Tro sulfat

+ Tiến hành: nung một chén sứ tới đỏ trong đến khối lượng không đổi. Làm nguội trong bình hút ẩm. Cân trên cân phân tích ta được mb1.

Cân một lượng chính xác khoảng 1 g hydroxyure thử cho vào cốc sứ. Làm ẩm bằng 1 ml acid sulíuric đặc. Đốt cẩn thận, rồi lại làm ẩm với acid

sulíuric đặc và tiếp tục nung ở khoảng 800°c. Nung đến khối lượng không đổi

(chênh lệch giữa 2 lần cân liên tiếp không vượt quá 0,5 mg) Cân trên cân phân tích ta được m.

Lượng tro sulfat tính bằng phần trăm (T) được tính theo công thức:

T = m ~™h-'- xl 00 (%).

mt

+ Kết quả: khối lượng bì: mbì = 12,8108 g Khối lượng chất thử: mt = 1,0364 g Khối lượng sau khi nung m = 12,8125g

T= 0,16 %.

Đối chiếu với yêu cầu: lượng tro sulfat không được quá 0,5% + Kết luận: Đạt yêu cầu.

2.2.6 Kim loại nặng.

+ Chuẩn bị dung dịch thử: cân khoảng 2,00 g mẫu thử hoà tan trong 20 ml nước cất.

+ Tiến hành: chọn 2 ống nghiệm thuỷ tinh trong suốt giống nhau về chiều dài, đường kính

Lấy 12 ml dung dịch thử cho vào 1 ống nghiệm, thêm 2 ml dung dịch đệm acetat pH 3,5. Lắc đều. Thêm 1,2 ml dung dịch thioacetamid (TT), lắc

ngay rồi để yên 2 phút. Chuẩn bị đồng thời ống mẫu dùng hỗn hợp 10 ml dung dịch ion chì mẫu 3 phần triệu và 2 ml dung dịch thử.

So sánh màu tạo thành tạo thành trong ống thử và ống chuẩn. Màu nâu trong ống thử không được đậm hơn màu trong ống mẫu. ống chuẩn có màu nâu nhạt khi được so sánh với ống trắng được chuẩn bị đồng thời trong cùng điều kiện, dùng 10 ml nước và 2 ml dung dịch thử.

+ Kết quả: màu nâu trong ống thử nhạt hơn trong ống chuẩn. + Kết luận: Mẫu thử đạt yêu cầu về giới hạn kim loại nặng.

2.2.7 Tạp chất liên quan: phương pháp HPLC.

* Điều kiện sắc ký: xem phần định lượng.

Chuẩn bị dung dịch thử như trong phần định lượng.

Triển khai sắc ký dung dịch thử trong thời gian gấp 5 lần thời gian lưu của Hydroxyure để tất cả các thành phần trong mẫu thử đều được phát hiện.

Kết quả: sắc đồ thu được trình bày ở hình 2.3

• 01 M M

1 Á

2 4 é 8 10 12 14

timrn

Nhận xét: trên sắc đồ, ngoài pic chính của Hydroxyure, ta còn thu được 2 pic nhỏ tương ứng ở thời gian lưu 0,250; 2,348- đó là những pic tạp.

Tổng lượng (%) tạp chất = X100 = --- 3 + 95143---xioo= 0,99 (%).

X- , 3 + 95143 + 9469988

L A, i=1

Đối chiếu yêu cầu: tổng tạp không được quá 1,0%. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Kết luận: mẫu thử có tạp chất nằm trong giới hạn qui định. Tuy nhiên, hàm lượng tạp xấp xỉ giới hạn yêu cầu, do đó cần tinh chế thêm để nguyên liệu đạt được độ tinh khiết cao hơn.

2.2.8 Định lượng

2.2.8.1 Lựa chọn điều kiện sắc ký

Dựa vào đặc tính của Hydroxyure, tham khảo tài liệu và khảo sát thực tế, chúng tôi tiến hành sắc ký theo điều kiện sau:

- Cột: C18 (150*4,6 mm; 5 |Lim).

- Pha động: MeOH- nước (5:95).

- Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút.

- Thể tích tiêm: 20 |Lil.

- Bước sóng: 214 nm.

2.2.8.2 Đánh giá phương pháp.

