ủ mẫu nghiên cứu với mẫu thử có nồng độ từ 50 – 400 μg/ml trong 24 giờ. Tỷ lệ tế bào sống sót sau 24 giờ ủ với mẫu thử được trình bày ở hình 3.1.
Hình 3.1. Ảnh hưởng của phân đoạn n-butanol Rau đắng biển đối với khả năng sống sót của tế bào thần kinh vỏ não sau 24 giờ nuôi cấy và thử thuốc.
- Ở nồng độ 50 μg/ml và 100 μg/ml mẫu nghiên cứu này không gây chết tế bào thần kinh vỏ não nguyên phát nuôi cấy với tỷ lệ tế bào sống sót lần lượt là 101.2% và 106.7%.
- Khi ủ tế bào thần kinh vỏ não nguyên phát với mẫu nghiên cứu ở các nồng độ 200-400 μg/ml, tỷ lệ tế bào sống sót ở các nồng độ 200, 300 và 400 μg/ml lần lượt là 88.7%, 72.1% và 45.4% .
Như vậy, cắn phân đoạn n-butanol chiết từ Rau đắng biển ở nồng độ 50-100 μg/ml không gây độc tế bào thần kinh vỏ não nguyên phát, ở nồng độ 200-400 μg/ml gây độc tế bào thần kinh vỏ não nguyên phát. Do vậy, chúng tôi quyết định sẽ chọn nồng độ 100 μg/ml của mẫu nghiên cứu để đánh giá tác dụng ngăn chặn/ bảo vệ tế bào thần kinh khỏi tổn thương gây bởi protein βA 25-35.
3.1.2 Tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh vỏ não nguyên phát khỏi tổn thương bởi protein βA25-35
Để đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh vỏ não nguyên phát khỏi tổn thương gây bởi protein βA 25-35, chúng tôi đã tiến hành định lượng tỷ lệ tế bào thần kinh vỏ não nguyên phát sống sót sau khi gây độc bằng βA 25-35. Kết quả được trình bày ở hình 3.4, (**p < 0,001 so với nhóm chứng bệnh lý).
Hình 3.2. Tác dụng bảo vệ tổn thương tế bào thần kinh vỏ não nguyên phát gây bởi βA 25-35 của cắn phân đoạn BuOH chiết từ Rau đắng biển
Kết quả cho thấy: Tỷ lệ tế bào thần kinh vỏ não nguyên phát sống sót sau khi ủ với βA 25-35 ở lô chứng bệnh lý so với lô chứng sinh lý (không ủ với βA 25-35) là 75.8%. Khi ủ tế bào thần kinh vỏ não nguyên phát với cắn phân đoạn BuOH Rau đắng biển nồng độ 100 μg/ml, tỷ lệ tế bào sống sót so với lô chứng sinh lý là 120.4% và tăng 44.5% so với lô chứng bệnh lý (p< 0,001).
3.2. Tác dụng cải thiện khả năng học và nhớ in vivo bằng thử nghiệm mê lộ nước Morris của cắn phân đoạn n-butanol chiết từ Rau đắng biển
Để đánh giá tác dụng cải thiện khả năng học tập và ghi nhớ của cắn phân đoạn n- butanol chiết từ Rau đắng biển, chúng tôi đã tiến hành đánh giá trên mô hình mê lộ nước Morris.
- Thời gian tiềm tàng nhìn thấy bến đỗ của các lô chuột thí nghiệm ở bài tập nhìn thấy bến đỗ (thực hiện sau 2 ngày gây thiếu máu não cục bộ tạm thời) được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1 Thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ của các lô thí nghiệm ở bài tập