THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.2 Đánh giá phương pháp vừa cải tiến
3.2.1 Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký
Pha mẫu chuẩn artesunat có chứa 4 mg/ml trong pha động.
Trong bình định mức 25 ml cân chính xác khoảng o.lg aitesunat chuẩn hoà tan và thêm pha động vừa đủ 25ml. Tiêm 20/il dung dịch này vào hệ
thống sắc ký (HPLC) đã chạy ổn định trong khoảng 30 phút và tiến hành trong điều kiện đã chọn. Ghi diện tích píc thu được.Làm như vậy 5 lần. Độ ổn định của hệ thống sắc ký HPLC được biểu thị bằng sai số tưofng đối 8 % của 5 lần tiêm mẫu chuẩn.
Bảng 2: Kết quả độ ổn định của hệ thông sắc ký HPLC
STT Hệ sô bất đối Diện tich píc ( mAU) Độ lệch chuẩn tương đối 1 1,10 85,260 RSD = 0,182% 2 1,09 85,630 3 1,12 85,650 4 1,10 85,600 5 1,08 85,630
Kết quả trình bày ở bảng 2 cho thấy, độ lệch chuẩn tưcfng đối thu được vói artesunat RSD = 0,0182 « 2%, và các giá trị của hệ số bất đối đều nằm trong khoảng: 0,9 - 2 Điều này chứng tỏ hệ thống sắc ký mà chúng tôi sử dụng là thích hợp cho việc phân tích định lượng artesunat.
3.2.2 Khảo sát tính tuyến tinh của phương pháp.
Qiúng tôi tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ với diện tích píc của artesunat trên chất chuẩn artesunat. Pha một dãy dung dịch chuẩn của aitesunat có nồng độ biến thiên từ : 3.2 - 4.8 mg/ml. Tiêm lần lượt
20 mỗi dung dịch vào hệ thống sắc ký đã chạy ổn định vói pha động trong khoảng 30 phút. Giá trị diện tich píc và thòi gian lưu đo được ứng với các nồng độ của artesunat, được trình bày ở bảng 3, và đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tich píc và nồng độ artesunat được ghi ở hình 2.
Bảng 3: khảo sát khoảng tuyến tính giữa nồng độ và diện tich píc của artesunat Nồng độ (mg/ml) 3,2 3,6 4,0 4,4 4,8 Diện tích (mAU.min) 68,36 77,03 85.63 94,81 102,69
Phương trình hồi quy: y = 21,60x -0,74 Hệ số tưcmg quan: r = 0,9995
Y_intercep: - 0,74
Độ lệch chuẩn y_intercep: Sb = 1,049
Khoảng tin cậy y_intercep - 0,74 ± 1,049 (chứa 0) hình 3: Đồ thị đánh giá tính tuyến tính của artesunat.
Tuyến tính artesunat
Nhận xét: Kết quả thu được ở bảng 3 và hình 1 cho thấy trong khoảng nồng độ các chất đã khảo sát, diện tích píc thu được trên sắc ký đồ tỷ lệ thuận vói các nồng độ của chúng và được biểu diễn bằng phương trình hồi q u i:
y = 21,60x -0,74
với hệ số tương quan tưorng ứng r = 0.9995. Như vậy phương pháp là tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát.
3.2.3 Khảo sát tính chính xác của phương pháp.
Chuẩn bị 5 mẫu thử và 5 mẫu chuẩn artesunat, có chứa 4 mg/ml artesunat trong pha động.
Chuẩn bị và cho hệ thống sắc ký chạy ổn định với pha động trong 30 phút, sau đó tiêm 20 ịi\ mỗi dung dịch đã chuẩn bị vào hệ thống sắc ký, và tiến hành sắc ký trong điều kiện đã chọn. Ghi thòi gian lưu và diện tích píc thu được trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử tương ứng. Tính hàm lượng % của aitesunat có trong mẫu thử, dựa trên chuẩn artesunat đã biết hàm lượng. Kết quả được trình bày ở bảng 4
Bảng 4: Kết quả độ chính xác của phương pháp
STT Mẫu thử Mẫu chuẩn Hàm lượng
Lượng cân Diện tích píc Lượng cân Diện tích píc artesunat
(gam) (mAU) (gam) (mAU) (%)
1 0,1014 84,434 0,1024 85,603 98,213 2 0,1013 84,103 0,1019 85,134 97.983 3 0,1020 85,173 0,1023 85,744 98,231 4 0,1023 85,005 0,1022 85,435 98.008 5 0,1021 85,054 0,1020 85,484 98,008 z = 98,089 S ĩ = 0.0961 8% = 0.2712 « 2%
Kết quả độ chính xác của phương pháp ghi ở bảng 4 cho thấy vói các điều kiện sắc ký đã chọn, phương pháp đề xuất để định lượng artesunat có độ chính xác cao, khả năng lặp lại tốt, sai số tương đối của phương pháp rất nhỏ. Như vậy phưcmg pháp là chính xác.
