Tại phòng Sinh học thực nghiệm (Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên) các chất do chúng tôi tổng họfp đã được thử nghiệm để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm.
*Nguyên tắc:
Để tiến hành sàng lọc các chất có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, chúng tôi tiến hành thử hoạt tính kháng vi sinh vật trên phiến vi lượng 96 miếng của các mẫu chất theo phương pháp hiện đại của Vanden Bergher và Vlietlinck (1994) theo 2 bước:
Bước 1: Sàng lọc sơ bộ tìm chất có hoạt tính,
Bước 2; Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chất có hoạt tính,
*Chất thử; Các chất I, II, III, IV, V, VI.
*Kháng sinh kiểm định: Ampixilin đối với vi khuẩn Gr (+), Tetracyclin
đối với vi khuẩn Gr (-), Nystatin đối với nấm sợi và nấm men.
*Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm:
- VK Gr (-): Escherichia coli (ATCC 25922);
- VK Gr (+): Bacillus suhtillis (ATCC 27212);
Staphylococcus aureus.
- Nấm sợi: Aspergillus niger;
Fusarium oxysporum.
- Nấm men; Candida albicans;
Saccharomyces cerevisiae.
*Tỉến hành:
- Bước 1: Sàng lọc sơ bộ tìm chất có hoạt tính:
+ Chuẩn bị vi nấm và vi khuẩn: Nấm và vi khuẩn được duy trì trong môi trường Sabouraud dextrose broth và Trypcase soya broth (TSB).Các chủng kiểm định được hoạt hoá trước khi tiến hành thực nghiệm trong môi trường dinh dưõíig dịch thể (24 giờ đối với vi khuẩn, 48 giờ đối vói vi nấm).
+ Chuẩn bị mẫu thử: Chất thử được hoà tan trong DMSO.
+ Từ dung dịch gốc pha loãng thành 4 - 1 0 thang nồng độ rồi nhỏ sang phiến vi lượng 96 giếng.
+ Nhỏ vào mỗi giếng đã có mẫu sẵn dung dịch v s v đã hoạt hoá và đã đừợc pha loãng bằng môi trường dinh dưỡng cho tới nồng độ tương đương 0,5 đofn vị McLand (khoảng 10^ vsv/ml).
+ Đối chứng dương;
Dãy 1: Môi trường
Kháng sinh (Tetracyclin) + vi khuẩn Gr (-);
Kháng sinh (Nystatin) + vi nấm.
+ Đối chứng âm: Chỉ có vi nấm, vi khuẩn kiểm định để trong tủ ấm 37°c/24h đối với vi khuẩn và 30°c/48h đối với vi nấm.
+ Đọc kết quả: Mẫu dương tính khi nhìn bằng mắt thường thấy trong suốt, không có vi khuẩn, vi nấm phát triển, giống như hình ảnh các giếng chứng dương tính. Mẫu dương tính bước một sẽ được tiếp tục thử bước 2 để tính MIC.
- Bước 2: Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chất có hoạt tính:
Các bước tiến hành như bước 1. Riêng các mẫu có hoạt tính ở bước được pha loãng theo các thang nồng độ thấp dần (5-10 thang nồng độ) để tính giá trị tối thiểu mà ở đó vi khuẩn, vi nấm bị ức chế phát triển gần như hoàn toàn.
- Đọc kết quả:
Mẫu thô có MIC < 200 |ig/ml; mẫu tinh có MIC < 50 |a.g/ml là có hoạt tính.
Chúng tôi thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của 6 chất (I, II, III, IV, V, VI) và kết quả được trình bày ở bảng ố.
