2.1.1 Nguyên vật liệu
Bảng 3: Nguyên vật liệu sử dụng trong quá trình thực nghiệm
STT Hoá chất Nguồn gốc Tiêu chuẩn
1 MP natri succinat Italy USP24
2 Natri hydroxyd Hungari Tinh khiết hoá học
3 Lactose Đức BP2000
4 Manitol Pháp Tinh khiết hoá học
5 Natri dihydrophosphat dihydrat Nhật Tinh khiết hoá học
6 Dinatri phosphat dihydrat Nhật BP 2000
7 Alcol benzylic Prolabo BP 2000
8 Nước cất XNDPTWII DĐVNIII
10 Lọ thuỷ tinh, nút cao su
nút nhôm Đức USP24
2.1.2 Phương tiện thực nghiệm
- Máy đo pH: MP 220, Mettler Toledo - Máy lọc màng SARTORIUS
- Máy đông khô LS L SECFROID
- Các dụng cụ thuỷ tinh dùng trong bào chế và phân tích - Tủ sấy
- Tủ ấm
- Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao Thermo Finigan vói hệ thống bơm cao áp bốn bơm P4000, hệ thống bơm mẫu tự động và ổn định nhiệt độ cột AS 3000, detector ƯV 6000 LP. Cột Hypersil silica, kích thước 150x4,6 (mm), kích thước hạt 5|im. Hệ thống điều hành với phần mềm Chromquest version.
> Xây dựng công thức và qui trình đông khô MP natri succinat. > Nghiên cứu độ ổn định của th u ố c tiêm đông khô MP natrisuccinat. > Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho chể phẩm.
2.1.4 Phương pháp thực nghiệm
a) Xây dựng công thức
* Bào chế thuốc tiêm đông khô MP natri succinat vói sự thay đổi các yếu tố trong công thức và các thông số kĩ thuật trong qui trình đông khô để tìm ra công thức tối ưu.
Các yếu tố thuộc về công thức thuốc bao gồm: • Dung môi
• Tá dược độn • Hệ đệm
• pH của dung dịch trước khi đông khô • Bao bì
Các thông số kĩ thuật trong quá trình đông khô bao gồm:
Qua tham khảo tài liệu kết hợp với quá trình nghiên cứu, chúng tôi pha thuốc tiêm đông khô có thành phần như sau để từng bước thăm dò ảnh hưởng của các yếu tố trên
Methylprednisolon natri succinat 53,05 mg
Các tá dược khác vừa đủ * Qui trình pha chế thuốc tiêm
- Trước khi pha chế, phải tiến hành xử lí bao bì gồm: lọ thuỷ tinh, nút cao su, nút nhôm theo các bước trong sơ đồ sau:
• Thời gian đông khô • Thời gian sấy khô
(tương ứng methylprednisolon) Acol benzylic
40 mg 10 mg
Lọ thuỷ tình Nút cao su Nút nhôm
Chọn lựa Rửa nước thường Rửa nước thường
i ị ị
Rửa nước thường Rửa nước xà phòng Rửa nước xà phòng
ị i ị
Rửa nước xà phòng Rửa nước thường Rửa nước thường
i ị ị
Rửa nước thường Luộc sôi với dd Na2C 03 Rửa nước cất 1 lần
ị l°/oo trong lh ị
Rửa nước cất 1 lần ị Sấy khô 110°C/3 giờ
ị Rửa nước thường
Rửa nước cất 2 lần đã ị
lọc Rửa nước cất 1 lần
qua màng 0,45 |J, m ị
ị Rửa nước cất 2 lần
Tiệt khuẩn bằng nhiệt ị
160° C/3 giờ Tiệt khuẩn 121°C/30’ ị
Tráng Silicon
ị
Sấy khô 110°C/3 giờ
s ơ ĐÔ XỬ LÍ LỌ, NÚT CAO sư , NÚT NHÔM
- Pha chế
Thuốc tiêm được pha chế theo các bước dưới đây được áp dụng cho tất cả các cóng thức nghiên cứu:
Điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH IN. Với những công thức dùng hỗn hợp dung môi, các tá dược tan trong dung môi nào thì hoà tan trong dung môi đó, sau đó phối hợp và hoà tan dược chất.