1. Độ phù hợp của hệ thống sắc ký

Tiến hành sắc ký lặp lại 6 lần một dung dịch chuẩn theo các điều kiện đã lựa chọn. Kết quả được trình bày ở bảng 1.

Bảng 2.1: K ết quả đánh giả độ phù hợp của hệ thống.

Lần tiêm Diện tích pic (mAU.giây) Thòi gian lưu (phút)

1 2465859 3,103 2 2466517 3,160 3 2458032 3,092 4 2458316 3,150 5 2451535 3,090 6 2465386 3,132 TB 2460940,8 3,121 RSD% 0,243 0,972

• Nhận xét. đáp ứng thu được (diện tích, thời gian lưu) sau 6 lần tiêm lặp lại một dung dịch chuẩn có độ lệch chuẩn tương đối RSD% là 0,243% (diện tích pic); 0,972% (thời gian lưu) < 2% chứng tỏ điều kiện sắc ký có độ phù hợp tốt, đảm bảo cho việc định lượng hydroxyure.

2 Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính.

Chuẩn bị một dãy năm dung dịch chuẩn có nồng độ chính xác khoảng 0,50; 0,75; 1,00; 1,25; 1,50 mg/ml.

Tiến hành sắc ký ở điều kiện như trên. Mỗi dung dịch chuẩn được sắc ký 2 lần. Kết quả thu được ở bảng sau:

Bảng 2.1: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính

Thứ tự Nồng độ (mg/ml) Diện tích pic (mAU.giây)

1 0,5034 2497284 2 0,7551 3642391 3 1,0068 4727074 4 1,2585 5954433 5 1,5102 7076284 PT hồi qui Y = 4588016,80x +191876,04 .> X Hệ số tương quan r = 0,9999 Đường tuyến tính y “ 4588016.80x + 191876.40 8000000 R2 = 0.9997 >. 7000000 I ■ặ 6000000 i < 5000000 4 E ầa. 4000000 Ị ■g 3000000 i Ị 2000000 5 1000000 j 0 R C(mg/ml) 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00

Nhận xét: với điều kiện sắc ký đã chọn, trong khoảng nồng độ khảo sát, giữa diện tích pic và nồng độ hydroxyure có mối tương quan tuyến tính chặt chẽ (r = 0,9999), trong khoảng khảo sát.

3. Độ lặp lại

Tiến hành 5 phép thử định lượng riêng biệt hydroxyure.

Tiến hành 5 phép thử song song của một mẫu chế phẩm hydroxyure bằng cách: cân một lượng chính xác khoảng 50 mg chế phẩm. Cho lần lượt vào 5 bình định mức 50 ml đã được đánh số từ mẫu một đến mẫu 5. Thêm pha động vừa đủ đến vạch. Lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 ỊẦ m

Tiến hành sắc ký song song với mẫu chuẩn. Mỗi mẫu thử được tiến hành sắc ký 2 lần. Diện tích pic đáp ứng được ghi lại trong bảng sau:

Bảng 2.3: Kết quả đánh giá độ lặp lại

Mẫu mt A1 (m AU.giây) ^2 (mAU.giây) TB Hàm lượng (%) 1 50,5 2533506 2533842 2533674 99,71 2 50,4 2546411 2561296 2553854 100,70 3 51,7 2655149 2644319 2649734 101,85 4 50,5 2577553 2589080 2583317 101,66 5 52,1 2633205 2631834 2632520 100,42 TB 101,02 RSD% 0,87

• Bàn luận: kết quả ở bảng 2.3 cho thấy ở nồng độ khảo sát, độ lặp lại của 5 phép thử song song là khá tốt, RSD là 0,87% nhỏ hơn giới hạn quy định (3 %), chứng tỏ phương pháp có độ chính xác tốt. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

4. Độ đúng

Xác định bằng phương pháp thêm chuẩn.

Nguyên tắc: thêm từng lượng chính xác hydroxyure chuẩn đã biết trước vào mẫu thử. Lượng chất chuẩn thêm vào được xác định thông qua tương quan

giữa nồng độ chất chuẩn thêm vào với chênh lệch của diện tích pic đáp ứng thu được ở dung dịch thử so với dung dịch hỗn hợp ( thử+chuẩn).

