- Đo phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại (UV), phổ khối (MS). - Biện giải kết quả thu được.
2.3. Phƣơng pháp thực nghiệm
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy giữ giống
* Mục đích: Bảo quản các chủng giống thuần khiết đã phân lập, các dạng chủng sau sàng lọc ngẫu nhiên, các biến chủng sau đột biến nhân tạo cho các nghiên cứu tiếp theo.
* Tiến hành: Chuẩn bị môi trường phân lập, đun sôi, khuấy trộn, phân đều vào các ống nghiệm, mỗi ống 5-6ml, nút bông. Tiệt trùng ở 120o
C/120 phút, 1 atm rồi đặt nghiêng cho đông. Khi môi trường nguội, dùng que cấy vô trùng cấy zigzac các bào tử Streptomyces 184.225 đã thuần khiết lên bề mặt thạch nghiêng. Nuôi cấy ở 28oC trong 6 ngày cho xạ khuẩn phát triển, cất giữ trong tủ lạnh (2-4oC). Định kỳ cấy truyền sau 3-6 tháng.
2.3.2. Phương pháp xác định hình thái xạ khuẩn
Chuẩn bị ống giống gốc được nuôi cấy trong ống thạch nghiêng đủ 6 ngày tuổi. Xác định đặc điểm hình thái và sắc tố hòa tan:
MT xác định: ISP2, ISP3 đã được hấp tiệt trùng, đổ vào đĩa Petri, mỗi MT làm 4 đĩa. Cấy zigzac bào tử của Streptomyces 184.225 lên bề mặt thạch. Ủ ở 28oC, tiến hành quan sát sau khi nuôi cấy 7, 14 và 21 ngày.
- Màu của khuẩn ty khí sinh: Quan sát trực tiếp trên bề mặt khuẩn lạc có thể có: màu đỏ (R), màu vàng (Y), xanh lá cây (G), xanh da trời (B), tím (V), xám (Gy), trắng (W), trường hợp có các màu xen kẽ thì ghi các màu liền nhau.
- Màu của khuẩn ty cơ chất: Quan sát mặt sau của khuẩn lạc (mặt dưới đĩa Petri), thường có các màu: vàng nâu, vàng nâu ánh đỏ hoặc da cam, vàng nâu ánh xanh da trời hoặc tím, vàng nâu lẫn xanh lá cây. Nếu thấy các màu trên ký hiệu là (1), nếu không thấy ký hiệu là (0).
- Chuỗi bào tử và bề mặt bào tử được quan sát dưới kính hiển vi điện tử có độ phóng đại cao.
+ Dạng chuỗi bào tử: Thẳng (R), uốn cong (Rf), móc câu (RA), lò xo (S). Nếu chuỗi bào tử có nhiều đặc điểm thì ghi đầy đủ các đặc điểm (ví dụ: SRA: chuỗi lò xo móc câu).
+ Bề mặt bào tử có thể có các dạng sau: phẳng nhẵn (Sm), sần sùi mụn cơm (Wa), có gai (Sp), có tóc (Ha).
- Sắc tố hòa tan nằm ngay trong môi trường có các màu: vàng, xanh, đỏ, tím… Nếu có ký hiệu là (1), nếu không có kí hiệu là (0).
2.3.3. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán
* Nguyên tắc: Mẫu thử (chứa chất kháng sinh) được đưa lên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy VSV kiểm định, kháng sinh từ mẫu thử khuếch tán vào môi trường thạch sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn.
* Tiến hành:
+ Tạo hỗn dịch VSV kiểm định: vi khuẩn kiểm định được nuôi cấy vào môi trường canh thang, nuôi cấy tạo hỗn dịch vi khuẩn ổn định có nồng độ 107-108 tế bào/ml, ủ trong tủ ấm ở 37oC trong 18-24h. Đưa hỗn dịch này vào môi trường thạch thường ở 45 – 50oC sau khi đã hấp tiệt trùng với tỷ lệ V giống/V thạch thường = 2,5/100. Lắc đều để vi khuẩn kiểm định phân tán đều vào môi trường, đổ vào đĩa Petri với thể tích 20ml/đĩa.
