4. Liên quan giữa thiếu máu não cục bộ và bệnh Alzheimer
2.1.1. Nguyên liệu
Nguồn nguyên liệu: rau đắng biển (Bacopa monnieri (Linn) Wettst) được thu hái ở Nghệ An. Dược liệu được TS.Phạm Thanh Huyền, Trưởng khoa - Khoa tài nguyên dược liệu - Viện dược liệu giám định mẫu và lưu mẫu tại Viện. Số tiêu bản lưu tại viện là INM484.
Mẫu thử được chọn là cao chiết nước và phân đoạn n-butanol từ dịch chiết nước rau đắng biển. Quy trình chiết hai mẫu như sau:
Chiết xuất rau đắng biển thu cao chiết nước (mẫu M1)
1 kg dược liệu rau đắng biển khô được chiết bằng nước nóng (95oC) 3 lần, với tỷ lệ dung môi/dược liệu lần lượt là 10, 10 và 8 lần trong thời gian lần lượt là 3 h, 2 h và 1,5 h. Lọc và gộp dịch lọc, cô cạn thu được 340 g cao có độ ẩm 4,96%. Định lượng bacosid A trong cao bằng phương pháp HPLC đạt 1,06%, bacopasid I đạt 0,94%. Tổng hàm lượng bacosid A và bacopasid I trong mẫu M1 đạt 2,00%.
Rau đắng biển (Bacopa monnieri (Linn) Westts) (1kg)
H2O, 95oC (3 lần) Dịch chiết thô
Cô cách thủy Sấy chân không
Cao chiết nƣớc (340g) (Mẫu M1)
26
Chiết xuất rau đắng biển thu cắn BuOH từ cao chiết nước (mẫu M2)
1 kg dược liệu rau đắng biển khô, chiết bằng nước nóng sau đó chiết với dung môi n-BuOH, thu hồi dung môi, sấy chân không, thu được cắn BuOH có có khối lượng là 28,1g và định lượng bằng phương pháp HPLC đạt hàm lượng bacosid A 3,33%, hàm lượng Bacopasid I đạt 4,42%. Tổng hàm lượng bacosid A và bacopasid I trong mẫu M2 đạt 7,75%.
Rau đắng biển (Bacopa monnieri (Linn) Westts) (1kg)
H2O, 95o
C (3 lần) Dịch chiết thô
Cô cách thủy Dịch chiết nước
Chiết bằng BuOH, thu hồi dung môi, sấy chân không
Cao chiết BuOH (28,1g) (mẫu M2)
Hình 2.2 . Sơ đồ chiết xuất mẫu M2
2.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu:
- Chuột nhắt trắng khỏe mạnh cả đực và cái 5 - 6 tuần tuổi, đạt tiêu chuẩn, trọng lượng trung bình 20-22g, đơn vị cung cấp là Học viện Quân y.
- Động vật thí nghiệm trên được nuôi trong điều kiện đầy đủ thức ăn, nước uống, độ ẩm, độ thông khí và ánh sáng thích hợp.
27
2.1.3. Hóa chất:
Bảng 2.1. Nguyên vật liệu sử dụng trong quá trình thực nghiệm
Tên hóa chất Nguồn gốc Nƣớc sản xuất
Acetylthiocholine iodide Sigma Mỹ DTNB
(5,5-dithiobisnitrobenzonic acid) Sigma Mỹ Natri bicarbonate Wako Nhật
Natri clorid Wako Nhật
Triton X-100 Wako Nhật
Thuốc chuẩn Tacrin Sigma Mỹ
- Acetylthiocholine iodide 30 mM pha trong đệm phosphate 0.05M, pH=7.2 - DTNB 10 mM pha trong đệm phosphate 0.05M, pH=7.2
Dụng cụ và trang thiết bị:
- Kẹp động mạch (xuất xứ Đức) - Mê lộ nước Morris
- Camera nối với máy tính
- Phần mềm phân tích kết quả (Công ty An Nhân cung cấp) - Tủ lạnh -80oC (Sanyo, Nhật)
- Máy ly tâm Mikro 22R
- Máy ELISA Thermo Labsystem - Cân phân tích
28
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ in vivo bằng thử nghiệm mê lộ
nƣớc Morris
Các nhóm chuột được bố trí như sau:
Nhóm chứng sinh lý: chỉ bộc lộ 2 động mạch cảnh nhưng không thắt.Cho chuột uống nước thể tích khoảng 0,4ml/20g thể trọng chuột 1 giờ trước khi phẫu thuật và 1 giờ trước khi tiến hành thí nghiệm hàng ngày.
