2.3.1.1. Sắc kí lớp mỏng ( SKLM) :
Sau khi tổng hợp chúng tôi đã tiến hành kiểm tra độ tinh khiết của sản
phẩm bằng SKLM trên bản mỏng Silicagel Kieselgel 60 F254 (Merck), Các
chất đều được hoà tan trong aceton.
Sau khi thử khai triển trên một số hệ dung môi như :
- CHCI3: CôHé ( 8 : 1); (10 : 1); (13 : 1); (15 : 1). - Aceton : benzen ( 1 : 4 )
- CHCI3 :MeOH(30: 1)
Chúng tôi đã lựa chọn ra những hệ dung môi khai triển thích hợp cho từng chất. Các chất đem thử đều cho một vết gọn rõ khi soi dưới ánh sáng đèn tử ngoại có bước sóng là 254 nm.
Bảng 2 : Tóm tắt kết quả kiểm tra độ tỉnh khiết bằng SKLM
Chât Hệ dung môi khai triên Rf Chât Hệ dung môi khai triển
Rf I Aceton : benzen ( 1 : 4 ) 0,70 IV CUCh-.Ceíỉe ( 1 5 : 1 ) 0,27 II CHCI3 : Me O H ( 3 0 : 1) 0,80 V CHClsiCôHô ( 1 5 : 1 ) 0,55 III CHChiCeUe ( 1 5 : 1 ) 0,31 VI CHCI3: CóHô ( 1 5 : 1 ) 0,54
2.3.1.2. Xác định nhiệt độ nóng chảy :
Cả 6 chất chúng tôi đã tổng hợp đều xác định được điểm chảy rõ ràng. Hai chất (I, II) có điểm chảy phù hợp với các tài liệu đã công bố [4]; [25]. Kết quả đã được nghi ở bảng 1.
Vậy các chất chúng tôi tổng họp được có thể kết luận sơ bộ là tinh khiết.
2.3.2. Xác định cẩu trúc của các chất tồng hợp được
Để xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được chúng tôi đã tiến hành ghi phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại (ƯV), phổ khối lượng (MS).
2.3.2.1. Phổ hồng ngoại (I R )
Tại phòng thí nghiệm trung tâm trường Đại Học Dược Hà Nội chúng tôi đã ghi phổ hồng ngoại trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000 - 500 cm’\ Các phổ được ghi từ phụ lục 1 - 6 , kết quả phân tích số liệu phổ hồng ngoại được thể hiện ở bảng 3.
Bảng 3 : số liệu phân tích phổ IR ( cm^).
Chât Biện giải
^ NH ^ CH2 ,CH3 V c = 0 ^ —'Carom 4 :h2 s benzerj CH I 3128 2823 1738 1657 1341 II 3138 1738 1690 1609 1492 1447 1336 1165; 1021; 761;683 III 2957 2853 1747 1689 1606 1491 1447 1340 1162;1143; 1006;765;686 IV 2833 2809 1741 1689 1608 1490 1445 1395 1166;1114; 764;685 V 3395 2930 2815 1732 1677 1602 1513 1447 1398 1127;1078; 752;685 VI 3377 2932 2820 1736 1676 1608 1521 1446 1328 1188;1106; 814;763; 683
Phân tích phổ đồ của các chất tổng hợp được cho phép chúng tôi nhận biết được các dải hấp thụ đặc trưng của dao động hoá trị, dao động biến dạng của các nhóm chức và các liên kết điển hình có trong cấu trúc phân tử các chất mà chúng tôi tổng họp được như: -NH, c = 0 , CH2, nhân benzen. số liệu phân tích phù họp với các tài liệu tham khảo [1 1]; [16].
* Môt số nhân xét về mối liên quan cẩu trúc hoá hoc - phổ hồỉĩ2 n s o a ỉ:
- Cả 6 chất (I - V I ) có các dải hấp thụ của các yếu tố cấu trúc chung như -N H ,^ = o , nhân benzen, với các sô liệu ghi ở bảng 3.
