Quy trình tách chiết DNA theo phƣơng pháp củaSaghai-Maroof (1984) [29], bao gồm các bƣớc cơ bản nhƣ sau:
Cắt lá của 6-8 cây/dòng khi cây đƣợc 10 ngày sau khi gieo (giai đoạn 3-4 lá).
Nghiền 2g mẫu lá trong nitơ lỏng cho đến khi thành bột mịn và chuyển mẫu nghiền vào trong tuýt ly tâm 2.0.
Thêm 500µl dung dịch đệm 2x CTAB. Trộn đều mẫu và ủ ở 65 C trong 30 phút . Đảo nhẹ mẫu 10 phút một lần.
Bổ sung 500µl chloroform - phenol - isoamyl alcohol (25:24:1). Trộn đều mẫu trong khoảng 1 phút, sau đó ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 5 phút.
Cẩn thận chuyển 500µl dịch nổi vào trong một tuýt ly tâm sạch 1,5ml.
Thêm 500µl isopropanol lạnh và trộn bằng cách đảo nhẹ, đặt ở -300C trong 1 giờ. Ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 5 phút để thu tủa DNA ở đáy của tuýt.
Gạn bỏ chất lỏng và rửa mẫu DNA với 500µl của ethanol 70%. Ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 5 phút và cẩn thận gạn bỏ ethanol và thu tủa DNA.
Làm khô DNA ở nhiệt độ phòng và hòa tan DNA bằng 100µl dung dịch TE 1X và búng nhẹ tuýp.
Loại RNA bằng cách thêm 1.0µl của RNAse 10mg/ml trên 100 µl dung dịch DNA, trộn đều và ủ ở 37 trong 30 phút. Thực hiện lại bƣớc tủa DNA bằng ethanol và hòa tan DNA trong 100 µl đêm TE 1X. Trữ mẫu DNA gốc ở -20 nghiên cứu tiếp theo.
Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch DNA tổng số
(Ultrospec UV/ Visible-65 spectrophotomrter). Nồng độ DNA đƣợc tính theo công thức sau:
Nồng độ DNA (µg/ µl) = (OD260 x 50 x 50 µg/ µl)/1000
Trong đó: OD260 là chỉ số đo được ở bước sóng 260 50 là hệ số pha loãng
50 µg/µl là hằng số
Tỉ lệ OD260/OD280 phản ánh độ tinh sạch của mẫu. Tỉ lệ này nằm trong khoảng 1,8 - 2,0 thì DNA đƣợc coi là sạch.