Nhóm chứng bệnh lý: được bộc lộ và thắt 2 động mạch cảnh chung trong 20 phút đồng thời gây hạ huyết áp bằng cách rút khoảng 0,2 ml máu đuôi chuột. Cho chuột uống nước với thể tích khoảng 0,4ml/20g thể trọng chuột 1 giờ trước khi phẫu thuật và 1 giờ trước khi tiến hành thí nghiệm hàng ngày.
Nhóm dùng thuốc đối chiếu dương (tacrin): được phẫu thuật thắt động mạch cảnh giống nhóm chứng bệnh lý và tiêm phúc mạc bằng thuốc chuẩn tacrin với liều 2,5 mg/kg chuột/ 1 lần/ 1 ngày. Tiêm tacrin cho chuột 30 phút trước khi phẫu thuật và 30 phút trước khi tiến hành thí nghiệm hàng ngày.
Nhóm uống mẫu M1 và M2: cũng làm giống như nhóm chứng bệnh lý và uống liều tương đương 0,3 g dược liệu/kg và 0,6 g dược liệu/kg (dl/kg) cao chiết nước hoặc phân đoạn butanol từ dịch chiết nước 1 tuần trước khi làm phẫu thuật và 1 giờ trước khi tiến hành thí nghiệm hàng ngày.
Cách pha mẫu thử từ cắn dược liệu:
Mẫu cao chiết nước: 0,3 g dược liệu/kg chuột tương đương với 2,04 mg cao chiết nước/20 g thể trọng chuột. Dung môi pha cắn là nước.
Mẫu phân đoạn butanol: 0,3 g dược liệu/kg chuột tương đương với 0,17 mg cao chiết butanol/20 g thể trọng chuột. Dung môi pha cắn là NaCMC. Khuấy đều trước khi cho chuột uống mẫu.
29
Mô hình gây mất trí nhớ do thiếu máu não cục bộ
Gây mất trí nhớ do thiếu máu não cục bộ trên chuột nhắt trắng theo phương pháp của tác giả Matsumoto [58] đã được cải tiến, mô tả tóm tắt như sau:
Chuột nhắt trắng 5-6 tuần tuổi (trọng lượng khoảng 20-22g) được để ổn định 1 tuần trước khi tiến hành thí nghiệm. Gây mê chuột bằng pentobarbital (liều 50 mg/kg trọng lượng) theo đường tiêm phúc mạc. Sau khi chuột đã bị gây mê hoàn toàn, bộc lộ 2 động mạch cảnh một cách cẩn thận, thắt 2 động mạch cảnh này bằng chỉ kẹp động mạch trong 30 phút. Đồng thời, lấy 0,2 ml máu ở đuôi chuột trong quá trình gây thiếu máu cục bộ.
Mô hình mê lộ nƣớc Morris (Morris Water Maze)
Thử nghiệm mê lộ nước Morris được thực hiện theo phương pháp của Morris đã được sửa đổi [13]. Mê lộ là một bể nước hình tròn, lượng nước duy trì ở mức 15 cm, đường kính bể là 1,1 m, chiều cao 30 cm, nhiệt độ nước khoảng 20oC trong quá trình thí nghiệm.
30
Mê lộ được đặt trong phòng, dùng các hình ảnh đặt cố định để định hướng không gian cho chuột trong quá trình làm thí nghiệm. Bến đỗ có đường kính 7,5 cm, làm bằng nhựa trong suốt, được đặt tại một góc phần tư của mê lộ. Các bài tập cho chuột bao gồm:
1. Bài tập nhìn thấy bến đỗ:
Ngày thứ 2 (2 ngày sau khi gây mất trí nhớ), chuột học bài đầu tiên là bài tập có thể nhìn thấy bến đỗ. Trong bài tập này, bến đỗ được đặt cao hơn mặt nước 1 cm. Chuột được bơi trong mê lộ để tìm thấy bên đỗ. Sau đó lau khô, sưởi ấm chuột và đưa về chuồng. Chỉ tiêu đánh giá là thời gian chuột tìm thây bến đỗ. Chuột có thời gian tìm thấy bến đỗ ngắn hơn được coi là có trí nhớ tốt hơn.