+ Các phương pháp thử:
- Phương pháp khối thạch: Đưa các mẫu thử là các khối thạch ( = 6mm) chứa vi sinh vật sinh kháng sinh cần thử lên bề mặt môi trường vi sinh vật kiểm định.
- Phương pháp giếng thạch: Đục các giếng thạch trên môi trường VSV kiểm định ( = 6mm), sau đó nhỏ 0,05ml mẫu thử dạng dung dịch vào mỗi giếng thạch.
tẩm dung dịch thử (3 lần), sấy khô ở 45oC, sau đó đặt các khoanh giấy này lên bề mặt môi trường VSV kiểm định.
Các đĩa Petri có mẫu thử được đem ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 37oC trong 18- 24h. Sau thời gian ủ trên tiến hành đánh giá kết quả dựa vào đường kính vòng vô khuẩn đo bằng thước kẹp Palmer độ chính xác 0,02 mm và được đánh giá theo công thức: 2 1 1 ( ) 1 n n i i i i D D D D s n n
D(mm): Đường kính trung bình vòng vô khuẩn. Di (mm): Đường kính vòng vô khuẩn thứ i. s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh. n: Số thí nghiệm làm song song (n = 3).
2.3.4. Phương pháp chọn môi trường nuôi cấy thích hợp
* Mục đích: tìm môi trường nuôi cấy và bảo quản chủng xạ khuẩn ổn định, giữ được hoạt tính kháng sinh tốt nhất.
* Tiến hành: chủng được cấy lên 5 môi trường (MT1, MT2, MT5, MT6, MT7) trong đĩa Petri, ủ ở 280
C trong 6 ngày, sau đó thử HTKS bằng phương pháp khối thạch. Tiến hành thử song song trên 3 mẫu, chọn môi trường có HTKS mạnh nhất để tiến hành nuôi cấy và nghiên cứu tiếp.
2.3.5. Phương pháp cải tạo và chọn giống
2.3.5.1. Phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên
* Mục đích: Chọn lọc ngẫu nhiên những cá thể cho hoạt tính kháng sinh cao nhất so với các cá thể khác từ các giống thuần khiết.
- Cân pha MT2 (môi trường phân lập), hấp tiệt trùng, đổ môi trường ra đĩa Petri vô trùng (20ml/đĩa).
- Chuẩn bị hỗn hợp dịch bào tử: lấy 1 vòng que cấy bào tử xạ khuẩn
Streptomyces 184.225 từ ống giống rồi hòa vào ống nghiệm chứa 10ml nước vô trùng, lắc cho bào tử phân tán đều thu được hỗn dịch bào tử ở độ pha loãng 10-1
(định ước). Tiếp tục pha loãng hỗn dịch này bằng nước vô trùng đến nồng độ 10-6. - Cấy bào tử: dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1ml hỗn dịch bào tử ở các độ pha loãng 10-5-10-6, nhỏ lên bề mặt của MT2 trong đĩa Petri, nuôi xạ khuẩn trong tủ ấm ở 28oC trong 6 ngày để khuẩn lạc phát triển.
- Sàng lọc: Sau 6 ngày nuôi, chọn ngẫu nhiên các khuẩn lạc phát triển đa dạng mọc riêng rẽ, cấy zigzac lên bề mặt MT2 trong đĩa Petri (chọn 32 - 33 khuẩn lạc) sau đó nuôi ở 28o
C trong 6 ngày.
- Thử HTKS của các biến chủng bằng phương pháp khối thạch, đánh giá kết quả. Căn cứ kết quả vòng vô khuẩn, lựa chọn và giữ lại 3 chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
2.3.5.2. Đột biến cải tạo giống bằng ánh sáng UV
* Mục đích: Cải tạo những chủng có hoạt tính cao sau sàng lọc ngẫu nhiên nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh.
