3.2.1 Phƣơng pháp tách chiết
Nguyên liệu đƣợc chiết trong ethanol bằng phƣơng pháp ngâm dầm, mỗi lần ngâm khoảng 24 giờ thu đƣợc dịch chiết. Dịch chiết của các lần ngâm đƣợc gom lại cô quay đuổi dung môi thu đƣợc cao ethanol tổng.
Điều chế các cao chloroform bằng phƣơng pháp chiết lỏng-lỏng, sơ đồ điều chế các loại cao:
Hình 3.2 Qui trình điều chế các loại cao
3.2.2 Phƣơng pháp phân lập
Sử dụng phƣơng pháp SKC để tách các chất, dò tìm hệ dung môi giải ly cột và kiểm tra quá trình SKC cũng nhƣ mức độ tinh sạch của hợp chất bằng SKLM so với chất chuẩn.
Dịch chiết PE, chloroform
Dịch nƣớc acid Nguyên liệu khô
Ngâm dầm với ethanol 96
Dịch chiết cô quay đuổi dung môi
Cao ethanol tổng
Acid hóa cao ethanol tổng
Chiết lỏng-lỏng với PE, chloroform
Kiềm hóa
Chiết lỏng-lỏng với chloroform
CHƢƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Quá trình điều chế các loại cao
4.1.1 Quá trình điều chế thu cao ethanol
Mẫu nguyên liệu lá Cà độc dƣợc khô đƣợc ngâm trong ethanol 96với tỷ lệ nguyên liệu:dung môi là 1:4. Sau thời gian khoảng 24 giờ/mỗi lần ngâm thu lấy dịch chiết, lọc dịch chiết bằng máy lọc áp suất thấp và đem cô quay thu hồi dung môi. Cứ thế lặp lại quá trình này thêm 2 lần nữa. Sau đó, gom tất cả các lần thu cao trên lại sẽ đƣợc cao ethanol có màu xanh đen. (Hình 4.1)
Cao ethanol tổng đƣợc gửi Phòng kiểm nghiệm xác định hàm lƣợng sopolamine bằng phƣơng pháp HPLC.
Hình 4.1 Cao ethanol từ lá Cà độc dƣợc
4.1.2 Quá trình điều chế cao chloroform (cao C)
Cao ethanol đã thu đƣợc ở trên sử dụng cho quá trình điều chế cao C bằng các bƣớc sau:
Acid hóa cao ethanol (chuyển alkaloid sang dạng muối)
Cho hết lƣợng cao ethanol vào cốc 1000 mL, thêm từ từ dung dịch acid H2SO4 1N vào cốc đựng cao, khuấy đều và thử giấy đo pH vạn năng đến khi pH của hỗn hợp khoảng 2-3 thì ngừng cho acid, đun ấm và thêm nƣớc cất để
hòa tan hết cao. Hỗn hợp đƣợc lọc bằng máy lọc áp suất thấp và tận chiết lần lƣợt với các dung môi PE, chloroform để loại bớt tạp.
Chuẩn bị bình lóng 1000 mL đặt trên một giá đỡ, mở nắp và khóa van lại. Cho mỗi lần 400 mL hỗn hợp cao đƣợc acid hóa cho vào bình lóng, tiếp tục cho thêm dung môi PE vào bình khoảng 300-400 mL/lần chiết. Đóng nắp bình lại, lắc đều rồi để bình lóng yên trên giá đỡ khoảng 15-20 phút để hỗn hợp trong bình lóng tách thành hai lớp: lớp dƣới màu nâu sậm và lớp trên màu xanh đen. Mở van, phần dung dịch màu nâu chảy sệt và dung dịch chất lỏng màu xanh đen lần lƣợt chảy ra và đƣợc hứng riêng từng cốc. Lấy lớp dƣới tiếp tục chiết với PE cho đến khi màu của lớp PE nhạt dần và kiểm tra bằng SKLM. Nếu thấy không còn vết chứng tỏ chất đã đƣợc trích hoàn toàn vào dung môi PE, sau đó gom lớp PE của các lần chiết lại cô quay thu hồi dung môi.
Tƣơng tự, phần dịch nƣớc màu nâu sậm đƣợc chiết loại tạp tiếp với dung môi chloroform (300-400 mL/lần chiết). Lắc đều và để yên khoảng 15-20 phút, hỗn hợp trong bình lóng lúc này tách thành hai pha, do sự khác biệt về khối lƣợng riêng nên pha nƣớc nằm phía trên, pha hữu cơ nằm phía dƣới. Tách lấy pha hữu cơ cô quay thu hồi dung môi chloroform, pha nƣớc đƣợc hứng ra cốc riêng để tiến hành kiềm hóa.