2. Bài tập không nhìn thấy bến đỗ:
Từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 8 sau khi gây mất trí nhớ, chuột được luyện tập bài tập không nhìn thấy bến đỗ. Trong bài tập này, bến đỗ được giấu đi bằng cách đặt dưới mặt nước 1cm. Chuột được đặt vào một trong 3 góc phần tư khác nhau còn lại của mê lộ, từ đó tìm đến bến đỗ. Các lần tập cách nhau 1 phút. Chuột tập 3 lần/ngày. Chuột sẽ được hướng dẫn để tìm bến đỗ nếu như nó không tự tìm được bến đỗ trong 1 phút. Khi đến được bến đỗ, chuột sẽ được ở đó 15 giây. Chỉ tiêu đánh giá là giá trị trung bình về thời gian tìm thấy bến đỗ của 3 lần luyện tập trong ngày. Chuột có thời gian tìm thấy bến đỗ ngắn hơn được coi là có trí nhớ tốt hơn.
3. Bài tập không có bến đỗ:
Ngày thứ 9 sau khi gây mất trí nhớ, chuột được kiểm tra bằng bài tập không có bến đỗ. Bến đỗ được bỏ ra ngoài, chuột bơi trong mê lộ 1 lần duy nhất trong 1 phút. Chuột dựa vào các vật định hướng trong phòng để tìm bến đỗ và có xu hướng bơi lâu tại góc một phần tư của mê lộ có bến đỗ được đặt từ những ngày tập trước. Số liệu thu được là thời gian chuột bơi ở cung phần tư đích. Chuột có thời gian bơi ở cung phần tư đích lâu hơn được coi là có trí nhớ tốt hơn.
31
2.2.2. Nghiên cứu khả năng ức chế enzym acetylcholinesterase (AChE)
ex vivo
Một ngày sau khi kết thúc thử nghiệm mê lộ nước Morris, chuột sẽ bị giết và tách vùng vỏ não để tiến hành định lượng enzym AChE theo phương pháp của tác giả Ellman và cộng sự có cải tiến [31].
- Động vật thí nghiệm: chuột nhắt trắng đã được nghiên cứu hành vi ở trên.
Cách tiến hành thí nghiệm
- Vỏ não chuột sau khi được tách trong hộp đá sẽ được đặt ngay vào trong nitơ lỏng để bảo quản tạm thời, sau đó cất trong tủ lạnh âm sâu (-80oC) để bảo quản lâu dài cho đến khi tiến hành định lượng enzym AChE.
- Cân trọng lượng mô ở trên, thêm 10 lần thể tích dung dịch phosphate buffer có bổ sung 1% triton, nghiền đồng nhất. Ly tâm 15.000 g/ 20 phút tại 4oC. Hút lấy dịch nổi và sử dụng như nguồn enzym.
- Chuẩn bị hỗn hợp gồm:
Nguồn enzym: 50 l DTNB 10 mM: 20 l Acetylthiocholine iodide 30 mM: 20 l Đệm Phosphate 0,1 M: 160 l
- Thêm lần lượt từng dung dịch gồm: dung dịch đệm phosphat pH=8, dung dịch enzym vào từng giếng của đĩa 96 giếng. Hỗn hợp các dung dịch này được trộn đều và ủ ở 250C trong 15 phút. Sau đó, dung dịch thuốc thử DTNB và dung dịch cơ chất ATCI lần lượt được thêm vào hỗn hợp và trộn đều. Tiếp tục ủ hỗn hợp trong một khoảng thời gian nhất định ở 250C
32
được tính toán dựa trên độ hấp thụ tại bước sóng 412 ở trên.Mỗi thử nghiệm được làm lặp lại 3 lần, mỗi lần được làm trên 3 giếng. Giá trị tính toán là % giảm hoạt độ enzym so với nhóm bệnh lý thông qua đo hoạt độ enzym AChE.