* Tiến hành:
- Pha hỗn dịch bào tử: lấy 1 vòng que cấy bào tử biến chủng tốt nhất của sàng lọc ngẫu nhiên cho vào 10ml nước vô trùng lắc đều tạo hỗn dịch bào tử ở độ pha loãng 10-1 (định ước). Lấy 1ml hỗn dịch bào tử này pha loãng đến nồng độ 10-6 làm mẫu chứng, 9ml còn lại được pha vào đĩa Petri vô trùng và được đem đột biến dưới tác dụng ánh sáng UV với = 254 nm, khoảng cách chiếu 60cm, thời gian chiếu 5 phút. Hỗn dịch bào tử sau khi được chiếu UV được đưa vào chỗ tối 2h, sau đó dùng pipet vô trùng pha loãng đến nồng độ 10-4
- Cấy bào tử sau đột biến: dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1ml mẫu chứng ở nồng độ 10-6
và 0,1ml hỗn dịch bào tử đã đột biến ở nồng độ 10-4, 10-5 cho vào đĩa Petri chứa MT2, dùng que trang dàn đều giọt hỗn dịch bào tử trên bề mặt thạch. Mỗi nồng độ pha loãng tiến hành trên 3 đĩa Petri song song, sau đó nuôi cấy ở 28oC cho khuẩn lạc phát triển. Sau 6 ngày, đếm số khuẩn lạc sống sót.
Tỷ lệ phần trăm xạ khuẩn sống sót được tính theo công thức. Tỷ lệ sống sót =
0
N Nm
x 10-6+k x 100%
Nm: Số khuẩn lạc sau đột biến ở các nồng độ 10-k .
N0: Số khuẩn lạc trong mẫu chứng.
-k: Nồng độ pha loãng của hỗn dịch bào tử đã sử dụng.
Sàng lọc các khuẩn lạc sau đột biến tương tự như ở phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên, làm song song với mẫu chứng. Tính % biến đổi hoạt tính của biến chủng thứ i sau đột biến theo công thức:
% biến đổi hoạt tính =
0
D Di
x 100%
Di: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của biến chủng thứ i sau ĐB. D0: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của mẫu chứng.
Dựa vào kết quả thu được lựa chọn 3–5 biến chủng có % biến đổi hoạt tính cao nhất để nghiên cứu tiếp.
2.3.5.3. Đột biến cải tạo giống bằng tác nhân hóa học HNO2
Mục đích: Cải tạo những chủng có hoạt tính cao sau đột biến UV nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh.
Nguyên tắc : HCl + NaNO2 = NaCl + HNO2 Tiến hành :
- Pha hỗn dịch bào tử: lấy 1 vòng que cấy bào tử biến chủng tốt nhất của đột biến UV2 cho vào 10ml nước vô trùng lắc đều tạo hỗn dịch bào tử ở độ pha
loãng 10-1 (định ước). Lấy 1ml hỗn dịch bào tử này pha loãng đến nồng độ 10-6 làm mẫu chứng, 9ml còn lại được pha vào ống nghiệm.
- Đột biến bằng HNO2 : 9ml hỗn dịch bào tử ở nồng độ 10 -1, cho 0,07g NaNO2 vào ống hòa tan (nồng độ HNO2 : 0,1M). Sau đó, nhỏ HCl 0,1N vào ống nghiệm đó đến khi pH = 4,5 để 2-3 phút, rồi nâng đến pH = 7-8 bằng NaOH 0,1N dùng pipet vô trùng pha loãng đến 10-5 bằng nước cất vô trùng.