Chất Nồng độ ức chế tối thiểu(MIC: |Lig/ml)
Vi khuẩn Gr(-) Vi khuẩn Gr(+) Nấm mốc Nấm men
E. coli p.aeruginosa B.subtillis S.aureus Asp.niger p.oxysporum S.cerevisiae C.albicans
I 50 50 50 50 12.5 12.5 25 50 II (-) 50 (-) (-) 12.5 12.5 12.5 12.5 III 50 (-) 50 50 12.5 12.5 12.5 12.5 IV (-) 50 (-) (-) 12.5 25 50 50 V (-) (-) (-) (-) 12.5 12.5 12.5 12.5 VI 50 50 (-) 50 12.5 25 25 25
Nhận xét:
- Kết quả thử nghiệm cho thấy, 5 chất (I, II, III, IV, VI) có tác dụng kháng khuẩn với mức độ khác nhau trên bốn chủng vi khuẩn kiểm định, chất (V) không có tác dụng kháng khuẩn đối với bốn chủng vi khuẩn kiểm định nào.
- So sánh tác dụng kháng khuẩn của sáu chất đem thử cho thấy chất (I) có tác dụng với cả bốn chủng vi khuẩn kiểm định, chất (III, VI) có tác dụng với ba chủng vi khuẩn kiểm định, chất (II, IV) có tác dụng với một chủng vi khuẩn kiểm định, chất (V) không có tác dụng với chủng vi khuẩn kiểm định nào. Có bốn chất (I, II, IV, VI) có tác dụng trên chủng Pseudomonsis aeruginosa. Có ba chất (I, III, IV) có tác dụng trên chủng Staphylococcus aureus.
- Trong sáu chất đem thử, tác dụng kháng khuẩn được sắp xếp theo thứ tự giảm dần như sau: I, VI, III, II, IV, V.
- Cả sáu chất (I, II, III, IV, V, VI) đều có hoạt tính kháng nấm mạnh đối với bốn chủng vi nấm kiểm định Aspergillus niger, Fusarium oxysporum, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae (MIC =12,5 - 50).
- Như vậy, kết quả thử nghiệm cho thấy chất (I) có phổ rộng kháng cả 8
vi sinh vật kiểm định, chất (III, VI) khảng 7 vi sinh vật kiểm định, chất (II, IV) có hoạt tính kháng 5 vi sinh vật kiểm định, chất (V) kháng 4 vi sinh vật kiểm định.
2.4.2. Thử tác dụng kháng các dòng tê bào ung thư người.
Do điều kiện hạn chế, chúng tôi chỉ tiến hành thử tác dụng kháng tế bào ung thư người của hai chất (I, III) để thăm dò hoạt tính kháng ung thư của chất này.
* Nguyên tắc:
Phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng tế bào ung thư của được tiến hành theo phương pháp của Likhiwitayawuid đang được tiến hành tại Viện nghiên cứu ung thư quốc gia Mỹ (NCI).
* Dòng tế bào thử nghiệm:
- Hep - 2 : Tế bào ung thư gan người.
- LU : Tế bào ung thư phổi
* Tiến hành:
- Tế bào ung thư được duy trì ở điều kiện tiêu chuẩn . Sau khi tế bào được hoạt hoá phát triển đến phase log sẽ được sử dụng cho thử test với các chất thử đã chuẩn bị sẵn ở 4 - 10 thang nồng độ khác nhau, lặp lại ba lần trên phiến vi lượng 96 giếng.
- Mẫu thử nghiệm bao gồm: tế bào + môi trường nuôi cấy + mẫu thử, được ủ trong tủ ấm CO2/ 37°c để tế bào tiếp tục phát triển.
- Sau 48h - 72h lấy ra cố định tế bào, rửa, nhuộm tế bào và hoà lại bằng dung dịch chuẩn . Đọc kết quả trên máy đọc Elisa bước sóng 495 - 515 nm.
* Đọc kết quả:
- Giá trị IC50 được tính trên chưcmg trình Table curve với giá trị logarit dựa trên giá trị dãy các thang nồng độ khác nhau của chất thử và giá trị ED đo được.
- Các mẫu chất tinh khiết có giá trị IC50 < 5 Ịxg/ml được coi là có hoạt
tính.
lượng tế bào khi kết thúc thí nghiệm. Cách cố định và nhuộm như với các mẫu thử.
