M omceae).
Thí nghiệm được tiến hành 3 lần.
Kết quả của quá trình được trình bày ở bảng 2.
Bảng 2; Kết quả giai đoạn tách chiết lectin
Mẫu thí nghiệm Nguyên liệu (mg) Protein tổng sô Hoạt độ tổng sô' (HAA. 10^) Hoạt độ riêng (HAA/ mg) Tỷ lệ thu hồi (%) 3000 597,0 19660,8 32932,66 19,90 3000 609,6 19660,8 32251,97 20,32 3000 614,4 19660,8 32000,00 20,48 Trung bình 3000 607,0 19660,8 32394,88 20,23
Kết quả bảng 2 cho thấy từ 3000 nig nguyên liệu ban đầu chúng tôi tách chiết được 607mg protein, chiếm 20,23% so với bột hạt.
2.2.3 Giai đoạn kết tủa Protein - iectin;
* Thăm dờ nồng độ Am onisuỉphat dàng đ ể kết tủa protein - lectin
- Khảo sát khả năng kết tủa protein- lectin bằng amonisulphat ở các nồng độ 70%, 80%, 90% bão hoà.
- Hoà tan tủa bằng đệm PBS pH 7,4. Xác định hoạt tính của lectin và hàm lượng protein.
- Độ lặp lại của thí nghiệm: 3 ỉần. - Kết quả được trình bày ở bảng 3.
Mẫu TN Nồng độ amonisulphat 70% bão hoà Nồng độ amonisulphat 80% bão hoà Nồng độ amonisulphat 90% bão hoà Protein tổng số (mg) Hoạt độ tổng số (HAA. 10^) Protein tổng số (mg) Hoạt độ tổng số (HAA. 10^) Protein tổng số (mg) Hoạt độ tổng số (HAA. 10^) 1 385,5 4915,2 555,2 26214,4 515,04 24248,32 2 414,48 5406,72 530,58 24248,32 546,00 25559,04 3 408,32 5242,88 514,9 24903,68 539,98 24903,68 T.bình 402,77 5188,27 533,56 25122,13 533,67 24093,68
Kết quả cho thấy:
- Với nồng độ amonisulphat 80% bão hoà thì khả năng kết tủa protein -lectin là hiệu quả nhất.
- Với nồng độ amonisulphat 70% bão hoà thì chưa kết tủa hết lectin.
- Với nồng độ amonisulphat 90% bão hoà thì lượng protein - lectin kết tủa không tăng hom nhiều và hoạt tính cũng không cao hcín.
Vì vậy chúng tôi đã chọn amonisulphat 80% bão hoà để kết tủa protein- lectin.
Mẫu TN Protein tổng số (mg) Hoạt độ tổng số (HAA.IO^) Hoạt độ riêng (HAA/ mg) Độ sạch (lần) Tỷ lệ thu hồi (%) 1 555,20 26214,40 47216,14 1,46 91,47 2 530,58 24248,32 45701,53 1,41 87,41 3 514,90 24903,68 48366,05 1,49 84,83 Trung bình 533,56 25122,13 47097,57 1,45 87,90 Từ kết quả bảng 4 cho thấy: Với nồng độ amonisulphat 80% bão hoà chúng tôi đã thu hồi được 87,90% protein - lectin, có độ tinh sạch tăng 1,45 lần.
2.2.4 Giai đoạn tinh chẽ lectin mít dại
♦ Khảo sát hàm lượiig protein nạp cột:
- Nạp dịch chiết 2 lên cột Sepharose 4B- Mucin với các hàm lượng khác nhau. Kết quả gắn protein lên cột được trình bày ở bảng 5.
Bảng 5: Khả năng gắn protein của cột Sepharose 4B- Mucin
Mãu thí nghiêm Protein nạp cột (mg) Protein gắn cột (mg) 1 4,16 3,5 2 6,94 5,0 3 9,72 5,2 4 13,88 5,5 5 16,60 6,0
Kết quả khảo sát cho thấy: Khả năng gắn protein tối đa của cột là khoảng 5 - 6 mg protein.
Vì vậy khi tiến hành tinh chế lectin bằng sắc ký ái lực, dịch chiết nạp cột ứiích hçfp là chứa khoảng 6 mg protein.
