khuẩn từ vùng Tây Bắc của Iran.
Từ 140 chủng phân lập được thu thập từ khắp miền tây bắc của Iran, 12 chủng phân lập Streptomyces biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn cao với tác nhân vi khuẩn được phân loại qua PCR để xác định trình tự gen 16 rDNA và phân tích mẫu ADN đa hình khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD).
Phân tích đặc điểm hình thái, hóa sinh và trình tự gen 16S rDNA chỉ ra rằng tất cả 12 chủng phân lập thuộc về các chi Streptomyces. Ngoài ra, sàng lọc các chủng liên quan đến hoạt tính kháng khuẩn của chúng chống lại các vi khuẩn chỉ thị cũng như phân loại của chúng sử dụng phân tích RAPD tiết lộ rằng G614C1 và K36C5 có hoạt tính kháng khuẩn đáng kể và cao tương ứng với Streptomyces coelicolor và Streptomyces albogriseolus.
Vì nhiều chủng phân lập trong nghiên cứu này cho thấy tác dụng ức chế chống lại vi khuẩn gây bệnh, đất ở miền tây bắc Iran có thể được sử dụng như một nguồn phong phú để khám phá các chủng Streptomyces với khả năng cao sản xuất ra kháng sinh [17].
CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu
+ Chủng xạ khuẩn: chủng xạ khuẩn Streptomyces 15.29 được phân lập từ đất miền Bắc Việt Nam do bộ môn Vi sinh-Sinh học trường đại học Dược Hà Nội cung cấp. + Giống VSV kiểm định: các chủng VSV kiểm định do bộ môn Vi sinh-Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp (Bảng 2.1).
Bảng 2.1: Các chủng VSV kiểm định
Vi khuẩn Gr (+) Vi khuẩn Gr (-)
Staphylococcus aureus ATCC 1228 Proteus mirabilis BV 108
+ Môi trường
Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định được giới thiệu ở bảng 2.2.
Bảng 2.2: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định
Thành phần MT NaCl (g) Cao thịt (g) Pepton (g) Thạch (g) Nước (ml) pH Canh thang 0,5 0,3 0,5 0 100(vđ) 7,0-7,4 Thạch thường 0,5 0,3 0,5 1,6-1,8
+ Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn.
Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn được giới thiệu ở bảng 2.3. Bảng 2.3: Các môi trường dùng trong nuôi cấy xạ khuẩn
MT Thành phần (g) MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6 MT7 Tinh bột 2 2 2,4 2 Lactose 3
Glucose 2 1 Cao ngô 0,5 0,5 Saccarose 3 Bột đậu tương 1,5 Cao thịt 0,3 0,3 Pepton 0,5 0,5 KNO3 0,1 KCl 0,05 NaNO3 0,2 NH4NO3 0,2 0,2 CaCO3 0,3 0,4 0,4 0,2 (NH4)2SO4 0,2 K2HPO4 0,05 0,1 0,1 0,05 MgSO4.7H2O 0,05 0,05 0,25 0,15 NaCl 0,05 0,1 0,5 Cao nấm men 0,5 Thạch 1,8 2 2 2 2 2 1,8 Nước máy (ml) 100 100 100 100 100 100 100 pH 6,8 – 7,2
+ Các môi trường dịch thể (MTdt): thành phần tương ứng như MT nuôi cấy xạ khuẩn nhưng không có thạch.
Chú ý: các MT nuôi cấy xạ khuẩn, MTdt lên men và MT nuôi cấy VSV kiểm định đều được tiệt trùng ở 118-120oC trong 30 phút.
+ Dung môi.
Các dung môi đã sử dụng được giới thiệu trong bảng 2.4
Bảng 2.4: Các dung môi đã sử dụng
Dung môi Khối lượng riêng (g/ml) Nhiệt độ sôi (°C)
Aceton 0,79 56 Butylacetat 0,880-0,885 117-118 Ethanol 0,789-0,791 78,3 Ethylacetat 0,889-0,901 70,4 Methanol 0,791-0,793 64,5 Triethylamin 0,726-0,728 90 n-Hexan 0,654 69 + Vật liệu chạy sắc ký: Bản mỏng sắc ký: Silicagel 60 F254, Merck.