2.2.3. Nghiên cứu khả năng ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro
Với mô hình in vitro, nguồn enzym AChE được mua sẵn của hãng Sigma. Đánh giá khả năng ức chế enzym AChE của cao chiết rau đắng biển và tacrin với phương pháp định lượng Ellman tương tự như với mô hình ex vivo.
Mỗi thử nghiệm được làm lặp lại 3 lần để lấy giá trị trung bình. Khảo sát để lựa chọn nồng độ cao chiết nước, phân đoạn n-butanol và tacrin.
% hoạt tính bị ức chế AChE của mẫu thử được tính theo công thức: I% = (1 - Athử/Ađối chứng) x 100
Trong đó:
• I%: phần trăm hoạt tính bị ức chế của AChE .
• Athử và Ađối chứng lần lượt là độ hấp thụ của mẫu thử và mẫu đối chứng. Giá trị IC50 được tính toán dựa trên sự đánh giá tuyến tính của đường cong đáp ứng liều sử dụng ức chế enzym bằng cách xây dựng đường biểu diễn sự phụ thuộc của % hoạt tính bị ức chế củaAChE vào nồng độ chất thử bằng phần mềm Excel 2007. Từ phương trình biểu diễn tính toán được giá trị IC50.
2.3. Xử lý số liệu
Tất cả các số liệu thu được đều được xử lý theo phần mềm excel 2007 và SPSS 20.0, sử dụng thuật toán t-test student và ONE - WAY ANOVA để so sánh giá trị trung bình. Số liệu được trình bày dưới dạng MEAN ± SE. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.
2.4. Nơi thực hiện đề tài
33
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Tác dụng cải thiện trí nhớ của rau đắng biển trên chuột bị suy giảm trí nhớ đánh giá qua thử nghiệm mê lộ nƣớc Morris
Tác dụng cải thiện trí nhớ của cao chiết rau đắng biển, cụ thể là hai mẫu: cao chiết nước (mẫu M1) và phân đoạn n-butanol từ dịch chiết nước rau đắng biển (mẫu M2), được đánh giá bằng thử nghiệm mê lộ nước Morris. Chuột được thử nghiệm tham gia bài tập nhìn thấy bến đỗ để làm quen với mê lộ. Sau đó chuột lần lượt được thực hiện các bài tập nhìn thấy bến đỗ, bài tập không nhìn thấy bến đỗ và bài tập không có bến đỗ.
3.1.1. Bài tập nhìn thấy bến đỗ và bài tập không nhìn thấy bến đỗ
Tác dụng của cao chiết nước (Mẫu M1) và phân đoạn n-butanol từ dịch chiết nước rau đắng biển (Mẫu M2) qua các bài tập trên khả năng cải thiện trí nhớ chuột bị suy giảm trí nhớ được trình bày ở bảng 3.1.
34
Bảng 3.1. Tác dụng của mẫu M1 và M2 đối với thời gian tiềm ẩn
* p < 0,05; ** p < 0,005 so với ngày 1 trong cùng một lô thí nghiệm
Lô thí nghiệm Thời gian tiềm ẩn ở bài tập nhìn thấy bến đỗ (giây)
Thời gian tiềm ẩn ở bài tập không nhìn thấy bến đỗ (giây)
Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 Chứng sinh lý 39,1 ± 7,2 40,1 ± 1,9 24 ± 3,8** 19,3 ± 6,4* 19,1 ± 4,5** 20,4 ± 6,3* 16,4 ± 3,4** Chứng bệnh lý 43,7 ± 6,5 41,2 ± 3,6 37,0 ± 5,2 34,6 ± 5,1 28,1 ± 4,0* 27,6 ± 3,7** 25,4 ± 1,9** M1 (0,3 g dl/kg) 41,7 ± 7,1 33,7 ± 2,1 33,2 ± 6.5 27,3 ± 5,0 33,7 ± 3,0 27,6 ± 6,6 19,2 ± 2,8** M1 (0,6 g dl/kg) 41,4 ± 8,7 38,1 ± 4,2 31,5 ± 4.9 28,6 ± 5,9 21,7 ± 4,6 24,1 ± 3,2* 18,2 ± 2,1** M2 (0,3 g dl/kg) 42,6 ± 8,8 32,4 ± 5,9 30,0 ± 4,8 30,4 ± 6,2 25,0 ± 6,7 18,5± 6,8 22,4 ± 5,5 M2 (0,6 g dl/kg) 39,8 ± 6,2 42,0 ± 2,9 34,9 ± 3,9 26,0 ± 3,9* 22,6 ± 3,9* 20,7 ± 3,7** 13,8 ± 2,2** Tacrin (2,5 mg/kg) 42,6 ± 8.3 29,4 ± 6,7 28,5 ± 4,4 24,6 ± 5,4 22,6 ± 4,7 23,9 ± 3,1 14,4 ± 2,1*
35
Nhận xét:
Kết quả ở hình 3.1 cho thấy:
* Bài tập nhìn thấy bến đỗ: sự khác biệt về thời gian tiềm ẩn tìm thấy bến đỗ giữa các lô thí nghiệm là không có ý nghĩa thống kê.
