2.4.1.Phương pháp nghiên cứu khả năng kháng với hóa chất của muỗi Aedes
2.4.1.1 Phương pháp thu mẫu
Thực hiện theo hƣớng dẫn của Viện Sốt rét – Ký sinh trùng và côn trùng Trung ƣơng [41]:
- Điều tra tất cả các dụng cụ chứa nƣớc trong và ngoài nhà của các hộ gia đình để xác định dụng cụ chứa nƣớc có bọ gậy Aedes. Thu thập bọ gậy bằng vợt hoặc pipet. Bọ gậy của mỗi điểm nghiên cứu đƣợc để riêng trong từng lọ để vận chuyển. Trên đó có ghi nhãn gồm: thông tin về địa điểm và thời gian thu thập mẫu trƣớc khi vận chuyển về phòng thí nghiệm để tiến hành nhân nuôi.
2.4.1.2. Nhân nuôi bọ gậy trong phòng thí nghiệm
Thực hiện theo hƣớng dẫn của Viện Sốt rét – Ký sinh trùng và côn trùng Trung ƣơng [41]:
- Chuyển bọ gậy vào các khay để sẵn trong buồng nuôi. Dán nhãn có thông tin về địa điểm, ngày tháng và thế hệ thu thập (F0) lên từng lồng.
- Cho bọ gậy ăn thức ăn do Viện Sốt rét – Ký sinh trùng và côn trùng Trung ƣơng sản xuất.
- Bọ gậy nuôi trong phòng nuôi côn trùng với điều kiện nhiệt độ 250C -280C, độ ẩm 80% ± 10, thời gian chiếu sáng 8/24 giờ.
- Hàng ngày nhặt quăng cho vào lồng nuôi riêng, khi quăng lột xác thành muỗi thì tiến hành định loại để xác định muỗi Ae. aegypti và Ae. albopictus.
- Cho muỗi đã định loại vào lồng riêng, cho hút dung dịch glucoza 10%. Muỗi 2-3 ngày tuổi cho hút máu chuột nhắt trắng, sau khi hút máu 2-3 ngày cho muỗi đẻ.
- Lót bên trong cốc thủy tinh 1 lớp giấy thấm có ghi rõ thời gian để thu trứng, đổ nƣớc ngập nửa giấy. Trứng đƣợc thu hàng ngày sau đó để khô rồi bảo quản trong lọ thủy tinh có nắp đậy kín.
29
Khi trứng nở, chăm sóc bọ gậy cho đến khi thành quăng và muỗi trƣởng thành. Muỗi nở hàng ngày đƣợc đƣa vào các lồng riêng biệt có dãn nhãn ghi rõ ngày tháng muỗi nở để thực hiện thử nhạy cảm với hóa chất diệt côn trùng.
- Muỗi cái 2-5 ngày tuổi dùng để thử độ nhạy cảm theo phƣơng pháp giấy tẩm hoá chất của WHO.
2.4.1.3 Phương pháp thử nghiệm sinh học
Thực hiện theo hƣớng dẫn của WHO/CDS/CPC/MAL/98.12 [53]. a. Giấy thử
Giấy thử nghiệm đƣợc tẩm hóa chất, giấy đối chứng đƣợc tẩm dung môi pha hóa chất đó do WHO cung cấp:
Bảng 2 1. Các loại hoá chất và nồng độ thử nghiệm
TT Nhóm hóa chất Tên hóa chất Nồng độ (%)
1 Phốt pho hữu cơ Malathion 5
2 Pyrethroid
Permethrin 0,75
Deltamethrin 0,05
b. Dụng cụ thử nghiệm (do WHO cung cấp)
- 14 ống nhựa có chiều dài 12,5 cm, đƣờng kính 4,4 cm. Trong đó 5 ống có chấm đỏ dùng để cho muỗi tiếp xúc với hóa chất, 9 ống có chấm xanh dùng cho muỗi nghỉ và đối chứng; Nắp của đầu ống đƣợc bịt chặt bằng vải màn để muỗi không thoát ra ngoài.
- 7 nắp kéo có khoan lỗ để chuyển muỗi từ ống nhựa này sang ống nhựa khác. - 7 tờ giấy sạch để dùng cho ống nghỉ, 2 tờ giấy đối chứng và 5 tờ giấy tẩm hóa chất cần thử với nồng độ khuyến cáo của WHO (giấy tẩm do hóa chất và giấy chứng WHO cung cấp).