♦ Phản hấp p h ụ lectìn:
- Lectin bị phản hấp phụ ra khỏi cột bằng galactose 0,75M/ NaCll M.
- Thu các phân đoạn 4ml, xác định hàm lượng protein của từng phân đoạn bằng phưomg pháp đo độ hấp thụ tử ngoại ở bước sóng 280nm.
- Kết quả được trình bày trên hình 4.
Hình 4. Đồ thị tinh chế lectin mít dại bằng cột sác ký ái lực Sepharose 4B - Mucin
Dồn các phân đoạn đỉnh có hàm lượng protein cao, thẩm tích kỹ để loại galactose và NaCL Xác định hoạt tính và hàm lượng protein của dịch lectin tinh chế D3.
Kết quả giai đoạn tinh chế lectin bằng cột sắc ký ái lực được trình bày ở bảng 6 .
Bảng 6: Kết quả giai đoạn tinh chế lectin bằng cột sắc ký ái lực Sepharose 4B - Mucin Mẫu TN Protein nạp cột (mg) Protein gắn cột (nig) HĐTS (HAA.IO^) HĐR (HAA/ mg) Tỷ lệ thu hồi (%) Độ sạch (lần) 1 6,94 1,24 499,71 402991,94 17,87 8,56 2 6,87 1,19 483,33 406159,66 17,32 8,62 3 6,76 1,20 491,52 409600,00 17,75 8,70 T.bình 6,86 1,21 491,52 406250,53 17,65 8,63
Kết quả bảng 6 cho thấy: Qua quá trình tinh chế đã thu được 1,21 mg lectin tinh sạch với độ sạch tăng 8,63 lần, hiệu suất thu hồi đạt 17,65%.
2.2.5 Tóm tát kết quả tách chiết và tinh chế lectỉn mít dại:
Toàn bộ kết quả của quá trình tách chiết và tinh chế lectin từ hạt cây mít dại (Artocarpus masticơta G- Moraceae) với 3 g nguyên liệu ban đầu được tổng hợp ở bảng 7.
Bảng 7: Tóm tắt kết quả tách chiết, tinh chế lectin mít dại
(j4. masticata G.) Giai đoạn Nguyên liệu (mg) Protein tổng số (mg) HĐTS (HAA.IO') HĐR (HAA/ mg) Độ sạch (lần) Tỷ lệ thu hổi (%) Dịch chiết DI 3000 607 19960,8 32394,8 1 20,23 Dịch chiết D2 533,56 25122,13 47094,57 1,45 87,90 Sắc ký ái lực 94,11 38230,43 406250,53 8,63 17,65
Từ kết quả trên ta tính được từ 100 mg nguyên liệu bột mít dại (A. masticata G.), bằng phương pháp sắc ký ái lực có thể tinh chế được 3,14 mg lectin ở dạng bột, đạt hiệu suất 3,14% so với nguyên liệu thô và có độ sạch tăng 8,63 lần.
2.2.6 Kết quả điện di lectin mít dại tinh chẻ trên gel polyacrylamid:
- Tiến hành chạy điện di dịch chiết D2 và các mẫu lectin đã tinh chế, kết quả được trình bày ở hình 5.
1 2 3 4 5 6
Hình 5. Anh điện di lectin mít dạỉ trên gel polyacrylamit
Chủ thích:
1 - Dịch chiết D2
2, 3, 4, 5, 6 - Lectin mít dại sau tinh chế. Nhán xét:
- Dịch chiết D2 có nhiều protein nên cho nhiều băng protein, trong đó có băng protein chính.
- Lxctin sau khi đã tinh chế qua CỘI cho 2 băng protein chính (14 kDa và 17 kDa), chứng tỏ lectin được tinh chế có độ tinh sạch cao.
2.2.7 Kết quả tinh chê IgA bằng cột sác ký ái lực Sepharose - Jacalin:
- Nạp một lượng dịch mẫu bệnh phẩm đã xử ỉý (theo 2.1.1) chứa khoảng 44 mg lên cột Sepharose- Jacalin.
- Rửa cột bằng đệm PBS pH 7,4 để loại các protein thừa hoặc không gắn cột (Đo quang ở 280nm có OD < 0,02).