- Chất I và II có dải hấp thụ ở 3128 em’* và 3138 cm‘*, đặc trưng cho dao động hoá trị của -NH (imid) của vòng thiazolidin-2,4-dion, trong khi đó 4 chất còn lại (III — VI) là dẫn chất base Mannich nên không có dải hấp thụ này. Mặt khác ở hai chất (V, VI) có dải hấp thụ 3395cm‘^ và 3377cm'’ đặc trưng cho dao động hoá trị của -NH-amin ở hợp phần amin thom (anilin và p- toluidin).
- Chất I có dải hấp thụ ở 2823 cm*' là dao động hoá trị của nhóm CH2 của vòng thiazolidin-2,4-dion. 5 chất (II - VI) không có dải hấp thụ này, chứng tỏ phản ứng ngưng tụ đã xảy ra, mặt khác 4 chất (III - VI) có dải hấp thụ ở vùng 2957-293Ocm'* và 2909 - 2853 cm‘* đặc trưng cho dao động hoá trị của nhóm -C H2 ở họp phần aminomethyl của 4 dẫn chất base Mannich trên.
2.3.2.2. Phổ tử ngoại (UV) :
Cả 6 chất tổng hợp đều được ghi phổ tử ngoại trên máy Cary - lE ư v - Visible Spectrophotometer Varían tại phòng Thí nghiệm trung tâm (Đại Học Dược Hà Nội), dung môi Ethanol, nồng độ »20 ụ g ! ml.
Bảng 4 ; số liệu phổ tử ngoại của các chất tổng hợp được Chât .E t O H , . Ẫ m ĩ x ( ) I 203 2 2 1 II 203 230 323 III 205 230 325 IV 205 233 328 V 205 237 324 VI 204 237 324
Phổ tử ngoại cho chúng ta thấy sự chuyển các mức năng lượng của các điện tử trong phân tử ở vùng tử ngoại. Phân tích phổ đồ cho phép chúng tôi nhận biết sơ bộ bộ khung toàn bộ phân tử của các chất tổng hợp được, số liệu này phù hợp với các tài liệu tham khảo [9]; [16].
* Môt sổ nhân xét về mối liên quan cấu trúc hoả hoc và phổ tử nsoai :
- Phổ tử ngoại của chất I có 2 cực đại ở 203 nm và 221 nm được quy cho chuyển mức năng lượng 7T-7Ĩ* của dị vòng thiazolidin-2,4-dion.
- Phổ tử ngoại của 5 chất (II-VI) có 3 cực đại ở các vùng 203 nm, 230- 237 nm và 323-328 nm. ^ max ở hai vùng này 203-205 nm và 230-237 nm được qui cho sự chuyển mức năng lượng TT-TT* của nhân thơm và dị vòng.
^ m a x ở vùng 323-328 nm được qui cho sự chuyển mức năng lượng TT-TĨ*
của hệ liên hợp toàn phân tử và là sự khác biệt so với chất I.
- Có thể nhận xét rằng phổ tử ngoại của chất II và 4 dẫn chất base Mannich (III-VI) có dạng phổ tử ngoại rất giống nhau và Ằ, ^ khác nhau rất
ít là do có cùng khung phân tử, đồng thời có thể nhận thấy các nhóm base Mannich ít ảnh hưởng đến phổ tử ngoại của các chất tổng họp được.
23.2.3. Phổ khối lượng (MS)
Phổ khối lượng được ghi trên máy HP - 5989 B - MS tại phòng phân tích cấu trúc - Viện Hoá Học - Viện KH và CN Việt Nam. Do kinh phí có hạn chúng tôi chỉ tiến hành ghi khối phổ của 2 chất II và III. Hai phổ đồ được ghi trên phụ lục 13, 14, kết quả phân tích phổ khối lượng được thể hiện ở bảng 5.
Bảng 5 : số liệu phổ khối lượng của các chất tổng hợp được .