- 28 vòng kim loại để giữ giấy sát vào thành ống nhựa. - 2 ống hút (có thể thay bằng ống tuýp 2 đầu).
30 - Biểu mẫu ghi chép số liệu.
c) Điều kiện thử nghiệm
- Phòng thử nghiệm bảo đảm không có tồn dƣ hóa chất diệt côn trùng. - Nhiệt độ phòng từ 250 C ± 2, độ ẩm từ 80% ± 10%.
- Dụng cụ thử nghiệm phải sạch, khô.
- Muỗi thử nghiệm: Muỗi cái Aedes F1 thu từ bọ gậy bắt tại thực địa. Muỗi từ 2-5 ngày tuổi, chƣa hút máu, đã hút nƣớc đƣờng glucoza 10%. Muỗi thử nghiệm phải khỏe mạnh, cơ thể nguyên vẹn.
- Số muỗi thử nghiệm: Mỗi loại hóa chất cần 140 muỗi cái, trong đó 100 muỗi tiếp xúc với hóa chất, 40 muỗi cho tiếp xúc với giấy đối chứng.
d)Quy trình thử nghiệm (WHO/CDC/CPC/MAL/98.12)
Bƣớc 1: Chuẩn bị các ống nghỉ: đặt một tờ giấy trắng sạch cuộn thành hình trụ lồng vào bên trong mỗi ống nghỉ. Dùng vòng kim loại trắng giữ chặt tờ giấy cho sát vào thành ống. Lắp tấm đế vào ống.
Bƣớc 2: Sử dụng ống tuýp 2 đầu bắt muỗi từ trong các lồng muỗi, chọn những con muỗi khỏe mạnh đạt tiêu chuẩn cho vào mỗi ống nghỉ 20 con.
Bƣớc 3: Chuẩn bị ống đối chứng và ống thử nghiệm: Dùng tờ giấy đối chứng cuộn thành hình trụ lồng vào mỗi ống trứng và chèn vòng kim loại giữ giấy sát vào thành ống. Làm tƣơng tự với giấy tẩm hóa chất.
Bƣớc 4: Chuyển muỗi vào các ống đối chứng và ống thử nghiệm: lắp ống nghỉ vào các ống đối chứng và ống thử nghiệm. Chuyển tấm đế vào giữa lỗ thông giữa 2 ống thông nhau. Thổi nhẹ muỗi từ ống nghỉ sang ống đối chứng trƣớc và ống thử nghiệm sau. Đóng tấm đế lại và tháo ống nghỉ ra.
Bƣớc 5: Để các ống tiếp xúc dựng đứng, phía có lƣới hƣớng lên trên trong thời gian muỗi tiếp xúc hóa chất là 60 phút, theo dõi và đếm số muỗi quỵ trong thời gian tiếp xúc (5,10,15,20,30,40,50,60 phút).
Bƣớc 6: Hết thời gian tiếp xúc, chuyển muỗi sang ống nghỉ bằng các bƣớc tiến hành ngƣợc lại ở bƣớc 4. Đặt miếng bông tẩm nƣớc đƣờng glucoza 10% lên phía trên mặt lƣới của ống nghỉ.
31
Bƣớc 7: Giữ ống nghỉ trong 24 giờ ở nơi tách biệt, nhiệt độ không quá 300C, theo dõi nhiệt độ và độ ẩm trong suốt quá trình thử nghiệm.
Bƣớc 8: Sau 24 giờ tính số muỗi chết ở các lô thí nghiệm. Con muỗi nào không bay đƣợc thì coi là muỗi chết dù chân, cánh, pan, vòi vẫn cử động đƣợc. Ghi kết quả vào phiếu.
e) Đánh giá kết quả thử nghiệm
- Tỷ lệ muỗi chết ở lô đối chứng lớn hơn 20% thì kết quả thử nghiệm bị huỷ, và làm lại thử nghiệm.
- Nếu tỷ lệ muỗi chết của lô đối chứng < 5%: giữ nguyên tỷ lệ chết của lô tiếp xúc với hóa chất.