- Cấy các bào tử sau đột biến: dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1ml mẫu chứng ở nồng độ 10-6 và 0,1ml hỗn dịch bào tử đã đột biến ở nồng độ 10-4, 10-5 cho vào đĩa Petri chứa MT2, sau đó dùng que trang vô trùng dàn đều giọt hỗn dịch bào tử trên bề mặt thạch, mỗi độ pha loãng làm 3 đĩa song song. Sau đó nuôi cấy ở 28oC cho khuẩn lạc phát triển. Sau 6 ngày, đếm số khuẩn lạc sống sót.
Sau đó tính tỷ lệ phần trăm sống sót và thử KTKS tương tự như đột biến UV.
2.3.6. Phương pháp lên men chìm tổng hợp kháng sinh
* Mục đích: Chọn ra được chủng tốt nhất để định hướng cho phát triển sản xuất công nghiệp.
* Tiến hành:
- Tạo giống cấp 1: chủng giống Streptomyces 184.225 sau khi nuôi cấy trên MT2 thạch nghiêng đủ 6 ngày được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa 100ml MT2 dịch thể bằng 10ml nước vô trùng, đem lắc trên máy lắc ở nhiệt độ 280C, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 48h.
- Lên men: sau 48h nhân giống, giống cấp 1 được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa 100ml MT2 dịch thể với tỷ lệ Vgiống: V môi trường = 1:10. Các bình lên men được lắc 280C, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 120h. Sau 120h, lấy ra lọc hoặc ly tâm dịch lên men rồi thử HTKS bằng phương pháp giếng thạch.
- Chọn chủng có khả năng lên men sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất: các dạng chủng, biến chủng cần thử được nhân giống cấp 1 trên MT2dt, lên men trên môi trường tối thích đã chọn cho sinh tổng hợp kháng sinh. Thử hoạt tính dịch lên men
bằng phương pháp giếng thạch.
2.3.7. Phương pháp xác định độ bền nhiệt, độ bền pH của kháng sinh trong dịch lọc dịch lên men dịch lên men
- Xác định độ bền nhiệt: lấy khoảng 5-7ml dịch lọc dịch lên men vào 3 ống nghiệm. Ống thứ 1 để ở nhiệt độ thường, ống thứ 2 đun cách thủy 30 phút, ống thứ 3 đun sôi trực tiếp 10 phút. Đem thử HTKS bằng phương pháp giếng thạch, tiến hành trên 3 mẫu song song. Đánh giá kết quả.
- Xác định độ bền pH: lấy 5 ống dịch lọc lên men, mỗi ống 5-7 ml. Chỉnh pH dịch lên men trong mỗi ống về pH=3, pH=5, pH=7, pH=9, pH=11 bằng dung dịch NaOH 0,1N hoặc HCl 0,1N. Thử HTKS sau 1 ngày, 5 ngày bằng phương pháp giếng thạch. Đánh giá kết quả.
2.3.8. Các phương pháp chiết tách kháng sinh
2.3.8.1. Phương pháp chiết kháng sinh từ dịch lọc bằng dung môi hữu cơ * Mục đích: Xác định pH và dung môi thích hợp để tách hoạt chất kháng sinh ra khỏi hỗn dịch dịch lọc lên men.
* Tiến hành:
- Dùng phương pháp chiết 1 lần.
- Dịch lọc lên men sau khi đã được loai bỏ sinh khối được điều chỉnh về các mức pH=3, pH=5, pH=7, pH=9, pH=11 bằng dung dịch NaOH 0,1N hoặc HCl 0,1N. Cho dung môi hữu cơ và dịch lên men vào bình gạn với tỷ lệ Vdung môi: Vdịch lọc = 1:5. Lắc đều, để 1h cho phân lớp. Tách riêng lớp dung môi và dịch lọc. Sau đó thử HTKS của lớp dung môi hữu cơ và lớp nước bằng phương pháp khoanh giấy lọc. Căn cứ kết quả thu được chọn lấy dung môi hữu cơ và pH tối ưu để chiết.
