• Phương pháp nuôi cấy và giữ giống:
Giống Streptomyces 10.21 được cấy trên ống thạch nghiêng MT5, ủ cho
phát triển ở 30°c, trong 7-10 ngày. Giống Streptomyces 10.21 sau khi phát triển
được cất giữ trong tủ lạnh 2- 4°c, định kỳ 3- 6 tháng cấy truyền.
• Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán:
Nguyên tắc: Mẫu thử được đặt trên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy vi sinh vật
kiểm định. Kháng sinh từ mẫu thử khuếch tán vào môi trường thạch sẽ ức chế sự phát triển của vi sinh vật kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn .
Tiến hành:
+ Chuẩn bị môi trường cấy vi sinh vật kiểm định:
Vi sinh vật kiểm định được cấy vào môi trường canh thang ủ ở 37°c trong
18-24h. Chuẩn bị nhũ dịch v s v kiểm định có nồng độ 106-107 tế bào/ml, đirajj>ti l
nhũ dịch này vào môi trường thạch thường. Lắc đều đổ vào dĩa petĩi vô trùng với
thể tích 20ml/đĩa. o 4 ^ n°
+ Đưa mẫu thử vào đĩa petri có chứa môi trường đã cấy v s v kiểm định. Có
3 cách đưa mẫu thử vào môi trường chứa v s v kiểm định:
- Khối thạch: Đặt khối thạch o = 6,0mm có chứa v s v sinh kháng sinh lên
bề mặt môi trường đã cấy v s v kiểm định
- Giếng thạch: Đục các giếng trên môi trường đã cấy v s v kiểm định(® =
6,0mm), sau đó nhỏ mẫu thử vào, mỗi giếng nhỏ 0,05ml.
- Khoanh giấy lọc: Khoanh giấy lọc (® = 6,0mm) đã được tẩm ba lân dịch chiết dung môi hữu cơ của mẫu thử, sấy khô ở t°c < 50°c, sau đó đặt lên bề mặt môi trường đã cấy v s v kiểm định.
+ Nuôi cấy : Các đĩa petri có mẫu thử được ủ trong tủ ấm ở t°c = 37°c, trong 18-24h.
+ Đánh giá kết quả: Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Pamer có độ chính xác 0,02mm. Kết quả được đánh giá dựa trên đường kính vòng vô khuẩn, xử lý theo công thức:
Ỳ D i Ẻ (A -£ > )2
D = — --- s = ] — — ---
n V n-1
D: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn
D{. Đường kính vòng vô khuẩn thứ i
s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh n: SỐ thí nghiệm làm song song.
• Phương pháp chọn chủng có hoạt tính kháng sình cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên :
> Pha hỗn dịch bào tử: Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 10.21
cho vào Ống nghiệm chứa 10ml nước cất vô trùng, lắc cho bào tử phân tán đều, thu được hỗn dịch bào tử ở độ pha loãng 10 _1 (định ước). Sau đó pha loãng tiếp đến nồng độ 10 bằng nước cất vô trùng.
> Cấy bào tử : Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1 ml hỗn dịch bào tử ở
các độ pha loãng 10 ^ đến 10 ~6, nhỏ lên bề mặt thạch của MT5 trong đĩa petri.
Dùng que trang vô trùng dàn đều giọt hỗn dịch bào tử trên bề mặt thạch. Tiến hành trên 3 đĩa petri cho mỗi nồng độ pha loãng, cho các đĩa vào tủ ấm 30°c trong 6 ngày cho xuất hiện các khuẩn lạc.
> Phép chọn lọc ngẫu nhiên: Chọn ngẫu nhiên các khuẩn lạc phát triển tốt, mọc riêng rẽ sau 6 ngày, cấy zigzac lên bề mặt MT5 trong đĩa petri cho vào ủ ở 30°c trong 6 ngày rồi lấy ra thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khối thạch.
• Phương pháp đột biến bằng ánh sáng UV:
> Pha hỗn dịch bào tử : Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 10.21
cho vào 10ml nước cất vô trùng, lắc đều tạo hỗn dịch bào tử ở độ pha loãng 10 _1 (định ước). Sau đó dùng lml hỗn dịch bào tử này pha loãng đến nồng độ 10 ^ làm mẫu chứng, 9ml còn lại được đưa vào đĩa petri vô trùng.