- Nếu tỷ lệ muỗi chết của lô đối chứng trong khoảng 5% - 20% thì tỷ lệ muỗi chết trong lô thử nghiệm sẽ đƣợc điều chỉnh bằng công thức Abbott:
Công thức Abbott:
% chết thí nghiệm - % chết đối chứng
Tỷ lệ chết = --- x 100 100 - % chết đối chứng
Sau 24 giờ, căn cứ trên tỷ lệ muỗi chết để đánh giá tính nhạy, kháng của muỗi với hóa chất thử.
- Tỷ lệ muỗi chết từ 98%-100%: Muỗi còn nhạy cảm với hóa chất thử. - Tỷ lệ muỗi chết từ 80% - 97%: Muỗi tăng sức chịu đựng với hóa chất tại
nồng độ thử.
- Tỷ lệ muỗi chết < 80%: Muỗi kháng với hóa chất tại nồng độ thử.
2.4.1.4.Phương pháp vẽ bản đồ kháng hóa chất của muỗi Aedes
- Số liệu về độ nhạy cảm của muỗi Aedes đƣợc nhập vào phần mềm Excell 2010.
- Sử dụng phần mềm Arcgis 9.3 để vẽ bản đồ nhạy cảm với hóa chất thử của muỗi Aedes.
2.4.2. Phương pháp phân tích mối tương quan giữa một số yếu tố sinh thái với các chỉ số muỗi và bọ gậy Ae. aegypti
32
- Trong nghiên cứu này chúng tôi xem xét mối tƣơng quan giữa các nhân tố nhiệt độ, độ ẩm, lƣợng mƣa với chỉ số mật độ muỗi (MĐM) và chỉ số Breteau (BI) của muỗi Ae. aegypti ở 20 xã (phƣờng) trọng điểm về SXHD tại Hà Nội.
2.4.2.1 Dữ liê ̣u nhiệt độ, độ ẩm, lượng mưa
Dữ liệu về nhiệt độ, độ ẩm, lƣợng mƣa hàng tháng đƣợc thu thập từ Trung tâm nghiên cứu Khí hậu-Khí tƣợng, Đài khí tƣợng Láng. Những dữ liệu này đƣợc đối chiếu với các chỉ số mật độ muỗi (MĐM) và chỉ số BI của Ae. aegypti để đánh giá mối tƣơng quan.
2.4.2.2. Vật liệu nghiên cứu
Dụng cụ điều tra thu thập muỗi và bọ gậy: - Tuýp bắt muỗi
- Bông không thấm nƣớc - Đèn pin
- Bút viết trên kính - Phiếu điều tra - Ống hút bọ gậy - Vợt bọ gậy - Lọ đựng bọ gậy
Dụng cụ, vật liệu làm tiêu bản bọ gậy: - Kim thủy tinh
- Lam kính - Lamen - Đĩa petri - Giá đựng lam - Kính hiển vi
2.4.2.3. Xác định các chỉ số mật độ muỗi và chỉ số BI
Tiến hành điều tra cắt ngang mỗi tháng 1 lần vào tuần thứ hai và thứ ba hàng tháng. Các chỉ số muỗi và bọ gậy đƣợc xác định theo "Hƣớng dẫn giám sát và
33
phòng chống SXHD" và "Tài liệu hướng dẫn phòng chống sốt Dengue và sốt xuất huyết Dengue" của WHO [4, 38].
Thu thập muỗi trƣởng thành bằng phƣơng pháp soi bắt muỗi đậu nghỉ trong nhà bằng ống tuýp. Soi bắt muỗi cái đậu nghỉ trên quần áo, chăn màn, các đồ vật trong nhà vào buổi sáng, mỗi nhà soi bắt muỗi trong 15 phút. Muỗi sau khi bắt đƣợc có thể định loại ngay tại thực địa căn cứ trên các đặc điểm về hình thái.
Số nhà điều tra cho mỗi điểm là 30 nhà. Chỉ số đƣợc sử dụng để theo dõi trong nghiên cứu này là chỉ số mật độ muỗi.
Chỉ số MĐM là số muỗi cái Ae. aegypti trung bình trong một gia đình điều tra.