Mô tả:
- Pha chế dung dịch thuốc với đầy đủ các thành phần theo công thức đã xây dựng, tiệt khuẩn dung dịch này bằng cách lọc qua màng lọc loại khuẩn
0,22|Lim.
- Đóng chính xác từng thể tích dung dịch vừa tiệt khuẩn vào các lọ sạch đã xử lí (mỗi lọ 1 ml), đậy hờ bằng nút cao su có xẻ rãnh ở phần dưới của nút (đường bay hơi của dung môi) và chuyển vào buồng đông lạnh của thiết bị đông khô để dung dịch đóng băng ở -40°c trong 2 giờ.
- Khi sản phẩm đã đông rắn hoàn toàn, tiến hành hút chân không để giảm áp suất hoi của buồng đông khô xuống dưới áp suất hơi của nước đá và cung cấp nhiệt cho giá để tạo năng lượng cần thiết cho sự thăng hoa. Dưới những điều kiện này nước sẽ bay hoi trực tiếp từ trạng thái rắn tạo ra sản phẩm khô, xốp. Khi đó phần lớn dung môi được loại đi và hình thành một bánh.
- Tiếp theo cung cấp một nhiệt lượng từ bên ngoài để làm khô bánh một cách kĩ lưỡng. Nhiệt độ sấy: đặt chế độ nhiệt: 4 X 10°c
- Khi sản phẩm đã khô hoàn toàn, các lọ được đóng kín tại chỗ ngay trong
b u ồ n g đ ô n g k h ô , b ộ phận n én th u ỷ lự c sẽ đ ẩy c á c nút c a o su v à o đ ú n g vị trí.
- Cuối cùng lấy sản phẩm ra khỏi buồng đông khô và tiếp tục đóng nắp nhôm, hoàn thiện sản phẩm.
* Đánh giá chất lượng của chế phẩm dựa vào các chỉ tiêu về: cảm quan (hình thức, độ trong), hàm lượng MP so với ban đầu, mất khối lượng do sấy khô.
* Phương pháp định lượng MP natrisuccinat trong chế phẩm thuốc tiêm Để xác định hàm lượng MP natrisuccinat còn lại trong các mẫu thuốc tiêm sau thời gian bảo quản chúng tôi sử dụng phương pháp định lượng bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao.
Do không có chất chuẩn nội, phương pháp được đề xuất tiến hành như sau:
Chuẩn bị: pha động và hệ sắc kí
Pha động: Hỗn hợp gồm: clorobutan bão hoà nước, clorobutan, Ị
tetrahydrofuran, methanol, acid acetic băng (95:95:14:7:6)
Dung mồi pha mẫu: Dung dịch acid acetic băng trong cloroform(3:100)
Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 50mg MP natri succinat chuẩn hoà tan bằng 1 ml nước cất pha tiêm đã lọc. Lấy chính xác 0,5 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 50 ml có nút mài, thêm dung môi pha mẫu đến vạch. Lắc kĩ trong 5 phút. Để yên cho tách pha, gạn bỏ lớp phía trên.
Dung dịch thử: Hoà tan 1 lọ chế phẩm bằng 1 ml nước cất pha tiêm đã lọc. Lấy chính xác 0,5 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 50 ml có nút mài, thêm dung môi pha mẫu tói vạch. Lắc kĩ trong 5 phút. Để yên cho tách pha, gạn bỏ lớp phía trên.
Điều kiện:
- Detector u v , bước sóng 254 nm.
- Cột Hypersil silica, kích thước cột 150 x4,6 mm, kích thước hạt 5 Ịim. - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.