> Đột biến dưới tác dụng của ánh sáng u v : 9ml hỗn dịch bào tử ở nồng độ 10'1 trong dĩa petri được chiếu ánh sáng u v (Ằ=254nm) với khoảng cách và thời gian thích hợp (khoảng cách 60cm, thời gian: 5 phút), sau đó lấy ra để chỗ tối 2-3h, rồi dùng pipet vô trùng pha loãng đến nồng độ 10 ~5.
> Cấy các bào tử sau đột biến: Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1 ml mẫu chứng và 0,lml hỗn dịch bào tử đã đột biến ở các nồng độ 10 ^,10 '5 cho vào đĩa petri có chứa MT5, sau đó dùng que trang vô trùng dàn đều giọt hỗn dịch
bào tử trôn bề mặt thạch, mỗi độ pha loãng làm 3 đĩa, các đĩa petri sau khi cấy ủ ở nhiệt độ 30°c trong 6 ngày cho xuất hiện các khuẩn lạc. Đếm các khuẩn lạc,
xác định % độ sống sót theo công thức:
% sống sót = -^ỄrXlOO
N0
N : Số khuẩn lạc sau đột biến,m 5
N : SỐ khuẩn lạc trong mẫu chứng.
- Tiến hành sàng lọc với các khuẩn lạc sau đột biến tương tự như phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên.
- Làm song song mẫu chứng.
- % biến đổi hoạt tính được xác định theo công thức:
% biến đổi hoạt tính = = x l 0 0
D„
D. : Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của biến chủng thứ i sau đột biến.
D0 : Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của mẫu chứng.
Sau khi tiến hành đột biến, dựa vào kết quả thu được lựa chọn ra các biến
chủng có % biến đổi hoạt tính (+) cao nhất để tiến hành nghiên cứu tiếp theo.
• Phương pháp lên men gián đoạn:
> Tạo giống cấp 1: Chủng giống Streptomyces 10.21 sau khi nuôi cấy trên
thạch nghiêng (MT5) đủ 6 ngày tuổi được cấy vô trùng sang bình nón 500 ml chứa 100 ml MT5dd bằng 10 ml nước cất vô trùng, lắc trên máy lắc tròn ở nhiệt độ 30 ± 0,1°C, tốc độ quay 178-180 vòng /phút trong 48h.
> Lên men: Sau 48h nhân giống tiến hành lên men trên nhiều môi trường khác nhau để chọn môi trường lên men tốt nhất, giống c t được cấy vô trùng vào
bình nón 500ml chứa các môi trường dinh dưỡng với tỷ lệ Vgiống : Vmôi trường = 1:10, các bình lên men lắc ở nhiệt độ 30±0,l°c với tốc độ quay 178-180 vòng/phút trong 120h.
• Phương pháp chiết kháng sinh bằng dung môi hữu cơ:
Dịch lên men sau khi lọc loại bỏ sinh khối được chỉnh về pH thích hợp rồi chiết với từng dung môi chiết.
> Phương pháp chiết một lần: Dịch lọc, dung môi được cho lần lượt vào bình gạn theo tỷ lệ Vdung môi : Vdịch lọc = 1:5, lắc 1 phút, để phân lớp trong
lh. Sau đó tách riêng dung môi và dịch lọc.
> Phương pháp chiết nhiều lần: Dịch lọc, dung môi cho lần lượt vào bình gạn theo tỷ lệ Vdung môi : Vdịch lọc = 1:15, lắc 1 phút, để phân lớp trong lh, tách riêng dung môi và dịch lọc. Làm tiếp nhiều lần với tỷ lệ dung môi trên.
Hoạt tính kháng sinh của dung môi và dịch lọc sau mỗi lần chiết được kiểm tra bằng phương pháp khoanh giấy lọc.
• Phương pháp xác định kháng sinh nội bào:
Sinh khối sau khi tách khỏi dịch lên men được rửa bằng nước cất, sấy khô ở 48-50°C. Nghiền sinh khối trong n- butanol với tỉ lệ 1/5 (khối lượng/thể tích) rồi ngâm 24h. Phát hiện kháng sinh nội bào bằng phương pháp khoanh giấy lọc.
• Phương pháp xác định ảnh hưởng của pH đến độ bền vững của kháng sinh trong dịch lên men:
Dịch lọc được phân vào 5 ống nghiêm (mỗi ống 7ml) sau đó điều chỉnh pH trong các ống nghiệm lần lượt là 3, 5, 7, 9, 11, bảo quản trong tủ lạnh. Sau 1 ngày, chỉnh lại pH trong các ống nghiệm về pH trung tính. Thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp giếng thạch. Tiếp tục xác định ảnh hưởng của pH sau 5 ngày tương tự như trên.