Chỉ số MĐM (con/nhà) = Số muỗi cái Ae. aegypti bắt đƣợc Số nhà điều tra
Thu thập bọ gậy đƣợc thực hiện cùng thời điểm với thu thập muỗi trƣởng thành. Sau khi bắt muỗi, tiến hành điều tra bọ gậy bằng quan sát, ghi nhận, thu thập ở toàn bộ DCCN trong và quanh nhà. Bọ gậy tại mỗi DCCN thu thập tƣơng tự phƣơng pháp thu thập để phục vụ thử nhạy cảm đã trình bày ở phần trên. Bọ gậy sau khi thu thập sẽ đƣợc chuyển về phòng thí nghiệm của Trung tâm Y tế dự phòng Hà Nội để tiến hành định loại theo loài. Kết quả định loại sau đó sẽ đƣợc sử dụng để tính các chỉ số. Trong nghiên cứu này chỉ số đƣợc sử dụng để theo dõi là chỉ số BI.
Chỉ số Breteau (BI) là số dụng cụ chứa nƣớc có bọ gậy Ae. aegypti trong 100 nhà điều tra. Tối thiểu điều tra 30 nhà, vì vậy BI đƣợc tính nhƣ sau:
BI =
Số DCCN có bọ gậy Ae. aegypti
x 100 Số nhà điều tra
2.4.2.4 Phân tích và xử lý số liệu xác định mối tương quan giữa các yếu tố nhiệt độ, độ ẩm, lượng mưa với các chỉ số MĐM và BI
34
- Nhập liệu vào phần mềm SPSS 11.3 để phân tích.
- Phân tích mối tƣơng quan bằng hồi qui tuyến tính qua hệ số tƣơng quan r [1]: Giá trị hệ số tƣơng quan r dao động từ -1 đến 1
Nếu r >0 là tƣơng quan thuận. Nếu r <0 là tƣơng quan nghịch.
r càng gần ±1 thì tƣơng quan càng chặt.
Bảng 2 2. Giá trị của hệ số tƣơng quan và ý nghĩa
TT Hệ số tƣơng quan r Ý nghĩa
1 ± 0,01 đến ± 0,1 Mối tƣơng quan thấp, không đáng kể
2 ± 0,2 đến ± 0,3 Tƣơng quan thấp
3 ± 0,4 đến ± 0,5 Tƣơng quan trung bình
4 ± 0,6 đến ± 0,7 Tƣơng quan chặt
5 ± 0,8 đến ± 1 Tƣơng quan rất chặt
35
CHƢƠNG3.KẾTQUẢNGHIÊNCỨUVÀBÀNLUẬN
3.1. Khả năng kháng với hóa chất diệt côn trùng của muỗi Aedes tại các điểm nghiên cứu
Ae. aegypti và Ae. albopictus là hai loài muỗi thuộc giống Aedes đƣợc tìm thấy ở khu vực Hà Nội đóng vai trò quan trọng trong việc lan truyền bệnh SXHD. Do vậy chúng tôi tiến hành đánh giá độ nhạy cảm của 2 loài muỗi này với 3 hóa chất diệt côn trùng là Deltamethrin; Permethrin; Malathion tại 21 xã (phƣờng) thuộc 10 quận /huyện trọng điểm về SXHD của thành phố Hà Nội.
3.1.1. Khả năng kháng với hóa chất diệt côn trùng của muỗi Ae. aegypti tại các điểm nghiên cứu ở Hà Nội giai đoạn 2011-1014
Trong 4 năm từ 2011-2014 chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu khả năng kháng của muỗi Aedes với 3 hóa chất diệt côn trùng là Deltamethrin; Permethrin; Malathion tại 23 điểm nghiên cứu (20 xã (phƣờng)). Kết quả chi tiết đƣợc trình bày trong bảng từ 3.1 đến 3.4.