Dung môi chạy sắc ký: các DM ở trên.
Bình chạy sắc ký, buret, Silicagel 60 F254 hạt có đường kính 0,040-0,063mm.
2.1.2. Máy móc, thiết bị.
+ Đèn UV (λ = 254nm), nguồn phát Toshiba 60W, điện thế 220V, + Nồi hấp vô trùng Hirayama Model HL3030,
+ Cân kỹ thuật Sartorius TE 210, + Cân phân tích Sartorius BP 121S, + Tủ ấm Memmert, Binder, Trung Quốc, + Tủ lạnh Deawoo, Sanyo,
+ Tủ cấy vô trùng Aura VF 48, + Tủ sấy SL shellab,
+ Máy lắc Taitec Bio – Shaker BR 300Lf, + Máy đo nhiệt độ nóng chảy E2-Melt, + Máy đo UV-VIS HiTaChi U-1900, + Máy đo phổ MS-Xevo TQMS,
+ Máy đo phổ IR Impact 410-NicoLet-USA (Viện hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam),
+ Kính hiện vi điển tử…
+ Thước kẹp Palmer độ chính xác 0,02mm, + Đĩa Petri, buret, pipet,
+ Patuyn, pipet các loại, ống nghiệm, bình nón, cốc có mỏ, que cấy, đèn cồn, đũa thủy tinh, kim mũi mác, que đục thạch, que chang, giấy lọc, giấy thử pH, bông…
2.2. Nội dung nghiên cứu.
2.2.1. Chọn lọc, cải tạo giống
+ Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên, lựa chọn các dạng chủng có HTKS cao nhất, + Đột biến bằng ánh sáng UV để nâng cao hoạt tính của Streptomyces 15.29
2.2.2. Lên men, chiết tách, tinh chế kháng sinh.
+ Từ 3 MT nuôi cấy bề mặt tốt nhất, chọn một MT lên men chìm tốt nhất.
+ Từ các dạng chủng và biến chủng thu được, lựa chọn chủng (biến chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất.
+ Tìm hệ DM khai triển có khả năng tách hỗn hợp kháng sinh tốt nhất. + Tách, tinh chế kháng sinh từ dịch chiết DM hữu cơ.
2.2.3. Sơ bộ xác định một số tính chất và cấu trúc của kháng sinh thu được.
Xác định nhiệt độ nóng chảy, đo phổ IR, phổ UV-VIS, phổ khối MS.
2.3. Phương pháp thực nghiệm.
2.3.1. Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn
Cấy zigzag xạ khuẩn trên ống thạch nghiêng có chứa MT nuôi cấy thích hợp, ủ cho phát triển ở 28-29oC. Sau 6-10 ngày, xạ khuẩn đã phát triển tốt, cho các ống giống vào tủ lạnh bảo quản ở 2oC, định kỳ 3-6 tháng cấy chuyền.
2.3.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán
+ Nguyên tắc: kháng sinh từ mẫu thử khuếch tán vào MT thạch dinh dưỡng đã cấy VSV kiểm định, ức chế sự phát triển của VSV tạo thành vòng vô khuẩn.
+ Tiến hành:
Tạo hỗn dịch VSV: lấy một vòng que cấy VSV kiểm định cấy vào 2,5ml MT canh thang, ủ ở 37oC trong 18-24h (đối với vi khuẩn) để tạo thành hỗn dịch VSV có nồng độ 106-108 tế bào/ml.
Cấy hỗn dịch VSV vào MT thạch thường đã tiệt trùng và để nguội đến 45-50oC với tỷ lệ 2,5:100 (105 tế bào/1ml), lắc đều, đổ vào đĩa Petri vô trùng với thể tích 20ml/đĩa.
Đưa mẫu thử vào MT kiểm định theo 1 trong 3 cách sau: Phương pháp khối thạch
Phương pháp khoanh giấy lọc Phương pháp giếng thạch
Các đĩa Petri có mẫu thử được ủ trong tủ ấm 37oC trong 18-24h (đối với vi khuẩn). Mỗi mẫu được thử song song trên 3 đĩa với cùng một loại VSV kiểm định.