Khảo sát với 3 mức thêm vào của chất chuẩn 10%, 20%, 30%. ở mỗi mức thực hiện 5 phép thử riêng biệt.

Bảng 2.4: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp.

Lần % Thêm vào %Tìm lại

Mức 1 1 10% 98,57 2 10% 101,46 3 10% 101,02 4 10% 101,58 5 10% 102,23 TB 100,97 Mức 2 1 20% 102,82 2 20% 100,03 3 20% 102,68 4 20% 100,40 5 20% 102,58 TB 101,70 Mức 3 1 30% 101,70 2 30% 102,83 3 30% 103,26 4 30% 102,70 5 30% 102,46 TB 102,59

Biểu đồ biểu diễn % tìm lại & 100 80 120 N) I 60 1 40 20 0 100.97 101.7 102.59 10% □ Thực tế ■ 0 Tìm lai 3U% Hình 2.5: * Nhận xét: Kết quả ở bảng 2.4 và hình 2.5, chứng tỏ phương pháp có độ đúng cao với tỉ lệ tìm lại là 100,97-102,54%.

Từ các kết quả trên cho thấy phương pháp này phù hợp đ ể định lượng Hydroxyure.

2.2.8.3 Xây dựng quỉ trình thử:

> Chuẩn bị dung dịch chuẩn, thử:

Dung dịch chuẩn hydroxyure: cân chính xác khoảng 50 mg hydroxyure chuẩn đối chiếu cho vào một bình định mức 50 ml. Thêm pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc có đường kính lỗ lọc 0,45 |im.

Dung dịch thử hydroxyure: cân chính xác khoảng 50 mg hydroxyure mẫu thử cho vào một bình định mức 50 ml khác. Thêm pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua lỗ lọc có đường kính lỗ lọc 0,45 ụ,m.

^ Tiến hành đo:

* Chạy pha động để cân bằng cột trong 30 phút.

* Khi tín hiệu đường nền ổn định, tiến hành chạy sắc ký dung dịch thử và chuẩn, ghi lại sắc đồ với thông số diện tích pic của dung dịch thử và chuẩn.

r- Tính kết quả:

Hàm lượng % hydroxyure trong mẫu thử được tính theo công thức sau:

x% = A,mcCc— x io o

Acmtạ - N )

Trong đó:

At và Ac là diện tích pic của dung dịch mẫu thử và mẫu chuẩn. Cc là hàm lượng % của chất chuẩn (Cc =98%).

Mc và mt là khối lượng mẫu chuẩn và mẫu thử (mg). N: Hàm lượng (%) nước trong mẫu thử.

Sau khi tiến hành sắc ký kết quả thu được như sau Bảng 2.5: Kết quả định lượng

TT M ẫu % nước ^cân

(mg) Diện tích píc(A) (mAU.giây) Hàm lượng (%) 1 HI 0,101% 49,8 2306661 97,44 2 H2 0,152% 51,9 2413431 97,87 3 H3 0,116% 49,3 2262832 96,56 4 H4 0,129% 48,5 2350455 101,98 5 Chuẩn 0% (khan) 49,9 2326890 98,00

Hàm lượng CH4N20 2 xác định được qua 4 mẫu chế phẩm đạt từ 96,56 đến 101,98%, các mẫu thử hầu hết đạt về hàm lượng (3/4 mẫu), cho thấy quy trình tổng hợp là khá ổn định, tuy nhiên có một mẫu chưa đạt (96,56%), nên cần phải hoàn thiện hơn nữa quy trình tổng hợp.

+ Yêu cầu: mẫu thử chứa không dưới 97,0%, không quá 103,0% CH4N20 2 tính theo khối lượng đã làm khô.

+ Kết luận: Mẫu H l, H2, H4 đạt Mẫu H3: không đạt. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Từ các kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi đề xuất tiêu chuẩn cơ sở (tiêu chuẩn kỹ thuật và phương pháp thử) đối với Hydroxyure.

TIÊU CHUẨN C ơ SỞ BỌ YTE Hydroxyure TCCS số: TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI Có hiệu lực từ ngày ký 1 CÁC CHỈ TIÊU KỸ THUẬT

1.Tính chất: bột kết tinh, màu trắng hoặc gần trắng, hút ẩm

2. Điểm chảy: 138- 145°c

3. Định tính: có phản ứng dương tính với Hydroxyure.