Chất Công thức câu tạo m/z
II o. N H ( M = 2 0 5 ,2 3 ) 205 (M ^) 1 6 2 (M -H N C O ) 134 (162- C O ) 89( 1 3 4 - C S - lH ) 63 ( 89-C2H 2) III / ~ \ N - CH2-N^___p ( M = 304 ) 205 ( M H-CH2- n ^ \ ) ) 1 6 2 (M -H N C O ) 134 (162- C O ) + / \ 1 0 0 ( CH2- N 0 ) v _ _ / 89( 1 3 4 -C S - IH ) 56( IOO-C2H4O )
Kết quả phân tích cho thấy chất II có pic phân tử và có số khối đúng bằng số khối chất dự kiến và phù hợp với quy tắc Nitơ [11], Phổ của chất III không có pic phân tử, có lẽ do ion phân tử không đủ bền, bị cắt thành hai mảnh đặc trưng, đó là hợp phần chứa H linh động (chất II, m/z 205) và hợp phần aminomethyl tạo ra từ phản ứng Mannich (morpholinomethyl, m/z 100). Tổng số khối của hai mảnh này bằng số khối của phân tử chất III (m/z 304). Ngoài ra phân tích phổ đồ của hai chất II và III cho phép ta nhận biết các pic phân mảnh phù hợp với sơ đồ phân mảnh của các chất.
Sơ đồ phân mảnh chất III / \ -N — CH2“ N^___p m/z 1 3 4 - CO - H CiHỈ m /z 89
2.4. THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC
Đe đánh giá hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được chúng tôi tiến hành khảo sát tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm và kháng tế bào ung thư của chúng. Trên cơ sở đó lựa chọn ra những hợp chất có hoạt tính sinh học cao, định hướng cho những nghiên cứu tiếp theo sâu hơn để ứng dụng trên thực tế. Đồng thời rút ra được các nhận xét sơ bộ về mối tương quan giữa cấu trúc và tác dụng sinh học của dãy dẫn chất base Mannich của 5-benzyliden thiazolidin-2,4-dion.
2.4.1. Thử tác dụng khảng khuẩn, kháng nấm 2.4.1.1. Nguyên tắc của phép thử
Để tiến hành sàng lọc các chất có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm; chúng tôi tiến hành thử hoạt tính kháng vi sinh vật trên phiến vi lượng 96 giếng của các chất tổng hợp được theo phương pháp hiện đại của Vanden Bergher và Vlietlinck (1994) theo hai bước :
Bước 1 : Sàng lọc sơ bộ tìm chất có hoạt tính
Bước 2 : Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chất có hoạt tính. Kháng sinh kiểm định bao gồm : Ampixilin đối với vi khuẩn Gr (+), Tetracyclin đối với vi khuẩn Gr (-), Nystatin đối với nấm sợi và nấm men.
Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm :
- VK Gr (-) : Escherichia colỉ (ATCC 25922) ;
Pseudomonas aeruginosa ( ATCC 25923). - VK Gr (+) : Bacỉìỉus subtillis ( ATCC 27212)
Staphylococcus aureus.
- Nấm sợi : Aspergillus nỉger;
Fusarium oxysporum.
- Nấm men : Candida albicans ;
2.4.I.2. Các bước tiến hành
Bước 1 : Sàng lọc sơ bộ tìm chất có hoạt tính * Chuẩn bị vi sinh vật
- Nấm và vi khuẩn được duy trì trong môi trường dinh dưỡng : Sabouraud dextrose broth và Trypcase soya broth (TBS).
- Các chủng kiểm định được hoạt hoá trước khi tiến hành thử nghiệm trong môi trường dinh dưỡng dịch thể (24 giờ đối với vi khuẩn, 48 giờ đối với nấm).
* Chuẩn bị mẫu thử
- Hoà tan các chất trong DMSO bằng máy Vortex với nồng độ 4 mg/ml.
- Từ dung dịch gốc nhỏ sang phiến vi lưọng 96 giếng.
- Nhỏ vào mỗi giếng đã có mẫu sẵn dung dịch vi sinh vật đã hoạt hoá. * Chuẩn bị đối chứng dưoTig
- Dãy 1 : Môi trường .
- Dãy 2 : Kháng sinh Ampixilin + vi khuẩn Gr (+) kiểm định. (Ampixilin được pha trong DMSO ở nồng độ 0,4 nM ).