Đánh giá kết quả: đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Palmer độ chính xác 0,02mm. Đánh giá kết quả dựa trên đường kính vòng vô khuẩn xử lý theo công thức:
= s =
Trong đó:
(mm): đường kính trung bình vòng vô khuẩn, (mm): đường kính vòng vô khuẩn thứ i, s: độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh,
n: số thực nghiệm tiến hành song song (thông thường n = 3).
2.3.3. Sàng lọc ngẫu nhiên
ống nghiệm chứa 10ml nước vô trùng, lắc cho bào tử phân tán đều, thu được hỗn dịch bào tử ở nồng độ pha loãng 10-1 (định ước). Sau đó, pha loãng lần lượt đến nồng độ 10-6 bằng nước vô trùng.
+ Cấy bào tử: Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1ml hỗn dịch bào tử ở các nồng độ pha loãng 10-4, 10-5, 10-6, nhỏ lên bề mặt thạch của MT2 trong đĩa Petri. Dùng que chang dàn đều hỗn dịch bào tử lên trên bề mặt thạch. Tiến hành trên 3 đĩa cho mỗi nồng độ pha loãng. Cho các đĩa vào tủ ấm 28oC trong 6 ngày cho xuất hiện các khuẩn lạc mọc riêng rẽ.
+ Phép chọn lọc ngẫu nhiên: sau 6 ngày chọn các khuẩn lạc phát triển đặc thù, mọc riêng rẽ rồi lấy ra cấy zigzag, sau 6 ngày đem thử HTKS bằng phương pháp khối thạch.
2.3.4. Đột biến
+ Pha hỗn dịch bào tử như phần sàng lọc ngẫu nhiên, được hỗn dịch bào tử ở nồng độ pha loãng 10-1 (định ước).
Sau đó, dùng 1ml hỗn dịch bào tử này pha loãng đến nồng độ 10-6 để làm mẫu chứng, 9ml còn lại để đem đi đột biến.
+ Đột biến dưới tác dụng của ánh sáng UV: 9ml hỗn dịch bào tử ở nồng độ 10-1 đựng trong đĩa Petri vô trùng (không đậy nắp trên) được chiếu ánh sáng UV (λ=254nm) với khoảng cách và thời gian thích hợp (khoảng cách 60cm, thời gian 2- 5 phút), sau đó lấy ra, để chỗ tối 2h, rồi dùng pipet vô trùng pha loãng đến nồng độ 10-4, 10-5 bằng nước vô trùng.
+ Cấy các bào tử sau đột biến: dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1ml mẫu chứng 10-6 và 0,1ml hỗn dịch đã đột biến ở các nồng độ 10-4 và 10-5 vào các đĩa Petri có chứa MT2, sau đó dùng que chang vô trùng dàn đều giọt hỗn dịch bào tử trên bề mặt thạch, mỗi nồng độ pha loãng làm 3 đĩa song song. Các đĩa Petri sau khi cấy được ủ ở nhiệt độ 28oC trong 6 ngày đến khi xuất hiện khuẩn lạc. Đếm các khuẩn lạc, xác định % độ sống sót theo công thức:
Trong đó:
Nm: trung bình số khuẩn lạc trong mẫu có nồng độ bào tử 10-k , No: trung bình số khuẩn lạc trong mẫu chứng.
+ Tiến hành sàng lọc với các khuẩn lạc sau khi đột biến tương tự như phần SLNN. Làm song song mẫu chứng. Phần trăm biến đổi hoạt tính được xác định theo công thức:
% biến đổi hoạt tính = x 100%
Trong đó:
: đường kính trung bình vòng vô khuẩn của biến chủng thứ i sau đột biến, : đường kính trung bình vòng vô khuẩn của mẫu chứng.