+ Bản mỏng sắc ký có kích thước thích hợp, được hoạt hoá ở 110°c trong vòng 30 phút. Dung môi được pha theo đúng tỷ lệ cho vào bình sắc ký (chiều dày lớp dung môi không quá lcm). Chấm dịch chiết có chứa hoạt chất cần sắc ký lên
bản mỏng (bằng micropipet) cách mép dưới l,5cm. Sấy khô bản mỏng ở 40-
50°c, cho bản mỏng sắc ký đã chấm dịch chiết vào bình chạy sắc ký, khi dung môi chạy đến 3/4 bản mỏng bỏ ra đánh dấu vết dung môi chạy (Ddm), xác định vết bằng phương pháp:
- Soi đèn tử ngoại: Bản mỏng sắc ký tráng sẵn đã được trộn với một chất có huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại, khi soi dưới đèn tử ngoại, nếu có vết thử sẽ cho màu thẩm dưới đèn tử ngoại.
- Phương pháp hiện hình vi sinh vật: Đặt bản mỏng vào đĩa petri vô trùng đổ môi trường thạch thường vô trùng đã cấy v s v kiểm định, ủ ở 37°c trong 24h. Vết kháng sinh được xác định bằng sự xuất hiện vòng vô khuẩn.
+ Tính Rf Rf = A -
D dm
Dv : Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của v ế t. D^.: Khoảng cách dung môi chạy.
• Phương pháp phân loại Streptomyces 10.21 theo ISP:
* Chuẩn bị giống: Giống Streptomyces 10.21 được nuôi cấy trong ống
thạch nghiêng đủ 6-14 ngày tuổi.
* Xác định đặc điểm hình thái, màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất
và đánh giá khả năng tạo thành sắc tốhoà tan:
Các môi trường ISP1, ISP2, ISP3, ISP4, ISP5 được hấp tiệt trùng ở 120°C/30 phút, dùng pipet vô trùng hút 20ml vào đĩa petri vô trùng, mỗi môi
trường làm 4 đĩa, cấy bào tử Streptomyces lên bề mặt thạch, ủ ở 28-30°C. Tiến
- Hình dạng chuỗi bào tử và bề mặt bào tử được quan sát dưới kính hiển vi điện tử:
+ Dạng chuỗi bào tử: thẳng (R), thẳng hơi cong (RF), móc câu (RA), xoắn Ốc (S).
+ Bể mặt bào tử có thể có các dạng sau: Phẳng, nhẵn (sm); sần sùi (wa); có gai (sp); có tóc (ha).
- Màu của khuẩn ty khí sinh (màu của bề mặt khuẩn lạc): Có thể có các màu đỏ (R), vàng (Y), xanh lá cây (G), xanh lơ (B), tím (V), xám (Gy), trắng (W). Trường hợp có các màu xen lẫn nhau thì ghi các ký hiệu liền nhau.
- Màu của khuẩn ty cơ chất: Quan sát màu mặt sau khuẩn lạc (mặt dưới đĩa Petri). Thường có các màu vàng nâu, vàng nâu ánh đỏ hoặc da cam, vàng nâu ánh xanh da trời hoặc tím, vàng nâu lẫn xanh lá cây. Nếu thấy các màu trên ký hiệu là (1), nếu không ký hiệu là (0).
- Sắc tố hoà tan nằm ngay trong môi trường có các màu: vàng, xanh, đỏ, tím.. .Nếu có ký hiệu là (1), ngược lại ký hiệu là (0).
* Xác định sắc tố melanin (mầu đen hoặc nâu đen) : Nuôi cấy xạ khuẩn
trên các môi trường ISP6, ISP7 đã hấp tiệt trùng, quan sát ở ngày thứ 2, thứ 4.
Nếu có, ký hiệu là (1), ngược lại ký hiệu là (0).
* Khả năng tiêu thụ nguồn cacbon: Nuôi cấy bào tử trên các môi trường
chứa các nguồn cacbon khác nhau (ISP9) đánh giá ở ngày thứ 7, 14, 21. Nếu bào tử phát triển mạnh hơn khi nuôi cấy trên môi trường ISP chứa chứng dương glucose thì ký hiệu là (++), nếu xạ khuẩn có phát triển tương tự như chứng dương thì ký hiệu là (+), nếu không phát triển ký hiệu là (-), nếu phát triển không rõ ràng ký hiệu là (±).