Trong phương pháp Anson, Tyrosin được chọn làm chất chuẩn để xác định hoạt tính của enzyme bromelin. Số liệu kết quả xây dựng đường chuẩn Tyrosin:
Ống 1 2 3 4 5 6
Nồng độ Tyrosin (μM ) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Độ hấp thu OD660 0 0.094 0.185 0.275 0.376 0.470
Vẽ đồ thị:
• Kết quả thu được:
Hoạt độ protease của dung dịch Hoạt độ protease của chế phẩm
Ống thử thật Ống thử thật
• Nhận xét kết quả: Màu sắc của các ống thử do hoạt độ của protease trong dung dịch đậm hơn so với màu của các ống thử do hoạt độ của protease trong chế phẩm.
• Giải thích kết quả:
Màu sắc của các ống nghiệm do tyrosin tạo nên. Trong dung dịch nước dứa có lượng Tyrosin nhiều hơn là do lượng tyrosin có sẵn trong nước dứa và lượng tyrosin do enzyme sinh ra. Trong chế phẩm, do không có enzyme hoạt đông nhưng vẫn có màu xanh là do màu xanh có sẵn trong dứa. Vì chỉ có lượng Tyrosin có sẵn nên lượng Tyrosin ít hơn, do đó có màu nhạt hơn.
Các ống thử thật có màu đậm hơn ống thử không do ở các ống thử không dung dịch TCA 10% cho vào trước khi cho dung dịch enzyme mẫu vào. Dung dịch TCA 10% là một acid có khả năng làm giảm hoạt tính enzyme protease, làm vô hoạt các enzyme này, làm chúng không có khả năng sinh ra Tyrosin, nên màu nhạt hơn các ống thử thật
• Tính kết quả: Định nghĩa đơn vị Anson: một đơn vị Anson là lượng enzyme tối thiểu trong điều kiện thí nghiệm (35.5oC, pH = 8…) thủy phân casein trong 1 phút tạo thành
sản phẩm hòa tan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta hấp thu OD ở bước song 660 nm tương ứng với 1μM Tyrosin trong đường chuẩn .
Ta có các công thức:
Hoạt độ protease của dung dịch: Hđ Protasedd = (UI/ml)
Hoạt độ protease tổng của dung dịch = Hđ Protasedd V
Hoạt độ Protease của chế phẩm (rắn): Hđ Protasecp = (UI/ml)
Hoạt độ protease tổng của chế phẩm = Hđ Protasecp mcp
Hiệu suất thu hồi enzyme = 100
• Kết quả thu được:
Đối với dung dịch enzyme mẫu là dịch ép dứa:
Ta có các giá trị sau: A = 15.1 ml, vE = 0.1 ml, v = 5ml, t = 10 phút. Kết quả thu được sau khi tiến hành đo OD ở bước sóng 660 nm:
Ống nghiệm thử thật Ống nghiệm thử không
1 2 3 1 2 3
Giá trị OD 1.245 1.275 1.169 0.377 0.323 0.343 Giá trị OD trung bình 1.23 0.348
Vậy ODTT = 1.23, ODTK = 0.348
Ta có: ΔOD = ODTT − ODTK = 1.23 − 0.348 = 0.882 = x Thay giá trị x vào phương trình đường chuẩn Tyrosin: y = 2.1297x + 0.0031 = 2.12970.882 + 0.0031 = 1.881
Lượng µM Tyrosin suy ra từ đường chuẩn: y = 1.881
Hoạt độ Protease của dung dịch: Hđ Proteasedd= = = 5.681 UI/ml
µM Tyrosin: lượng µM Tyrosin trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn. A: Tổng thể tích hỗn hợp trong ống thử thật hoặc ống thử không (ml). k: độ pha loãng enzyme.
t: thời gian thủy phân (phút). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
vE: thể tích dịch enzyme đem phân tích (ml). v: thể tích dịch lọc đem phân tích (ml).
Đối với dung dịch enzyme mẫu là chế phẩm enzyme (theo phương pháp muối −Tủa với tác nhân (NH4)2SO4):
Ta có các giá trị sau: A = 16ml, vE = 1 ml, v = 5ml, t = 10 phút, m = 0.1003g. = 77.5002(g), = 79.2265 (g)
Suy ra: = - = 79.2265 – 77.5002= 1.7263g
Kết quả thu được sau khi tiến hành đo OD ở bước sóng 660 nm:
Ống nghiệm thử thật Ống nghiệm thử không
1 2 3 1 2 3
Giá trị OD 0.288 0.230 0.303 0.046 0.040 0.043 Giá trị OD trung bình 0.274 0.043
Vậy ODTT = 0.274, ODTK = 0.043
Ta có: ΔOD = ODTT − ODTK = 0.274 − 0.043 = 0.231= x Thay giá trị x vào phương trình đường chuẩn Tyrosin: Y = 2.1297x + 0.0031 = 2.12970.231 + 0.0031 = 0.495
Lượng µM Tyrosin suy ra từ đường chuẩn: y = 0.495
Hoạt độ Protease của chế phẩm: Hđ Proteasecp= = = 31.59 UI/g
Hoạt độ Protease tổng của chế phẩm= Hđ Proteasecp mcp= 31.59 1.7263 = 54.53 UI
Trong đó:
A: Tổng thể tích hỗn hợp trong ống thử thật hoặc ống thử không (ml).