* Bài tập không nhìn thấy bến đỗ: chuột ở các nhóm khác nhau đều có khả năng tìm thấy bến đỗ nằm dưới mặt nước 1 cm.
- So sánh thời gian tiềm ẩn giữa các ngày từ ngày 1 đến ngày 6 trong cùng một lô chuột cho thấy:
+ Nhóm chứng sinh lý: giảm thời gian tiềm ẩn đạt thống kê từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 6 với giá trị p trong bảng 3.1.
+ Nhóm chứng bệnh lý: giảm thời gian tiềm ẩn đạt thống kê từ ngày thứ 4. + Nhóm uống mẫu M1: giảm thời gian tiềm ẩn đạt ý nghĩa thống kê ở ngày
thứ 6 (p < 0,005) với liều và bắt đầu từ ngày thứ 5 với liều 0,6 g dl/kg. + Nhóm uống mẫu M2: giảm thời gian tiềm ẩn không đạt ý nghĩa thống kê
với liều 0,3 g dl/kg và đạt ý nghĩa thống kê bắt đầu từ ngày 3 đến ngày 6 với mức ý nghĩa thống kê p < 0,05.
+ Nhóm tiêm tacrin: giảm thời gian tiềm ẩn đạt ý nghĩa thống kê ở ngày thứ 6 của bài luyện tập với p < 0,05.
- So sánh thời gian tìm thấy bến đỗ giữa các lô khác nhau trong cùng một ngày cho thấy:
Từ ngày 1 đến ngày 5: thời gian tìm thấy bến đỗ giữa các lô chuột khác nhau không đạt ý nghĩa thống kê (p>0,05).
Ngày thứ 6:
+ Giữa lô chứng sinh lý và lô chứng bệnh lý: thời gian tìm thấy bến đỗ khác nhau đạt ý nghĩa thống kê (p < 0,05).
+ Giữa lô chứng bệnh lý, lô uống mẫu M1 liều 0,6 g dl/kg, lô uống mẫu M2 liều 0,6 g dl/kg, lô tiêm tacrin : thời gian tìm thây bến đỗ khác nhau đạt ý nghĩa
36
thống kê (p<0,05).
+ Giữa lô uống mẫu M1 liều 0,6 g dl/kg, lô uống mẫu M2 liều 0,6 g dl/kg, lô tiêm tacrin: thời gian tìm thây bến đỗ khác nhau không có ý nghĩa thông kê. Sự khác biệt này được thể hiện rõ ở hình 3.1.
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn thời gian tiềm ẩn của các lô chuột thử nghiệm ở ngày
thứ 6 của bài tập không nhìn thấy bến đỗ (* p < 0,05 so với lô chứng bệnh lý)
3.1.2. Bài tập không có bến đỗ
Ngày thứ 7, chuột được đánh giá khả năng củng cố lại trí nhớ qua bài tập không có bến đỗ thông qua tỷ lệ thời gian chuột ở các lô thử nghiệm ở cung phần tư đích. Lúc này bến đỗ đã bị lấy ra khỏi bể nước. Chuột phải nhớ lại vị trí