+ Sau đột biến, lựa chọn ra các biến chủng có tỉ lệ biến đổi hoạt tính dương cao nhất dùng cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.3.5. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh
+ Nguyên tắc: Xác định các MT nuôi cấy bề mặt tối ưu cho việc sản xuất kháng sinh, sử dụng giống cấp 1 để lên men gián đoạn trong các MTdt tương ứng.
+ Tiến hành:
Tạo giống cấp 1: Chủng giống Streptomyces 15.29 sau khi nuôi cấy trên thạch nghiêng đủ 6 ngày tuổi được cấy vô trùng sang bình nón chứa 100ml MT2dt bằng 10ml nước vô trùng, lắc trên máy lắc tròn ở nhiệt độ 28oC ± 0,1oC, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 48h.
Lên men chọn môi trường: sau 48h nhân giống, tiến hành lên men trên 3 MTdt khác nhau để chọn MT lên men tốt nhất. Giống cấp 1 được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa các MTdt với tỷ lệ Vgiống : Vmôi trường = 1:10. Các bình lên men được lắc ở nhiệt độ 28oC ± 0,1oC, tốc độ 140 vòng/phút trong 120h. Sau đó lọc hoặc ly tâm rồi thử HTKS bằng phương pháp giếng thạch.
Lên men chọn chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất: các dạng chủng, biến chủng cần thử được nhân giống cấp 1 trên MT2dt, sau đó lên men trên môi trường tối ưu chọn được ở bước trên. Thử HTKS dịch lên men bằng
phương pháp giếng thạch.
2.3.6. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ.
+ Chỉnh dịch lọc về pH 5 bằng NaOH 1N và HCl 1N, + Chiết dịch lọc đã chỉnh pH với DM.
Cho dịch lọc và dung môi ethylacetat vào bình gạn theo tỷ lệ Vdung môi : Vdịch lọc = 1:5. Sau đó lắc kỹ, để yên 1 giờ cho phân lớp. Tách riêng lấy lớp DM và dịch lọc. + Sau mỗi lần chiết, lớp DM và lớp nước được thử HTKS bằng phương pháp khoanh giấy lọc.
2.3.7. Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng
+ Cắt bản mỏng có kích thước thích hợp, hoạt hóa ở 110oC trong 30 phút.
+ Pha hỗn hợp dung môi theo đúng tỷ lệ, cho vào bình sắc ký (không quá 1cm), để bão hòa trong 30 phút.
+ Dùng mao quản đường kính 0,5mm chấm dung dịch cần sắc ký lên bản mỏng, chấm nhiều lần, để khô tự nhiên.
+ Đặt bản mỏng vào bình sắc ký. Cho dung môi chạy lên khoảng ¾ chiều dài bản mỏng thì lấy ra, đánh dấu đường DM chạy.
+ Xác định vết theo các phương pháp sau:
Nhìn bằng mắt thường (những vết có màu),
Soi đèn tử ngoại,
Hiện hình VSV: đặt bản mỏng vào đĩa Petri đã tiệt trùng, đổ một lớp vừa phải môi trường thạch thường đã cấy VSV kiểm định sao cho bản mỏng chìm trong thạch. Để vào tủ 37oC, ủ trong 18-24h, vòng vô khuẩn xuất hiện nếu có kháng sinh.
+ Tính hệ số Rf :
Rf =
Trong đó: a: khoảng cách từ vạch xuất phát đến tâm vết
2.3.8. Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay.
Pha DMHC thu được sau khi chiết được cất quay bằng máy cất quay chân không Buchi WaterBath B480. Cạo lấy cắn, gom lại, vết được hòa tan bằng một lượng nhỏ methanol, đổ gộp vào cốc có mỏ sạch, bốc hơi cách thủy đến khô. Thu lấy kháng sinh thô, cân.
2.3.9. Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột
+ Pha DM chạy theo đúng tỷ lệ.
+ Chuẩn bị cột: Cột đường kính 1cm, dài 50cm, rửa sạch, tráng cồn, sấy khô. + Chất nhồi cột: Silicagel 60 F 254 Merck cỡ hạt 0,040-0,063 mm.