k: độ hòa tan của mẫu enzyme đem xác định hoạt tính trong dung dịch đệm PP. Tiến hành hòa tan 0.1003g enzyme mẫu trong 20ml đệm PP => k = 20
t: thời gian thủy phân (phút).
vE: thể tích dịch enzyme đem phân tích (ml). v: thể tích dịch lọc đem phân tích (ml).
m: khối lượng mẫu enzyme đem xác định hoạt tính (g). mcp: khối lượng chế phẩm enyme thu được sau ly tâm (g).
Hiệu suất thu hồi enzyme: H = 100 = 100 = 19.2 %
Đối với dung dịch enzyme mẫu là chế phẩm enzyme (Tủa bằng ethanol 98%):
Kết quả thu được như sau:
Ống nghiệm thử thật Ống nghiệm thử không
1 2 3 1 2 3
Giá trị OD 0.435 0.479 0.468 0.052 0.055 0.052 Giá trị OD trung bình 0.4607 0.053
Vậy ODTT = 0.4607, ODTK = 0.053
Ta có ΔOD = ODTT – ODTK = 0.4607 – 0.053= 0.4077
Thế ΔOD vào phương trình đường chuẩn y = 2.1297x + 0.0031, với ΔOD = x = 0.4077 Suy ra: y = 2.12970.4077 + 0.0031 = 0.8714
Vậy y = µM Tyrosin = 0.8714 = 69.6641g, = 69.8227g
Suy ra: = - = 69.8227 – 69.6641 = 0.1586g (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hoạt độ Protease của chế phẩm: Hđ Proteasecp= = = 175.818 UI/g
Ghi chú: k =100 vì dùng 100ml đệm pH 8 hòa tan chế phẩm, mà dung dịch chế phẩm tham gia đo hoạt tính là 1 ml.
= Hđ Proteasecp mcp= 175.818 0.1586 = 27.885 UI
Hiệu suất thu hồi enzyme H = 100 = 100 = 9.8%
3.3. Nhận xét:
Phương pháp tủa bằng các tác nhân gây tủa là dung môi hữu cơ (aceton, ethanol…): Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong số đó là hằng số điện môi của dung dịch. Nhìn chung, những phân tử dung môi có hằng số điện môi lớn (như nước, dimethylsulphoxid) có thể ổn định tương tác giữa chúng với các phân tử protein và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòa tan của protein trong dung dịch. Ngược lại, các dung môi với hằng số điện môi nhỏ (aceton, ethanol…) ngăn cản sự phân tán của các phân tử protein trong môi trường. Do đó, độ hòa tan của những phân tử protein giảm và xảy ra kết tủa do sự làm giảm hằng số điện môi hiện hữu của môi trường. Điều này có được bằng cách thêm một dung môi hòa tan trong nước như aceton vào dung dịch chứa protein. Sự tủa bằng aceton hoặc ethanol (80%, 98%...) có nhiều thuận lợi hơn vì nó tương đối rẻ, có sẵn ở dạng tinh khiết với ít chất tạp nhiễm gây độc hay ức chế đối với enzyme, do nhiệt độ bay hơi của dung môi thấp nên dễ tách bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzym bằng phương pháp sấy nhẹ bằng quạt gió.
Phương pháp tủa bằng muối: Người ta có thể dùng muối (NH4)2SO4, NaCl… để tủa protein vì các muối này vừa làm trung hòa điện (do các ion tác động tương hỗ với các nhóm tích điện trái dấu), vừa loại bỏ lớp vỏ hydrat của phân tử protein. Các protein khác nhau có thể bị kết tủa với nồng độ muối khác nhau, vì vậy có thể dùng muối để tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp của chúng.
Qua kết quả tính toán trên ta thấy hiệu suất thu hồi enzyme bằng muối (19.2%) có kết quả cao hơn so với cồn (9.8%). Do tủa bằng muối thu được lượng chế phẩm cao hơn rất nhiều so với tủa bằng cồn. Tủa bằng muối, lương bromelin tạo thành có gắn các tinh thể muối sunfat. Còn chế phẩm thu được từ phương pháp kết tủa bằng cồn ít hơn do cồn là
chất dễ bay hơi, nên cồn bay hơi ra khỏi sản phẩm, dẫn đến lượng kết tủa tạo thành ít hơn.