- Phản hấp phụ IgA ra khỏi cột bằng dung dịch galactose 0,75M/ NaCl 1M. Thu các phân đoạn 3ml, xác định hàm lượng protein trong từng phân đoạn bằng phưcfng pháp đo độ hấp thụ tử ngoại.
Hình 6. Đồ thị tinh chế IgA qua cột sác ký ái lực Sepharose- Jacalin.
Dồn các phân đoạn có hàm lượng protein lớn, ứiẩm tích kỹ để loại hết galactose và NaCl thì thu được IgA tinh chế.
Xác định hàm lượng protein của dịch IgA tinh chế bằng phưcíng pháp Lowry.
Kết quả quá trình tinh chế IgA qua cột sắc ký ái lực Sepharose - Jacalin được trình bày ở bảng 8.
Bảng 8: Kết quả tinh chế IgA bằng cột sác ký áì lực Sepharose- Jacalin: Mẫu thí nghiệm Protein nạp cột (mg) Protein thu hồi (mg) Tỷ lệ thu hồi(% ) 1 43,55 0,53 1,22 2 43,78 0,55 1,26 3 44,14 0,51 1,16 Trung bình 43,82 0,53 1,21
Kết quả trên cho thấy: IgA có ái lực với iectin mít dại, vì vây ta có thể sử dụng cột sắc ký ái lực Sepharose - Jacaiin để tinh chế IgA với hiệu suất thu hổi là 1,21%.
2.2.8 Kiểm tra khả năng kết hợp của Ig tình chê và Lectin mít tinh
ché bằng phương p h áp ELLA:
- Gắn lectin tinh chế lên bản polypropyỉen. - Cho dịch IgA đã tinh chế vào các giếng,
- Thực hiện phản ứng ELLA, kết quả thu được ở hình 7.
1 1._«
Chú thích:
Hình 7. Ảnh ELLA 1
Giếng A, B, C: Có dung dịch IgA tinh chế qua cột. Giếng D: Mẫu trắng.
Nhãn xét:
IgA có cho phản ứng kết hợp đặc hiệu với lectin mít tinh chế vì vây có thể sử dụng lectin mít để xác định hàm lượng Ig A trong các bệnh phẩm.
2.2.9 Sử dụng lectin mít tinh chê xác định sự thay đổi hàm lượng Ig trong dịch tiết của bệnh nhân viêm cổ tử cung:
- Bệnh phẩm được xử lý theo mục 2.1.1. - Gắn ỉectin lên bản.
- Thực hiện phản ứng ELLA, kết quả thu được ở hình 8.
Hình 8. Ảnh ELLA 2 Chú thích:
- Giếng A: Dịch IgA tinh chế.
- Giếng B: Mẫu của người bình thường.
Bảng 9. Kết quả của phản ứng ELL xác định sự khác biệt hàm lượng Ig giữa người bình thường và bệnh nhân bị viêm cổ tử cung.
Mẫu thí nghiệm Mật độ quang
Người bình thường 0,073 ± 0,004 Người bị bệnh 0,245 ± 0,066
p<0, 01
Nhận xét;
Có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê về hàm lượng IgA giữa người bình thường và bệnh nhân bị viêm cổ tử cung là 3,36 lần. Như vây, khi bị viêm hàm lượng IgA trong dịch tiết cũng tăng hơn so với bình thường. IgA tăng ừong dịch tiết của ổ viêm có thể đóng vai trò tăng khả năng miễn địch của cơ thể trong các trường hợp viêm nhiễm các vùng niêm mạc.
2.3 Bàn luận:
Hiện nay có nhiều chế phẩm lectin được bán trên thị trường nhưng giá thành rất cao. Từ nguồn nguyên liệu sẵn có trong nước, việc nghiên cứu nhằm tinh chế các chế phẩm lectin có độ tinh sạch cao và giá thành thấp là rất quan trọng. Qua quá trình thực nghiệm đề tài chúng tôi nhận thấy hoàn toàn có thể tinh chế các lectin có chất lượng cao, giá thành thấp, phù hợp với điều kiện của Việt Nam và nghiên cứu ứng dụng của nguồn lectin tinh chế trong nước.