* Dựa vào kết quả đo được của mẫu chứng OD (ngày 0) và OD của DMSO
1 0% so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu thử để tìm giá trị EDgo theo công thức:
OD (mẫu) - OD (ngày 0) O D = ---
OD (DMSO 10%) - OD (ngày 0)
Mẫu có ED <50% là mẫu có hoạt tính, dùng giá trị ED 50 của 10 thang nồng độ dựa vào chương trình Table cuver theo thang giá trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử để tính giá trị IC 5Q.
L nY = a + bX Y; nồng độ chất thử X : giá trị ED 50
Chúng tôi tiến hành thử hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư gan Hep - 2 và dòng tế bào ung thư phổi (LU) của hai chất (I, III). Kết quả trình bày ở bảng 7.
Bảng 7: Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư người Ký hiệu chất Dòng tế bào Tỷ lệ tế bào sống sót (%) Kết luận Hep-2 LU DMSO 1 0 0 ,0 ± 0 , 0 1 0 0 ,0 ± 0 , 0 Âm tính Chứng(+) 3,2 ± 0,0 4,1 ± 0,01 Âm tính I 99,4 ± 0,5 91,9 ± 0,0 Âm tính III 1 0 1 ,8 ± 0,3 85,8 ± 0 ,2 Âm tính
* Kết quả: Cả hai chất đem thử kháng tế bào ung thư người đều không có hoạt tính với dòng ung thư nói trên.
2.5. BÀN LUẬN
2 .5 .1 . V ề tổ n g hợp h o á h ọ c
- Phản ứng ngưng tụ benzaldehyd với rhodanin để tổng hợp chất (I) được thực hiện trong dung môi acid acetic băng và xúc tác natri acetat khan đã thu được kết quả như một số công trình đã công bố [15].
- Trong quá trình thực hiện phản ứng Mannich để tổng hợp các dẫn chất base Mannich của chất (I), chúng tôi đã xác định nhiệt độ phản ứng thích hợp để tổng hợp các chất (III - VI) là 70°c và đối với chất (II) là 50°c. ở các nhiệt độ này, hỗn hợp phản ứng tan hoàn toàn và phản ứng diễn ra qua theo dõi SKLM.
- Về thời gian phản ứng Mannich, kết quả thực nghiệm cho thấy, đối với phản ứng có sự tham gia của các hợp phần amin bậc 2 có lực base mạnh
ứng ngắn hơn so với các phản ứng vód sự tham gia của các amin thơm bậc 1
lực base yếu (anilin, p- toluidin) (các chất V, VI) (2 giờ so với 3 giờ). Điều này phù hợp với cơ chế của phản ứng Mannich.
2.5.2. Vê xác định cấu trúc.
Các kết quả phân tích phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại và phổ khối lượng cho phép chúng tôi kết luận cấu trúc của các chất tổng họp được đúng như dự kiến.
Tuy nhiên, chúng tôi hiểu rằng để định cấu trúc mộy cách đầy đủ hơn cần tiến hành phân tích phổ cộng hưcmg từ proton ( ‘H- NMR) và phổ cộng hưởng từ C^C - NMR).
2.5.3. Về hoạt tính sinh học.
- Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn cho thấy chất I (5- benzyliden rhodanin) có hoạt tính kháng khuẩn với cả bốn chủng vi khuẩn kiểm định, trong khi đó 5 dẫn chất Mannich của nó có tác dụng kém hơn (chất V không có tác dụng, hai chất II, IV có tác dụng với một chủng vi khuẩn, hai chủng III, VI có tác dụng với ba chủng vi khuẩn). Điều đó cho thấy việc gắn nhóm base Mannich vào chất (I) đã không mang lại hiệu quả tác dụng kháng khuẩn, có lẽ do cấu trúc phân tử và tính chất lý hoá của toàn phân tử làm giảm khả năng thấm qua màng tế bào vi khuẩn.
- Kết quả thử tác dụng kháng nấm cho thấy chất I và 5 dẫn chất Mannich đã thể hiện hoạt tính kháng nấm khá mạnh và đồng đều với cả bốn chủng vi nấm. Có thể nhận thấy ba chất (II, III, V) có hoạt tính kháng hai chủng nấm men Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae mạnh hơn chất I. Các chất còn lại tác dụng gần tưoíng đương chất I. Sự khác nhau không nhiều về hoạt tính kháng nấm của chất I và 5 dẫn chất base Mannich cho thấy yếu tố cấu
trúc chung có tác dụng kháng nấm của dãy chất là khung phân tử 5- benzyliden rhodanin. Hoạt tính kháng nấm của dãy chất này và các dẫn chất của rhodanin khác cần được quan tâm nghiên cứu sâu thêm.