Kiềm hóa pha nƣớc (chuyển alkaloid về dạng base)
Cho từ từ dd NH3 30% vào cốc đựng pha nƣớc, khuấy đều và thử giấy đo pH vạn năng đến khi pH của hỗn hợp khoảng 9-10 thì ngừng. Sau đó, hỗn hợp đƣợc chiết với dung môi chloroform, cho đến kiểm tra bằng SKLM trên pha hữu cơ và phun thuốc thử đặc trƣng Dragendroff không thấy vết của scopolamine nữa thì dừng lại. Dịch chiết từ dung môi chloroform sẽ đƣợc loại nƣớc bằng Na2SO4 khan, cô quay thu đƣợc cao C (gồm họ alkaloid ở dạng base và các chất tan trong chloroform) và dung môi chloroform thu hồi. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cao C đƣợc gửi Phòng kiểm nghiệm để xác định hàm lƣợng scopolamine bằng phƣơng pháp HPLC.
SƠ ĐỒ ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO
Hình 4.2 Sơ đồ điều chế cao ethanol và cao C từ lá Cà độc dƣợc
4.2 Phân lập scopolamine từ cao C4.2.1 Khảo sát SKLM từ cao C 4.2.1 Khảo sát SKLM từ cao C
SKLM cao C và scopolamine chuẩn với hệ dung môi EA:Me:NH3 (9:1:0,5), thuốc thử Dragendorff, để có thể quan sát hết toàn bộ các alkaloid trong cao C và vị trí vết của scopolamine so với các alkaloid còn lại.
Dịch chiết PE,
choloroform Dịch nƣớc acid Lá Cà độc dƣợc khô
(1 kg)
Ngâm dầm với ethanol 96
Dịch chiết đƣợc cô quay đuổi dung môi
Cao ethanol tổng (250 g)
Thêm H2SO4 1N đến pH=2-3, đun ấm Thêm nƣớc cất hòa tan hết cao, lọc Chiết lỏng-lỏng với PE, chloroform
Thêm dd NH3 30% đến pH=9-10 Chiết lỏng-lỏng với chloroform Làm khan, cô quay thu hồi dung môi
Cao C (3,8 g) Dịch nƣớc còn
Hình 4.3 SKLM scopolamine chuẩn so với cao C
Tuy nhiên, khi hiện hình bằng thuốc thử đặc trƣng Dragendorff thì không thấy đƣợc các chất tạp không phải là alkaloid. Để quan sát đầy đủ các chất trong cao phải hiện hình vết trên bản mỏng bằng thuốc thử H2SO4 (H2SO4 đậm đặc 20% trong methanol). Với thuốc thử này, các vết họ alkaloid đều hiện màu vàng nâu.
SKLM cao C với nhiều hệ dung môi khác nhau, nhận thấy rằng hệ dung môi PE-EA (80:20) đẩy vết tạp kém phân cực nhất lên vị trí Rf ≤ 0,3 trên bản mỏng.
Tiến hành SKC cao C có khối lƣợng là 3,8 g với cột có đƣờng kính 3 cm, sử dụng loại silica gel 60 GF254 khối lƣợng là 80 g, dung môi giải ly đầu tiên là PE, sau đó tăng dần độ phân cực của dung môi với hệ PE:EA. Hứng dung dịch giải ly ra khỏi cột với thể tích mỗi lần là 50 mL. Theo dõi quá trình giải ly cột bằng SKLM, gom các lọ bi có SKLM hiện vết của scopolamine cô quay đuổi dung môi. Đặt tên phân đoạn có scopolamine là SC1, có khối lƣợng 2,01 g.
Phân đoạn SC1 đƣợc SKLM và hiện hình bằng thuốc thử H2SO4, cho một vết chính là scopolamine màu vàng nâu kèm theo nhiều tạp màu xám đen.
4.2.2 Xử lý phân đoạn SC1
Tiến hành SKC phân đoạn SC1 có khối lƣợng 2,01 g với cột có đƣờng kính 2,5 cm và 40 g silica gel. Giải ly cột với dung môi C và tăng dần độ phân cực của dung môi với hệ C:EA. Hứng dung dịch giải ly ra khỏi cột với thể tích mỗi lần là 20 mL. Theo dõi quá trình giải ly cột bằng SKLM, gom các lọ bi có SKLM hiện vết của scopolamine cô quay đuổi dung môi thu đƣợc phân đoạn SC2 với khối lƣợng 0,92 g. Tiến hành SKLM phân đoạn SC2 cho vết chính scopolamine màu vàng nâu, tuy nhiên vẫn còn tạp kéo đuôi. Do đó, tiếp tục SKC phân đoạn này, hy vọng có thể phân lập đƣợc scopolamine tinh sạch hơn.
