4.1. Kết luận
1. Chỳng tụi đó đó chọn được chủng vi rỳt cỳm A/H5N1 thuộc clade 2.3.2.1c hiện đang lưu hành phổ biến làm nguồn chủng để phỏt triển chủng gốc chế tạo văc xin. Vi rỳt cỳm A/Dk/VN/QB7412 là chủng độc lực cao với chỉ số gõy chết khi tiờm tĩnh mạch (IVPI) là 3 trờn vịt và gà; nước trứng tiếp đời 2 (Pas#2) tại 8log2HA cú liều gõy chết tối thiểu (MLD) cho vịt là 0,2log2/0,2ml sau khi gõy nhiễm 120 giờ (MDT), LD50 cho gà là 4,97log10/0,2ml và MDT là 41,40 giờ; chủng nguyờn gốc này cú khả năng gõy nhiễm và gõy chết phụi trứng gà 10 ngày tuổi ở 6,23log10[EID50, ELD50]/ml, thời gian giết phụi trung bỡnh (MDT) là 27,2 giờ; liều gõy nhiễm 50% tế bào MDCK là 3,23log10TCID50/ml và hiệu giỏ HA ở mức 7,5log2.
Phả hệ của vi rỳt cỳm A/Dk/VN/QB7412 thuộc subtype H5, clade 2 phõn tộc 2.3.2.1c. Vi rỳt cấu trỳc genome bỡnh thường khụng chứa những đoạn dư hoặc khuyết thiếu, gồm 8 phõn đoạn với tổng kớch thước là 13.067 nucleotide (mó truy cập tại Genbank quốc tế là KF182738-KF182745).
2. Từ chủng nguyờn gốc A/Dk/VN/QB7412, sau khi thớch nghi trờn phụi trứng gà [PG] và trờn tế bào dũng MDCK [TB], chỳng tụi đó thu được 2 chủng 7412PG và 7412TB để làm chủng gốc sản xuất văc xin vụ hoạt. Cỏc chủng gốc 7412PG và 7412TB này cú đặc tớnh khỏng nguyờn ổn định và tương đương với vi rỳt tiền thõn sau khi tiếp 20 đời trờn phụi gà và 15 lần liờn tiếp trờn tế bào MDCK. Đặc tớnh di truyền của vi rỳt ổn định trong quỏ trỡnh thiết lập giống gốc (trờn 99% nucleotide và amino acid tương đồng với chủng tiền thõn).
Đặc tớnh di truyền của 2 chủng gốc (masterseed) trờn gene HA được thiết lập sau quỏ trỡnh thớch nghi cú liờn quan đến cỏc đột biến điểm tại vựng HA2. Thành phần nucleotide tại 5 vị trớ (điểm núng đột biến thớch nghi “ký chủ mới trong phũng thớ nghiệm” 1261, 1557, 1586, 1616 và 1683 được xỏc lập là kiểu gene HA để nhận biết chủng masterseed so với chủng tiền thõn (TT): 7412TTA, T, A, C, A; 7412PGA, G, A, G, A; và 7412TBG, T, C, C, C.
Chủng gốc để sản xuất văc xin vụ hoạt trờn phụi trứng gà (masterseed 7412PG) cú chỉ số gõy nhiễm 50% phụi gà là 8,83log10EID50/ml, MTD là 36 giờ và hiệu giỏ ngưng kết hồng cầu đạt 10log2HA; chủng gốc để sản xuất văc xin vụ hoạt trờn tế bào MDCK (masterseed 7412TB) cú chỉ số nhõn lờn trờn tế bào là 8,63log10 TCID50/ml và hiệu giỏ ngưng kết hồng cầu ở mức 10log2HA.
3. Chỳng tụi đó xỏc định được điều kiện gõy nhiễm vịt (và gà) thớ nghiệm để đỏnh giỏ hiệu lực văc xin (bằng thử thỏch cường độc) của chủng vi rỳt nguyờn gốc A/Dk/VN/QB7412 Pas#2 trờn phụi trứng gà: Liều gõy chết 83% vịt thớ nghiệm (MDT là 107 ± 28 giờ) là 200 àl huyễn dịch vi rỳt cú 8log2HA pha loóng tại 1/8; liều gõy chết 100% gà (MDT là 41,40 ± 0,72) giờ là 200 àl chứa 100 LD50/ml.
Văc xin vụ hoạt, nhũ dầu chế từ hai chủng giống gốc cho đỏp ứng miễn dịch cao ở vịt và gà. Gia cầm miễn dịch cú hiệu giỏ khỏng thể từ 6log2HI trở lờn được bảo hộ và khụng bài thải vi rỳt khi gõy nhiễm bằng nguyờn chủng A/Dk/VN/QB7412.
Trong điều kiện phũng thớ nghiệm, một liều duy nhất văc xin vụ hoạt tạo được đỏp ứng miễn dịch đặc hiệu với hiệu giỏ HI đạt 6-7log2 (mức miễn dịch khụng thải trựng), bảo hộ 92,31% vịt (và 97,44 % trờn gà) khi thử thỏch cường độc với nguyờn chủng gốc A/Dk/VN/QB7412. Hơn nữa, gia cầm miễn dịch cú khả năng bảo hộ chộo với vi rỳt cỳm A/H5N1 thuộc cỏc clade 1, clade 2.3.2.1a và clade 2.3.2.1b đạt trờn 80% với cả vịt và gà.
Kết quả bảo hộ được tỏi lập (bảo hộ trờn 90% với cả vịt và gà với nguyờn chủng và bảo hộ chộo ớt nhất trờn 80%) khi thử nghiệm văc xin trờn gia cầm nuụi ở điều kiện thực địa.
4.2.Kiến nghị
Đề nghị ứng dụng 2 chủng gốc vi rỳt tạo được trong nghiờn cứu này (ở cơ sở cú đủ điều kiện an toàn sinh học) để sản xuất văc xin vụ hoạt phũng cỏc chủng vi rỳt cỳm A/H5N1 đó và đang lưu hành tại Việt Nam.
Tiếp tục nghiờn cứu tối ưu húa nuụi cấy vi rỳt trờn tế bào và ứng dụng cụng nghệ tế bào thay cho phụi trứng trong sản xuất văc xin cỳm gia cầm.
Đề nghị thực hiện di truyền ngược đối với chủng gốc A/Dk/VN/QB7412 nõng cao an toàn sinh học trong quỏ trỡnh sản xuất.
Tiếp tục nghiờn cứu khả năng tạo miễn dịch khụng mang trựng ở thủy cầm trong điều kiện thực địa.