- Dãy 3 : Kháng sinh Tetracyclin + vi khuẩn Gr (-) kiểm định (Tetracyclin được pha trong DMSO ở nồng độ 0,4 nM ).
- Dãy 4 : Kháng sinh Nystatin + nấm sợi kiểm định (Nystatin được pha trong DMSO ở nồng độ 0,4 nM).
- Dãy 5 : Kháng sinh Nystatin + nấm men kiểm định (Nystatin được pha trong DMSO ở nồng độ 0,4 nM).
* Chuẩn bị đối chứng âm
- Chỉ có vi sinh vật kiểm định. * Đọc kết quả
- Mầu dương tính khi nhìn bằng mắt thường thấy trong suốt không có vi sinh vật kiểm định phát triển giống như hình ảnh ở các giếng chứng dương. Mầu dương tính ở bước 1 sẽ được tiếp tục thử bước 2 để tính giá trị MIC.
Bước 2 : Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chất có hoạt tính * Các bước tiến hành
- Các bước tiến hành như bước 1; riêng mẫu đã có hoạt tính được sàng lọc ở bước 1 được pha loãng theo các nồng độ thấp dần, từ 4-10 thang nồng độ để tính giá trị tối thiểu mà ở đó vi sinh vật bị ức chế phát triển gần như hoàn toàn,
* Đọc kết quả
- Nồng độ dương tính là nồng độ ở đó không có vi sinh vật phát triển, - Mau thô có MIC < 200 ju g/ml; mẫu tinh có MIC < 50 // g/ml là có hoạt tính.
2.4.I.3. Kết quả thử hoạt tỉnh kháng khuẩn, kháng nấm : ghi ở bảng 6.
* Một số nhận xét về tác dụng kháng khuẩn :
Sau khi tiến hành thử tác dụng kháng khuẩn của 5 chất tổng hợp được (II, III, IV, V, VI) trên 4 chủng vi khuẩn, chúng tôi rút ra một số nhận xét sơ bộ sau đây :
- Chất IV, V có tác dụng trên cả 4 chủng vi khuẩn kiểm định với MIC = 50 // g/ml.
- Chất II chỉ có tác dụng trên 2 chủng vi khuẩn kiểm định là
P.aeruginosa;B.subtillis với MIC = 50 //g/ml,
- Chất VI chỉ có tác dụng trên 1 chủng vi khuẩn kiểm định là
p.aeruginosa với MIC = 50 // g/ml.
Bảng 6 : Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của các chất tổng hợp được
Chât Nông độ ức chê tôi thiêu ( MIC : // g/m l)
Vi khuân G r ( - ) Vi khuân Gr ( + ) Nâm môc Nâm men/ ... . '
E.coli p. aerugỉnosa B.sụbtỉỉlis S.aureus Asp.niger F.oxysporum S.cerevisiae C.albỉcans
II ( - ) 50 50 ( - ) 12.5 12.5 12.5 12.5 III ( - ) ( - ) ( - ) ( - ) 12.5 12.5 ( - ) 25 IV 50 50 50 50 12.5 12.5 12.5 12.5 V 50 50 50 50 12.5 12.5 25 25 VI ( - ) 50 ( - ) ( - ) 12.5 12.5 25 25 2,1
* Một sổ nhận xét về tác dụng kháng nấm:
Sau khi tiến hành thử tác dụng nấm của 5 chất tổng hợp được (II, III, IV, V, VI) trên 4 chủng nấm, chúng tôi rút ra một số nhận xét sơ bộ sau đây :
- Chất II, IV, V, VI có tác dụng mạnh trên cả 4 chủng nấm kiểm định vớiMIC = 12,5 -25//g/m l.
- Chất III có tác dụng trên 3 chủng nấm kiểm định là Asp.niger; F.oxysporum; c .albicans với MIC = 12,5-25/ig/ml.
2.4.3. Thử tác dụng kháng tế bào ung thư
Các công trình nghiên cứu đã công bố [5]; [8]; [15]; [21]cho thấy một số dẫn chất của thiazolidin - 2,4 - dion có tác dụng chống phân bào mạnh trên mô phân sinh thực vật và có hoạt tính kháng các dòng tế bào ung thư người. Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành thử tác dụng kháng tế bào ung thư của các chất tổng hợp được tại phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hoá học các chất thiên nhiên (Viện KH và CN Việt Nam).