- Về hoạt tính chống ung thư : hai chất (I, III) không có hoạt tính với hai dòng tế bào Hep - 2 và LU. Tuy nhiên một dẫn chất tương tự chất I (m- nitrobenzyliden rhodanin) thể hiện hoạt tính kháng Hep - 2 (IC50 = 4,9 |Lig/ml).
Điều đó cho thấy nhóm thế ở hợp phần aldehyd có ảnh hưởng đến hoạt tính chống ung thư. Chúng tôi thấy cần tiếp tục nghiên cứu hoạt tính chống ung thư của các chất khác thuộc dãy 5- aryliden rhodanin.
PHẦN 3
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
3.1. KẾT LUẬN
Từ những kết quả nghiên cứu đã trình bày trên đây chúng tôi rút ra một sô kết luận sau:
1 - Đã tổng hợp được 6 dẫn chất của rhodanin ( I - VI), trong số đó 5 chất (II - VI) chưa thấy công bố trong tài liệu tham khảo được.
2- Đã kiểm tra độ tinh khiết của các chất tổng hợp được bằng SKLM và đo nhiệt độ nóng chảy. Xác định cấu trúc bằng phân tích quang phổ hồng ngoại, quang phổ tử ngoại và phổ khối lượng. Kết quả cho phép chúng ta kết luận: các chất tổng hợp được có cấu trúc đúng như dự kiến.
3 - Đã thử tác dụng kháng khuẩn và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của sáu chất ( I, II, III, IV, V, V I ) với bốn chủng vi khuẩn kiểm định
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus. Kết quả cho thấy 5 chất (I, II, III, IV, VI) đều có tác dụng kháng khuẩn với các mức độ khác nhau trên bốn chủng vi khuẩn.
4 - Đã thử tác dụng kháng nấm và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của sáu chất ( I, II, III, IV, V, V I ) với bốn chủng vi nấm kiểm định bao gồm: Aspergillus niger, Fusarium oxysporum, Candida albicans,
Saccharomyces cerevisiae. Kết quả cả sáu chất đều có tác dụng kháng mạnh
cả bốn chủng vi nấm kiểm định với MIC = 12,5 - 50|Lig/ml.
5 - Đã thử tác dụng kháng hai dòng tế bào ung thư ngưòi (Hep - 2, LU) của hai chất (I, III). Kết quả cho thấy cả hai chất đều không có tác dụng kháng hai dòng tế bào ung thư nói trên.
Với các kết quả đạt được chúng tôi hy vọng đề tài này sẽ đóng góp một phần nhỏ vào việc nghiên cứu các dẫn chất của rhodanin.
3.2. ĐỂ XUẤT
Để tiếp tục phát triển các kết quả đã đạt được, chúng tôi có các đề xuất sau;
- Cần tiếp tục thử nghiệm sâu hơn và rộng hơn về hoạt tính kháng khuẩn,
kháng nấm của sáu chất (I - VI) tổng hợp được và thử độc tính của chúng để có thể hướng tói ứng dụng trong điều trị.
- Tiếp tục tổng hợp và sàng lọc hoạt tính sinh học của các dẫn chất rhodanin nhằm tìm kiếm các chất có triển vọng của dãy chất này.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIÊT:
1. Bộ môn Hoá hữu cơ - Trường đại học Dược Hà Nội (2004), Hoá hữu
c ơ , Tập I.
2. Bộ môn Hoá hữu cơ - Trường đại học Dược Hà Nội (2004), Hoá hữu cơ
, Tập II.