Tiếp thu từ các kết quả của các đề tài trước đó, khi thay đổi một số điều kiện tách chiết chúng tôi đã đạt được hiệu suất thu hồi cao hofn và độ tinh sạch tăng lên:
+ Dựa vào ảnh hưởng của nồng độ các muối và các ion kim loại tới tính tan của lectin [24], chúng tồi đã tăng thêm nồng độ NaCl IM trong đệm PBS pH 7,4. Ngoài ra bằng cách sử dụng khuấy từ, chiết 3 lần mỗi lần Ih, hiệu suất chiết protein đã được nâng lên 4,65 lần, và hoạt tính của lectin cũng tăng 1,8 lần so với tác giả trước chỉ đùng đệm PBS pH 7,4 làm dung môi và chiết trong 3 0 p h ú t/ỉần [51.
+ Kết tủa protein bằng phưcmg pháp diêm tích là quá trình thuận nghịch,
vì vậy muốn quá trình kết tủa đạt đến trạng thái cân bằng cần phải có một thời gian nhất định. Theo kinh nghiệm của chúng tôi để ổn định một lượng kết lớn như vậy thì thời gian kết tủa phải tăng lên 24h/ 4° c thay cho 12h/ 4® c như tác giả trước đã làm. Kết quả cho thấy giai đoạn kết tủa protein - lectin đã làm tăng độ tinh sạch của lectin lên 1,45 lần, trong khi tác giả trước chỉ thu được lectin có độ sạch tăng 1,02 lần.
+ Khảo sát lại nồng độ amonisulphat dùng để kết tủa protein - lectin cho thấy ở nồng độ amonisulphat 80% bão hoà kết tủa protein - lectin mít dại đạt hiệu suất cao nhất, trong khi đó muốn kết tủa ConA nhiều nhất thì phải sử dụng amonisulphat 70% bão hoà [lj. Như vậy với mỗi loại lectin khác nhau phải cần đến những nồng độ muối amonisulphat khác nhau để cho kết tủa tối
đa. Do đó việc xác định nồng độ muối kết tủa thích hợp có ảnh hưởng rất lớn tới độ tinh sạch và hiệu suất tinh chế của lectin,
+ Dựa trên cơ sở các nghiên cứu về ái lực giữa lectin mít và IgA [32, 33J chúng tôi đã sử dụng cột sắc ký ái lực Sepharose - Jacalin để tinh chế được IgA lần đầu tiên từ dịch tiết của bệnh nhân viêm cổ tử cung, cho hiệu suất thu hồi là 1,21 %. Chúng tôi chưa thấy có tác giả nào công bố về vấn đề này.
+ Mặc dù lectin là những chất không có nguồn gốc miễn địch nhưng chúng lại có khả năng liên kết với các chất khác theo kiểu kết hợp đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể. Vì iectin mít có ái lực với ỉgA [32, 33], nên chúng tôi đã sử dụng lectin mít dại tinh chế có vai trò như một kháng nguyên trong phương pháp ELLA để xác định IgA. Kết quả cho thấy có sự gia tăng hàm lượng IgA ở dịch tiết của bệnh nhân viêm cổ tử cung so với người bình thường. Trong các nghiên cứu trước dây, một số tác giả đã xác định có sự gia tăng hàm lượng IgA trong huyết thanh cua một số trường hợp viêm nhiễm [2] nhưng chưa có đề tài nào nghiên cứu hàm lượng IgA trong dịch tiết. Kết quả của chúng tôi không chỉ chứng tỏ igA có vai trò quan trọng làm tăng khả năng đáp ứng miễn dịch tại chỗ của cơ thể mà còn gợi mở khả năng sử dụng lectin mít dại tinh chế để xác định hàm lượng IgA kể cả huyết thanh hay dịch tiết trên các đối tượng bệnh khác như viêm niêm mạc đưòmg tiêu hoá, viêm gan virus, ung thư vòm họng...
PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT:
Từ những kết quả trên chúng tôi đưa ra những kết luân sau:
1. Lectin được tách chiết từ Artocarpus mastỉcata G. Moraceae gây ngưng kết không đặc hiệu nhóm máu, có hoạt tính cao và ổn định ư-ên nhóm máu A. 2. Đã ổn định được quá trình tách chiết và tinh chế lectin:
Dùng đệm PBS pH 7,4/ NaCl IM đé tách chiết lectin cho hiệu suất cao đạt 20,23%.
- Nồng độ amonisulphat thích hợp để kết tủa lectin mít dại là 80% bão hoà, cho protein - có độ tinh sạch tăng 1,45 lần và có hiệu suất thu hồi protein
87, 90%.
- Sử dụng phương pháp sắc ký ái lực tinh chế lectin mít dại cho thấy:
+ Đã tìm ra dung dịch thích hợp để phản hấp phụ lectin, đó là dung dịch Galactose 0,75 M / NaCl IM cho lectin có độ tinh sạch cao và tỷ lệ thu hồi 17,65%.
+ Chế phẩm ứiu hồi có độ tinh sạch tăng 8,63 lần và hiệu suất đạt 3,14%. - Kết quả điện di trên gel polyacrylamid có SDS và mercaptoethanol chỉ phát
hiện được hai băng protein chính của lectin mít dại, chứng tỏ lectin đã tinh sạch.
3. Đã tinh chế được IgA từ bệnh phẩm dịch tiết của bệnh nhân viêm cổ tử cung bằng cột sắc ký ái lực Sepharose- Jacalin cho hiệu suất thu hồi 1,21%. 4. Bằng phưomg pháp ELLA sử dụng lectin mít dại tinh chế đã phát hiện và xác định được sự tăng hàm lượng IgA trong bệnh phẩm dịch tiết của bệnh nhân viêm cổ tử cung so với người bình thường là 3,36 lần (tính theo mật độ quang).
Từ những kết quả trên, chúng tôi hy vọng công trình này sẽ tiếp tục được nghiên cứu để có thể đưa ra một chế phẩm ỉectin có độ tinh sạch cao đồng thời tiếp tục phát triển những ứng dụng của lectin này ưong các lĩnh vực y, dược, miễn dịch học... đặc biệt là sử dụng lectin mít dại trong phương pháp định lượng IgA trên nhiều đối tượng bệnh khác như viêm niêm mạc đường tiêu hoá, viêm gan virus, ung thư vòm họng...
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Đào Thị Mai Anh
Chiết tách, tỉnh ch ế Con Cơnơvaỉin A từ hạt đậu rựa (Canavalia ensiformis L, Fahaceae) ỏ Việt Nam và nghiên cứu ứng dụng.
Khoá luận tốt nghiệp dược sĩ đại học 200!.
2. Trương Văn Châu
Tinh chế, nghiên cứu mật s ố tính chất của các lectỉn từ một sô'loài thuộc họ đậu (Fahaceae), họ dâu tằm (Moraceae) và khả năng ứng dụng trong y học.
Luận án phó tiến sĩ sinh học 1996. Tr: 12-14.
3. Đào Kim Chí
Cấc phương pháp và kỹ thuật miễn dịch.
Chuyên đề sau đại học 2000. Trường Đại học Dược Hà Nội. Tr: 1-25.
4. Kiều Khắc Đôn
Vai trò của hệ thống miễn dịch giới thiệu về bệnh lý
Chuyên đề sau đại học - Trường đại học Dược Hà Nội 1997
5. ĐỖ Minh Hằng
Chiết rách và tinh ch ế lectin mít dại (Artocarpus masticata G. Moracaea)
Khoá luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học 2000
6. Phùng Thanh Hương
Điều tra sự có mặt của ỉectỉỉi trong một s ố loài thực vật ở Việt Nam. Tách, tỉnh ch ế và tĩghiêỉĩ cứu một s ố tính chất của lectin ở loài mít răng ngựa (Artocarpus heterophylỉus) thuộc họ dâu tằm (Moraceae)
Công trình tốt nghiệp dược sĩ đại học khoá 49. 1999. Tr: 26, 28, 30.
7. Đỗ Ngọc Liên
Miễn dịch học cơ sở
Nhà xuất bản Quốc gia Hà Nội 1999. Tr: 9-53
8. Đỗ Ngọc Lién và Nguyễn Lệ Phi