4. M ất khối lượng do làm khô: không quá 1,0%. /

5.Tro sulfat: không quá 0,5%.

6. Kim loại nặng: không quá 0,003%. i • ' /

7. Tạp liên quan: tổng tạp không quá 1,0%. - -

8.Định lượng: không được dưới 97,0% và không được quá 103,0% CH4N20 2 tính theo chế phẩm đã làm khô.

2 PHƯƠNG PHÁP THỬ

1.Tính chất: lấy một lượng bột trải lên một tờ giấy, dàn đều, mỏng, thử bằng cảm quan.

2. Độ chảy: sấy khô một lượng mẫu thử trong kiện chân không ở 60°c. Tiến

hành theo chỉ dẫn trong dược điển Việt Nam III, phụ lục 5.19 chuyên luận “ xác định nhiệt độ nóng chảy”.

3. Định tính:

* Phương pháp phổ hấp thu hổng ngoai: làm viên với KBr tiến hành theo

chỉ dẫn của Dược điển Việt Nam III, phụ lục 3.2.

• Phương pháp SKLM: Tiến hành theo chỉ dẫn của Dược điển Việt Nam III, phụ lục 4.4. • Điều kiện sắc kỷ: - Bản mỏng: silicagel - Pha động: pyridin-nước-ethylacetat (2:2:10) - Thể tích chấm sắc ký: 5 |_il

- Dung dịch phát hiện: dung dịch dimethyl aminobenzaldehyd 10 g/1 trong dung dịch acid HC1 IM.

• Tiến hành:

Dung dịch thử: hoà tan 50 mg hydroxyure thử trong 1 ml nước cất.

Dung dịch đối chiếu: hoà tan 50 mg hydroxyure chuẩn trong 1 ml nước cất. • Triển khai sắc kỷ:

Trên bản mỏng silicagel dùng mao quản 5 |Lil chấm 2 vết: thử, đối chiếu. Để khô trong không khí.

Tiến hành chạy sắc ký một đoạn 13-15 cm. Lấy ra để khô trong không khí.

Phun dung dịch thuốc thử.

Yêu cầu: vết trên sắc đổ dung dịch thử phải cùng vị trí và màu sắc với vết trên sắc đồ chuẩn đối chiếu.

4. M ất khôi lượng do làm khô: Tiến hành theo chỉ dẫn trong dược điển Việt Nam III, phụ lục 5.16, phương pháp sấy chân không ở 60°c thử trên 2,00 g mẫu.

5. Tro sulfat:

Tiến hành: tiến hành theo chỉ dẫn trong Dược điển Việt Nam III, phụ lục 7.7, phương pháp I.

6. Kim loại nặng: tiến hành theo phương pháp 1 trong chuyên luận thử giới hạn kim loại nặng, dược điển Việt Nam III, phụ lục 7, 4.7, phương pháp I. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Dung dịch thừ. cân khoảng 2,00 g hòa tan trong 10 ml nước cất. Sử dụng dung dịch chì mẫu 3 ppm làm dung dịch đối chiếu.

7. Tạp chất liên quan: phương pháp HPLC. * Điều kiện sắc ký: xem phần định lượng.

Chuẩn bị dung dịch thử như trong phần định lượng.

Triển khai sắc ký dung dịch thử trong thời gian gấp 5 lần thời gian lưu của Hydroxyure.

Lượng (%) của từng tạp được tính theo công thức sau:

% từng tạp = -ậ i- xioo

p :

/ = 1

Tổng lượng (%) tạp chất được tính theo công thức sau:

V A

% tổng = — xioo

IÍ=14

Trong đó:

Ai là diện tích của tạp chất i

ỵ.A r là diện tích pic của tất cả các pic trừ pic ứng với Hydroxyure và pic của chất không bị lưu giữ.

Ỳ, 4 là diện tích pic của tất cả các pic trừ của những chất /=1

không bị lưu giữ. 8. Định lượng: phương pháp HPLC. *Điều kiện sắc ký: - Cột: C18 (150*4,6 mm; 5 |j,m). - Pha động: MeOH- H20 (5:95). - Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút. - Thể tích tiêm: 20 Ịil. - Bước sóng: 214 nm.