Phương pháp thử nghiêm hoạt tính kháng các dòng tế bào ung thư được tiến hành theo phương pháp Likhiwitayawuid đang được lưu hành và áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thư quốc gia Mỹ (NCI).
* Tiến hành
- Dòng tế bào thử nghiệm là : Hep-2 (tế bào ung thư gan người), Lư (tế bào ung thư phổi ).
- Chất thử là II và I I I .
- xế bào ung thư được duy trì liên tục ở điều kiện tiêu chuẩn. Sau khi tế bào được hoạt hoá phát triển đến phase log sẽ được sử dụng cho thử test với các chất thử đã được chuẩn bị sẵn ở 4-10 thang nồng độ khác nhau. Lặp lại 3 lần trên phiến vi lượng 96 giếng trong dung môi DMSO.
- Phiến thử nghiệm bao gồm': tế bào + môi trường nuôi cấy + mẫu thử, được ủ trong tủ ấm CO2 / 37®c / 48-72h để tế bào tiếp tục phát triển.
- Sau đó lấy ra cố định tế bào, rửa, nhuộm tế bào và hoà lại bằng dung dịch chuẩn. Đọc kết quả trên máy đọc Elisa bước sóng 495 - 515nm.
- Giá trị IC50 được tính trên chương trình Table curve với giá trị dựa trên giá trị dãy các thang nồng độ khác nhau của chất thử và giá trị ED (liều lượng tác dụng) đo được,
M ầ u thô có IC50 <20 ỊUg/ml; mẫu tinh có IC50 <5 JLIg/ml là có hoạt tính. * L ư u ý :
Song song làm phiến đối chứng OD (ngày 0) để đối chứng cho lượng tế bào ở thời điểm bắt đầu thí nghiệm.
về đối chứng âm tính : Giá trị OD của DMSO để làm đối chứng cho giá trị của lượng tế bào khi kết thúc thí nghiệm. Cách cố định và rửa tế bào làm như với các mẫu thử.
* Dựa vào kết quả đo được của chứng OD (ngày 0) và OD của DMSO so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu chất thử để tìm giá trị ED50 theo công thức :
OD(mẩu)-OD(ngây0)
ED= ^ - ....... ... ^ _ X 100%
ODiDMSO) - OD{ngãy 0)
Mầu có giá trị ED < 50% là mẫu có hoạt tính, dùng giá trị ED50 của 10 thang nồng độ dựa vào chương trình Table curvet theo thang giá trị logrit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử để tính giá trị IC50.
L n Y = a + b x Y : nồng độ chất thử X : giá trị ED
Do điều kiện kinh phí có hạn, chúng tôi chỉ chọn ra hai chất II và III dự đoán có hoạt tính đem thử tác dụng kháng hai dòng tế bào ung thư nói trên.
Thử nghiệm hoạt tính kháng tế bào ung thư cho thấy cả hai chất II, III đem thử đều âm tính, kết quả cụ thể được trình bày ở bảng 7
Bảng 7 : Kết quả thử hoạt tính kháng ung thư của hai chất II và III
STT Kí hiệu mâu Dòng tê bào
Tỷ lệ tế bào sống sót ( % ) Kêt luận He p - 2 LU 1 DMSO 1 0 0 , 0 ± 0 , 0 1 0 0 , 0 ± 0 , 0 2 Chứng( + ) 3,2 ±0,0 4,1 ±0,01 3 II 99,7 ± 1,5 85,0 ±0,4 Am tính 4 III 98,5 ± 2,1 1 0 0 , 0 ± 1,06 Am tính * Ghi chú : Chứng ( + ) : Ellipticin. 2.5. BÀN LUẬN• 2.5.1. về tổng hợp hoá học
- Phản ứng tổng hợp thiazolidin - 2,4- dion (I) thực hiện dễ dàng và đạt hiệu suất cao như các tài liệu đã công bố.