Cân khoảng 6g hạt, hoạt hóa ở 110oC trong 30 phút. Đem hòa 5 g với hệ dung môi chạy sắc ký và đưa lên cột.
+ Bột kháng sinh thô được hòa tan trong một lượng tối thiểu methanol, rồi trộn với khoảng 1g silicagel đã hoạt hóa. Sấy ở 50oC cho bay hết methanol rồi cho lên cột. Ổn định cột trong 30 phút. Cho DM chạy qua cột với tốc độ 0,5ml/ phút. Lấy các phân đoạn vào ống nghiệm sạch, mỗi phân đoạn khoảng 3-5ml.
+ Xác định các phân đoạn có chứa kháng sinh cần tách: thử HTKS các phân đoạn bằng phương pháp khoanh giấy lọc. Các phân đoạn có HTKS được tiến hành sắc ký lớp mỏng với hệ DM tách tốt nhất. Các phân đoạn chính là các phân đoạn có những vết có Rf tương đương và có hoạt tính kháng sinh mạnh.
2.3.10. Phương pháp thu tinh thể kháng sinh tinh khiết.
+ Các phân đoạn chính được gộp vào bình cầu, cất quay chân không ở áp suất - 0,09 atm, thu bột kháng sinh vào ống nghiệm sạch. Sau đó bột kháng sinh được kết tinh lại bằng hỗn hợp dung môi: hòa tan bột kháng sinh bằng lượng tối thiểu ethylacetat, sau đó thêm n-hexan với lượng gấp 4-5 lần, tạo mầm tinh thể, cho kết tinh.
+ Lọc, sấy khô ở 50oC để thu kháng sinh tinh khiết.
2.3.11. Sơ bộ xác định kháng sinh khiết thu được.
Bột kháng sinh tinh khiết được đem đi đo các thông số: nhiệt độ nóng chảy, phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại, phổ khối để sơ bộ dự đoán cấu trúc kháng sinh.
CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN.
3.1. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên
+ Mục đích: Chọn dạng chủng có hoạt tính kháng sinh cao trong quần thể. + Kết quả: Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên được giới thiệu ở bảng 3.1
Bảng 3.1: Kết quả thử HTKS sau sàng lọc ngẫu nhiên
Dạng chủng
Kết quả Dạng
chủng
Kết quả
S. aureus P. mirabilis S. aureus P. mirabilis
(mm) s (mm) s (mm) s (mm) s 1 24,61 0,83 26,28 1,02 16 24,93 0,57 23,10 1,16 2 24,18 0,52 25,80 1,16 17 21,81 0,80 20,90 0,62 3 24,21 0,58 23,79 1,01 18 25,86 1,01 21,31 0,31 4 21,79 1,27 22,92 1,00 19 26,34 0,96 23,75 0,56 5 24,13 1,25 25,49 0,45 20 23,08 0,62 20,69 1,12 6 24,59 0,77 23,28 1,01 21 23,26 0,19 21,61 0,80 7 23,05 0,42 23,43 0,52 22 26,34 0,27 24,97 0,89 8 21,14 0,21 22,51 1,12 23 23,78 1,37 23,62 0,60 9 20,85 0,75 21,77 0,85 24 24,03 1,05 24,21 0,99 10 23,18 0,50 26,50 1,05 25 21,08 0,75 22,29 0,65 11 26,27 0,92 22,51 1,02 26 25,46 1,62 24,34 1,25 12 26,27 0,92 22,51 1,02 27 25,99 0,49 25,54 0,59 13 23,88 0,60 22,08 0,72 28 24,73 1,07 24,39 0,46 14 22,71 0,50 23,41 0,74 29 22,61 0,94 20,86 0,64 15 24,11 0,48 22,14 0,47 30 27,97 0,57 25,38 1,13 Nhận xét: Sau khi sàng lọc ngẫu nhiên thấy các biến chủng 10, 27, 30 cho hoạt tính kháng sinh cao nhất. Vì vậy các chủng SLNN.10, SLNN.27, SLNN.30
được giữ lại cho nghiên cứu đột biến cải tạo giống tiếp theo.