2.3.8.2.Phương pháp tách kháng sinh bằng sắc ký Sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng
Mục đích: bước đầu sơ bộ biết được mẫu thử có bao nhiêu thành phần, mẫu thử có độ tinh khiết như thế nào.
Tiến hành:
- Bản mỏng sắc ký được hoạt hóa ở 1100C trong 30 phút.
- Pha các hệ dung môi theo đúng tỉ lệ, đổ vào bình sắc ký, cho bão hòa dung môi trong 30 phút sao cho lớp dung môi không quá 1cm.
- Chấm dịch chiết lên bản mỏng đã hoạt hóa, vết chấm cách mép dưới 1,5cm, cách 2 mép bên 1cm từ 3-5 lần. Để khô tự nhiên hoặc sấy ở 500C, đặt bản mỏng vào bình sắc ký khi dung môi chạy đến ¾ bản mỏng thì lấy ra, đánh dấu đường dung môi chạy.
- Sấy bản mỏng, soi đèn UV hoặc hiện hình bằng VSV.
- Phương pháp hiện hình VSV: đặt bản mỏng vào đĩa Petri vô trùng, đổ thạch có cấy VSV kiểm định lên, ủ ở 370
C trong 18-24h. Xác định vết kháng sinh bằng vòng vô khuẩn. Tính Rf: Rf = dm v d d
trong đó: dv: khoảng cách từ vạch xuất phát đến tâm vết. ddm: khoảng cách dung môi chạy.
Sắc ký cột
Mục đích: tinh chế và tách riêng các thành phần trong bột kháng sinh. Tiến hành:
- Cột: =1 cm, dài 50 cm, rửa sạch, sấy khô.
- Chất nhồi: Silicagell 60 Merck cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm được hoạt hóa ở 1100C trong 30 phút. Hòa thành hỗn dịch với hệ DMHC chạy đưa lên cột.
- Mẫu thử: bột kháng sinh thu được sau cất quay dịch chiết DMHC hòa tan với 1 lượng nhỏ dung môi rồi trộn với 1 lượng nhỏ Silicagel đã hoạt hóa. Sấy khô, rồi
cho lên cột, để ổn định trong 30 phút.
- Chạy cột: cho dung môi chạy qua cột với tốc độ 0,3-0,5ml/phút. Lấy các phân đoạn đã chạy qua cột vào ống nghiệm sạch, mỗi ống 3-5ml. Thử HTKS của các phân đoạn bằng phương pháp khoanh giấy lọc.
Các phân đoạn có HTKS được tiến hành SKLM với hệ dung môi tách tốt nhất. Các phân đoạn có thành phần giống nhau được gộp lại đem cất quay tinh chế tiếp.
2.3.9. Phương pháp thu tinh thể kháng sinh tinh khiết
Các phân đoạn chính tinh khiết sau chạy cột được gộp vào cất quay chân không đến khô, cạo thu bột kháng sinh tinh khiết vào ống nghiệm sạch. Kết tinh kháng sinh nhiều lần bằng hỗn hợp DMHC thích hợp. Lọc, sấy, cân lượng kháng sinh tinh khiết thu được.
2.3.10. Sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh tinh khiết thu được
Bột kháng sinh tinh khiết đem đi đo các thông số: nhiệt độ nóng chảy, phổ IR, phổ tử ngoại, phổ khối lượng để sơ bộ dự đoán cấu trúc kháng sinh thu được.
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 3.1. Xác định hình thái xạ khuẩn Streptomyces 184.225
Tiến hành các bước để xác định hình thái xạ khuẩn Streptomyces 184.225 theo ISP. Kết quả được trình bày ở bảng 3.1. Kết quả hình ảnh chuỗi bào tử và bề mặt bào tử xạ khuẩn Streptomyces 184.225 sau 14 ngày nuôi cấy trên MT ISP2 được trình bày ở phụ lục 10.
Bảng 3.1. Các đặc điểm của Streptomyces 184.225
Đặc điểm Streptomyces 184.225