Hình 4.7 SKC phân đoạn SC1 Hình 4.8 SKLM phân đoạn SC2
4.2.3 Xử lý phân đoạn SC2
Tiến hành SKC phân đoạn SC2 có khối lƣợng 0,92 g, sử dụng buret 25 mL có đƣờng kính 1 cm (thay thế cho cột sắc ký đƣờng kính 1 cm) và 15 g silica gel. Giải ly cột với hệ dung môi C:EA (30:70) và tăng dần độ phân cực. Hứng dung dịch giải ly ra khỏi cột với thể tích mỗi lần là 10 mL. Theo dõi quá trình giải ly cột bằng SKLM, gom các lọ bi có SKLM hiện vết của scopolamine cô quay đuổi dung môi đƣợc phân đoạn SC3 có khối lƣợng 660 mg.
Kiểm tra lại phân đoạn SC3 bằng SKLM so với scopolamine chuẩn, cho thấy 2 vết giống nhau về Rf và màu sắc.
Hình 4.9 SKLM scopolamine chuẩn và phân đoạn SC3 Phân đoạn SC3 này là chất lỏng sệt, màu trắng, tan trong chloroform, ethanol, không tan trong PE và nƣớc.
CHƢƠNG 5
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
5.1 Kết luận
Bƣớc đầu phân lập đƣợc scopolamine từ lá cà độc dƣợc (Datura metel
L.), thu đƣợc kết quả sau:
Hàm lƣợng scopolamine trong nguyên liệu khô (đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp HPLC) là 0,124%.
Một kg nguyên liệu khô điều chế đƣợc 250 g cao ethanol tổng bằng phƣơng pháp ngâm dầm, hàm lƣợng scopolamine trong cao tổng là 0,374%, hiệu suất chiết scopolamine giai đoạn nguyên liệu-cao ethanol là 75,4%.
Điều chế cao chloroform từ cao ethanol với khối lƣợng 3,8 g, hàm lƣợng sopolamine trong cao choloroform là 21%, hiệu suất chiết scopolamine giai đoạn nguyên liệu-cao chloroform là 64,4%.
Đã tiến hành SKC trên 3,8 g cao C, thu đƣợc phân đoạn có scopolamine (SC3) có khối lƣợng 660 mg. Hiệu suất cả quá trình chiết scopolamine từ Cà độc dƣợc là 53,2%.
5.2 Kiến nghị
Nghiên cứu tách chiết scopolamine bằng hệ thống CO2 siêu tới hạn
Kiểm tra phân đoạn SC3 bằng HPLC hoặc IR để có đƣợc đánh giá chính xác hơn
Bán tổng hợp scopolamine tạo một số dẫn xuất:
Scopolamine hydrobromide (C17H21NO4.HBr.3H2O);
Scopolamine hydrochloride (C17H21NO4.HCl);
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Đỗ Tất Lợi, 2004. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học.
[2] http://vi.wikipedia.org/wiki/Họ-Cà, truy cập ngày 24-10-2013.
[3] http://www.duoclieu.org/2012/02/ca-oc-duoc-datura-metel-l-ho-ca.html, truy cập ngày 18-10-2013.
[4] Tôn Nữ Liên Hƣơng, 2008. Nghiên cứu hợp chất thiên nhiên, Giáo trình đại học, khoa Khoa học Tự Nhiên, trƣờng Đại học Cần Thơ.
[5] Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007. Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.
[6] http://www.drugfuture.com/chemdata/scopolamine.html, truy cập ngày 12-08-2013.
[7] Varahalarao Vadlapudi và D.S.V.G.K.Kaladhar, 2012. Antimicrobial study of plant extracts of Datura metelL. against some important disease causing pathogens, Asian Pacific Journal of Tropical Disease, S94-S97.
[8] Bing-You Yang, Yong-Gang Xia, Qiu-Hong Wang, De-Qiang Dou, Hai-Xue Kuang, 2010. Two new amide alkaloids from theflower of Datura metelL., Fitoterapia, 81: 1003-1005.
[9] Avaratnarajah Kuganathan và Sashikesh Ganeshalingam, 2010. Chemical Analysis of Datura Metel Leaves and Investigation of the Acute Toxicity on
Grasshoppers and Red Ants, E-Journal of Chemistry, 8(1): 107-112. [10] Nguyễn Thị Diệp Chi, 2008. Bài giảng các phương pháp phân tích hiện