3. Bộ y tế (2002), Dược điển Việt Nam III, Nhà xuất bản Y học, PL. 10.
4. Bộ môn Hoá phân tích - Trường đại học Dược Hà Nội (2003), Kiểm nghiệm thuốc, Tr. 101 - 127.
5. Nguyễn Quang Đạt, Nguyễn Khang (1979), Cấu trúc hoá học và tác dụng sinh vật, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
6. Nguyễn Quang Đạt, Ngô Mai Anh, Đinh Thị Thanh Hải, Imphea Rith (2001), “Tổng hợp và tác dụng kháng khuẩn, kháng nấmcủa 5 - (5’ - nitro - 2’ - Furfuryliden) - 2 - thioxo - 4 thiazolidinon và dẫn chất”,
Tạp chí dược học, Sốl 1, Tr. 13 - 16.
7. Đinh Thị Thanh Hải, Nguyễn Quang Đạt, Lê Mai Hương (2003), “Nghiên cứu hoạt tính gây độc tính tế bào của một số dẫn chất 5 - nitrofural”, Tạp chí dược học, Số 1, Tr. 18 - 20.
8. Đinh Thị Thanh Hải (2003), Tổng hợp một số dẫn chất của 5 -
nitrofurfural và thăm dò tác dụng sinh học, Luận án tiến sĩ dược học, Trường đại học Dược Hà Nội.
9. Imphea Rith (2001), Tổng hợp và thăm dò tác dụng sinh học của 5 - (5 ’ - nitro - 2 ’ - Furfuryliden) - 2 - thioxo - 4 thiazolidinon và dẫn chất, Khoá luận tốt nghiệp dược sĩ đại học, Đại học Dược Hà Nội.
10. Nguyễn Khang, Nguyễn Quang Đạt (1984), Nguyên lý tổng hợp thuốc hữu cơ, Nhà xuất bản Y học, Tr. 186 - 224.
11. Tniofng Phương, Huỳnh Thị Nguyên Thuỷ (1998), Tổng hợp và thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của các dẫn chất 3 - salicylamino rhodanin”, Tạp chí dược học, Số 9, Tr. 19 - 21.
12. Truofng Phương, Nguyễn Thị Ánh Tuyết, Nguyễn Đinh Nga, Phạm Thị Tố Liên (2000), “Tổng họfp và thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của các dẫn chất 3 - [3’,5’ - diclorosalicylamido]rhodanin”, Tạp chí dược học, Số 9, Tr. 12 - 15.
13. Nguyễn Thị Xuân Thuỷ (1994), T ổng hợp dẫn chất furfural dự đoán cố tác dụng dược lý, Luận án phó tiến sĩ khoa học Y dược, Đại học Dược Hà Nội.
14. Nguyễn Đình Triệu (1999), Các phương pháp vật lý ứng dụng trong hoá học, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia.
15. Phùng Anh Thư (2005), Tổng hợp và thăm dò tác dụng sinh học một số dẫn chất của rhodanin, Khoá luận tốt nghiệp dược sĩ đại học, Đại học Dược Hà Nội.
16. Nguyễn Thi Xuân Thuỷ, Nguyễn Khang, Nguyễn Quang Đạt (1991), “Nghiên cứu tổng hợp dẫn chất furfural có tác dụng dược lý”. Tạp chí dược học , Số 1, Tr. 4 - 5 .
TIẾNG ANH:
17. Akerblom Eva.B. (1994), “ Synthesis and structure - activity relationships of a series of antibacterially active 5- (5- Nitro- 2-
furfurylidenne)thiazolones, 5- (5- Nitro- 2- furfurylpropenylidene) thiazolones”, X Med.Chem.,Yol 17, N^.6, pp. 759 - 762.
18. Al- Shamma Hussien, Pafahl (2004), “Preparation of 5- benzylidene rhodanines and analogs as antidiabetes and antitumor agents”, J. Virol,
Vol. 17, N^.2, pp. 759-762.
19. Allan F.G., Allan c.c. (1963), “The condensation of rhodanine and derivatives aromatic aldehydes containing idoine”, C.A., Vol. 59, 593b.
20. Bailey Thomas (2000), “ Arylalkylidene rhodanine with bulky and hydrophobic functional group as selective HCV NS3 protease inhibitor” ,