*Tiến hành:

Dung dịch chuẩn hydroxyure: cân chính xác khoảng 50 mg hydroxyure chiết từ chế phẩm cho vào một bình định mức 50 ml. Thêm pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc có đường kính lỗ lọc 0,45 |Lim.

Dung dịch thử hydroxyure: cân chính xác khoảng 50 mg hydroxyure tổng hợp cho vào một bình định mức 50 ml khác. Thêm pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua lỗ lọc có đường kính lỗ lọc 0,45 jum.

*Tính kết quả:

Hàm lượng % hydroxyure trong mẫu thử được tính theo công thức sau:

x%= A,mcCc xioo

Acmt(\-N )

Trong đó: At và Ac là diện tích pic của dung dịch mẫu thử và mẫu chuẩn. Cc là nồng độ % của dung dịch mẫu chuẩn ( coi Cc = 98%). Mc và mt là khối lượng mẫu chuẩn và mẫu thử (mg).

KẾT QUẢ KIỂM NGHIỆM NGUYÊN LIỆU HYDROXYURE

BỘ Y TẾ CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI Độc lập - Tự d o - Hạnh p h ú c

PHIẾU KIỂM NGHIỆM

Mẫu kiểm nghiệm: chế phẩm nghiên cứu Hydroxyure, mẫu H2. Nơi sản xuất: bộ môn Hoá hữu cơ, Trường đại học Dược Hà nội. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Yêu cầu kiểm nghiệm: kiểm tra chất lượng. Thử theo: tiêu chuẩn dự thảo

Tình trạng mẫu khi nhận và mở niêm phong để kiểm nghiệm: mẫu thử được đựng trong lọ thủy tinh kín, nhãn rõ ràng.

YÊU CẦU KẾT QUẢ

1. Tính chất: bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng, hút ẩm. 2. Độ chảy: 138-145°c.

3. Định tính: nguyên liệu phải có kết quả dương tính với Hydroxyure

4. Mất khối lượng do làm khô: không được quá 1,0%. 5. Tro sulfat: không quá 0,5%

6. Kim loại nặng: không quá 0,003%.

7. Tạp liên quan: Tổng các tạp không quá 1,0%

8. Định lượng: từ 97,0% đến 103,0% CH4N20 2 tính theo chế phẩm đã làm khô. Đạt Đạt ( 141,l ° c ) Đúng Đạt (0,12%) Đạt (0,16%) Đạt Đạt (0,99%) Đạt (97,87)

2.3 BÀN LUẬN

Ở nước ta, nguyên liệu Hydroxyure được tổng hợp đầu tiên tại bộ môn Hóa hữu cơ, Trường đại học Dược Hà nội. Với mục tiêu đưa nguyên liệu vào quá trình sản xuất tạo ra các chế phẩm có tác dụng điều trị, hiệu quả cao, an toàn thì yêu cầu quan trọng nhất là nguyên liệu phải đảm bảo chất lượng tốt. Trong khi đó, dược điển Việt Nam III chưa có chuyên luận về Hydroxyure nên để đánh giá được chất lượng nguyên liệu này, chúng tôi đã tiến hành xây dựng chỉ tiêu chất lượng cho nguyên liệu Hydroxyure phù hợp với điều kiện thực tế ở Việt Nam.

Các phương pháp phân tích dùng đánh giá chất lượng nguyên liệu có độ chính xác cao, đặc hiệu và phù hợp với điều kiện trang thiết bị kiểm nghiệm ở Việt Nam.

* Định tính: sử dụng phương pháp phổ hấp thụ hồng ngoại

Nguyên liệu Hydroxyure có CTCT: NH2-CO-NH-OH, chứa nhiều nhóm chức khác nhau nên có khả năng hấp thụ IR cho các đỉnh hấp thụ đặc trưng. Cấu trúc phân tử khá đơn giản do đó phổ không quá phức tạp nên dễ dàng dàng biện giải phổ để xác định các nhóm chức trong hợp chất cũng như đối chiếu với phổ của chất chuẩn được tiến hành song song cùng điều kiện.

Bên cạnh đó, phương pháp này có độ chính xác cao, rất phù hợp để định tính các mẫu thử có độ tinh khiết cao như nguyên liệu Hydroxyure do không cần phải trải qua các giai đoạn tinh chế như các mẫu thử là chế phẩm có lẫn