Trƣớc tiên là kết quả thử nghiệm năm 2011. Có 7 điểm đƣợc tiến hành thu thập bọ gậy và tiến hành nhân nuôi phát triển muỗi F1 phục vụ thí nghiệm, trong đó có 2 điểm thuộc quận Hà Đông (phƣờng Văn Quán và Quang Trung); 2 điểm thuộc quận Hai Bà Trƣng (phƣờng Trƣơng Định và Đồng Tâm); 2 điểm thuộc huyện Thanh Trì (Xã Tân Triều và Tả Thanh Oai); 1 điểm thuộc huyện Từ Liêm cũ (xã Trung Văn). Kết quả thử nghiệm đƣợc trình bày trong bảng 3.1 cho thấy trong 6 điểm thử nghiệm với Deltamethrin và Permethrin thì có 5 điểm muỗi Ae. aegypti đã kháng, còn lại 1 điểm muỗi cũng đã TSCĐ (xã Tả Thanh Oai). Tỷ lệ % muỗi chết sau 24h tiếp xúc với 2 lại hóa chất này cũng rất khác nhau. Trong 5 điểm muỗi kháng với Permethrin tỷ lệ muỗi chết sau 24 giờ tiếp xúc rất thấp, dao động từ 2% (phƣờng Trƣơng Định ) đến 17% (xã Trung Văn); riêng muỗi thu thập tại xã Tả Thanh Oai đã TSCĐ với cả hai hóa chất này tại nồng độ thử. Với Deltamethrin tỷ lệ này dao động từ 22% (phƣờng Trƣơng Định) đến 78% (phƣờng Văn Quán). Ngoài ra trong kết quả thử nghiệm chúng tôi cũng nhận thấy tại các điểm muỗi đã kháng
36
với Permethrin thì cũng kháng với Deltamethrin và ngƣợc lại. Muỗi Ae. aegypti còn nhạy với Malathion tại tất cả 7/7 điểm nghiên cứu (bảng 3.1)
Bảng 3. 1. Kết quả thử nhạy cảm với hóa chất diệt côn trùng của muỗi Ae. aegypti ở Hà Nội năm 2011
TT Địa điểm Số muỗi thử nghiệm/ 1 hóa chất (con) Tỷ lệ muỗi chết sau 24h (%)
Deltamethrin Permethrin Malathion
1 P.Văn Quán – Hà Đông 100 78 10 100
2 P. Quang Trung –Hà Đông 100 71 4 100
3 P. Trƣơng Định - Hai Bà
Trƣng 100 22 2 100
4 P. Đồng Tâm –Hai Bà Trƣng 100 72 Không thử 100
5 X.Tân Triều –Thanh Trì 100 56 7 100
6 X. Tả Thanh Oai –Thanh Trì 100 83 93 100
7 X. Trung Văn –Từ Liêm cũ) 100 Không thử 17 100
8 Đối chứng (*) 40 0 0 0
Ghi chú: (*): Lô đối chứng được tiến hành ở tất cả các điểm thử nghiệm, tỷ lệ muỗi chết sau 24 giờ đều là 0%
Trong năm 2012 chúng tôi cũng tiến hành nghiên cứu khả năng kháng hóa chất diệt côn trùng của muỗi Ae. aegypti với các hóa chất thử tại 8 điểm thuộc quận Hoàng Mai (phƣờng Hoàng Văn Thụ), quận Đống Đa (phƣờng Nam Đồng, Ô Chợ Dừa), quận Ba Đình (phƣờng Trúc Bạch), quận Hoàn Kiếm (phƣờng Hàng Bồ), quận Hà Đông (phƣờng Vạn Phúc), huyện Từ Liêm cũ (xã Trung Văn). Kết quả trình bày ở bảng 3.2 cho thấy muỗi thu thập tại 8/8 điểm thử nghiệm đã kháng với Deltamethrin và Permethrin. Tỷ lệ muỗi chết muỗi chết 24 giờ sau khi tiếp xúc với Deltamethrin không cao và có sự khác biệt giữa các điểm nghiên cứu. Trong khi đó tỷ lệ này với Permethrin là rất thấp, thậm chí tỷ lệ chết sau 24h của muỗi thu thập tại phƣờng Hàng Bồ - quận Hoàn Kiếm là 0%, muỗi thu thập tại xã Trung Văn và
37
phƣờng Đồng Tâm là 2%, cao nhất tại phƣờng Vạn Phúc – quận Hà Đông là 19%. Muỗi thu thập tại tất cả các điểm nghiên cứu còn nhạy với Malathion.
Nhìn chung, kết quả thử nhạy cảm với Deltamethrin và Permethrin năm 2011và 2012 cho thấy tại các điểm nghiên cứu muỗi Ae. aegypti đã kháng với hóa chất thử, tỷ lệ muỗi chết sau 24h tiếp xúc với Permethrin thấp hơn rất nhiều so với Deltamethrin.
Bảng 3. 2. Kết quả thử nhạy cảm với hóa chất diệt côn trùng của muỗi Ae. aegypti ở Hà Nội năm 2012
TT Địa điểm Số muỗi thử nghiệm/ 1 hóa chất (con) Tỷ lệ muỗi chết sau 24h (%)
Deltamethrin Permethrin Malathion