3.2.4 Đánh giá tính đúng của phương pháp
Pha dung dịch chuẩn; trong bình định mức 25ml cân chính xác khoảng
0,lg artesunat chuẩn hoà tan và thêm pha động tói vạch.
Pha 5 dung dịch thử: trong bình định mức 25ml cân chính xác khoảng
0,lg artesunat chuẩn hoà tan và thêm pha động tói vạch.
Chuẩn bị và cho hệ thống sắc ký chạy ổn định với pha động trong 30 phút, sau đó tiêm 20 |xl mỗi dung dịch đã chuẩn bị vào hệ thống sắc ký và tiến hành sắc ký trong điều kiện đã chọn. Ghi thời gian lưu và diện tích píc thu được trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử tương ứng. Tính hàm lượng % của artesunat có trong dung dịch thử dựa trên chuẩn aitesunat đã biết hàm lượng theo công thức ở mục 3.1.2 . Từ đó tính hàm lượng và % tìm lại của mẫu thử .Kết quả được trình bày ở bảng sau:
Bảng 5 : Kết quả thử độ đúng của phưofng pháp SỐTT Khối lượng aitesunat cho vào (g) Lượng hoạt chất có thực (g) Diện tích pic ( lĩiAUmin) Khối lượng tìm lại (g) Phần trăm tìm lại(%) 01 0,1013 0,0999 85,045 0,0999 100,00 02 0,1016 0,1002 85,273 0,1001 99,90 03 0,1023 0,1009 85,859 0,1008 99,90 04 0,1020 0,1006 85,672 0,1006 100,00 05 0,1009 0,0995 85,018 0,0998 100,30 Chuẩn 0,1015 0,1001 85,227 0,1001 100,0 X = 100,02 ; s = 0.2191 ; Sx = 0,098 ; 8% = -^^1 0 0 = 0,2726
Kết quả trình bày ở bảng 5 cho thấy giá trị trung bình của tỷ lệ thu hồi lại là 100,02% nghĩa là nằm trong khoảng từ 98% -102%. Như vậy phương pháp có độ đúng rất cao.
3.2.5 Khảo sát tính đặc hiệu của phương pháp.
Đây là môt chỉ tiêu rất quan trọng trong các phương pháp định lượng artesunat, vì hầu hết các phương pháp định lượng aitesunat hiện đang áp dụng đều có tính đặc hiệu không cao, hàm lượng artesunat thu được từ các phương pháp đều cao. Điều này có thể giải thích là trong quá trình tổng hợp artesunat có lẫn các tạp chất, trong đó chủ yếu là DHA và acid succinic, hai tạp này ảnh hưởng rất lớn đến kết quả định lượng. Để khảo sát tính đặc hiệu của phương pháp chung tôi đã tiến hành định lượng artesunat khi có mặt đồng thời DHA và acid succinic:
+ Trong bình định mức 25 ml, cân chính xác khoảng o.lg aitesunat chuẩn hoà tan và thêm pha động đến vạch.
+ Trong bình định mức 25 ml, cân chính xác khoảng o.lg DHA chuẩn hoà tan và thêm pha động đến vạch.
+ Trong bình định mức 25 ml, cân chmh xác khoảng 0.05g acid succinic chuẩn, hoà tan và thêm MeOH vừa đủ.
+ Trong bình định mức 25 ml, cân chính xác khoảng o.lg artesunat chuẩn; o.lg DHA chuẩn và 0.05g acid succinic chuẩn hoà tan và thêm pha động đến vạch.
Cho hệ thống sắc ký chạy ổn định với pha động trong khoảng 30 phút sau đó tiêm 5 1 lần lượt các dung dịch đã chuẩn bị vào hệ thống sắc ký và tiến hành sắc ký theo chương trình đã chọn ở mục [3.1] ghi thòi gian lưu thu được trên các sắc ký đồ.
Tính đặc hiệu của phưofng pháp được biểu thị bằng thông số thời gian lưu của các chất trên sắc ký đồ và được biểu thị ở các hình sau.
Hình 4 Sắc ký đồ của hỗn hợp 3 chất: Acid succinicy artesunaty DHA.
#1 [modified by Administrator] UV_VIS_1
45.040.(h 40.(h 30.0- 20.0- 10.Ơ- -5.0 mAU 2 - 4.420 A 1 - 2.847 K ẫ WVL:216nm 3-13.327 min hình 5: sắc kỷ đồ của artesunat