Kết quả: Tính hàm lượng MP natrisuccinat bằng cách so sánh diện tích pic của mẫu thử và mẫu chuẩn, theo CT: % Mẫu thử = (Ct X V)/m xl00%, trong đó Ct=(At X Cc)/Ac với At, Ac lần lượt là diện tích pic của mẫu thử và mẫu chuẩn, Ct và Cc (mg/ml) lần lượt là nồng độ của mẫu thử và mẫu chuẩn;
v = 1 0 ó m l , m (m g ) là lư ợng d ư ợ c c h ấ t tro n g 1 đơn vị c h ế p h ẩm tính th e o lí
thuyết.
* Phương pháp xác định mất khối lượng do sấy khô
Sấy chế phẩm liên tục ở 105°c trong 3 giờ, xác định % khối lượng bị mất do sấy khô bằng cách so sánh khối lượng mẫu trước và sau khi sấy. Cụ thể tiến hành như sau:
- Cân chính xác lọ (đã tháo nắp) + bánh thuốc ngay trong lọ được khối lượng m,
- Sấy trong tủ sấy ở 105° c trong 3 giờ ở áp suất thường.
- Để n g u ộ i đến n h iệt đ ộ p h ò n g tro n g bình hút ẩm c ó silica g e l, c â n n g a y đ ư ợ c
khối lượng m2
- Tính kết quả % mất khối lượng do sấy khô: (ri^-ra^xioo - Phép thử tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình
b) Phương pháp đánh giá độ ổn định của thuốc tiêm đông khô MP natĩisuccinat
> Lão hoá cấp tốc
Thử nghiệm bằng cách bảo quản thuốc tiêm trong tủ ấm ở điều kiện nhiệt độ 40°c, độ ẩm tương đối 75% để tăng nhanh tốc độ phân huỷ, rút ngắn thời gian theo dõi đánh giá.
> Để ở điều kiện bình thường
Các mẫu thuốc tiêm được bảo quản trong phòng thí nghiệm, nhiệt độ: 15- 35°c độ ẩm 65-95%. Sau những khoảng thời gian nhất định kiểm tra các chỉ tiêu chất lượng của chế phẩm để ở điều kiện bình thường và lão hoá cấp tốc.
> Đánh giá
Đánh giá độ ổn định của các công thức dựa trên các chỉ tiêu sau
- Cẩm quan: Quan sát và so sánh hình thức, độ trong của dung dịch pha lại - Hàm lượng MP natrisuccinat
- Tạp chất phân huỷ: Xác định bằng sắc kí lớp mỏng [33] Điều kiện tiến hành:
. Pha tĩnh: bản mỏng Silicagel F254 tráng sẵn.
. Pha động: Hỗn hợp dung môi acid formic khan, ethanol và methylenclorid (0,1:1:15).
. Dung dịch chấm sắc kí: nồng độ lmg/lml, pha loãng bằng hỗn hợp methanol và methylenclorid (1:9).
. Lượng chấm: 10 ỊLil dung dịch thử và dung dịch chuẩn. . Quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm.
c) Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho thuốc tiêm
Dự thảo các tiêu chuẩn về lí học (tính chất cảm quan, độ trong, mất khối lượng do sấy khô), hoá học (pH, định tính, định lượng), vi sinh (nội độc tố, độ vô khuẩn) cho chế phẩm. Trong phạm vi thực nghiệm chỉ tiến hành các phương pháp thử về một số tiêu chuẩn lí học và hoá học của công thức.
Yêu cầu kĩ thuật và phương pháp thử
. Tính chất cảm quan: Bột đông khô được đóng trong lọ thuỷ tinh đậy kín bằng nút cao su và chụp nắp nhôm bên ngoài nút cao su. Bột thuốc màu trắng kết thành bánh.
Bằng cảm quan chế phẩm phải đạt được các yêu cầu đã nêu trên.
. Mất khối lượng do sấy khô: Khống được lớn hơi^2%)(kl/kl). Xác định theo phương pháp phần a mục 2.1.4.
. Độ trong : Mục tiêu: xác định các tạp chất cơ học nhìn thấy được. Hoà tan lượng thuốc trong lọ với 1 ml nước cất pha tiêm. Xoay tròn nhẹ nhàng lọ thuốc tiêm sao cho không tạo thành bọt khí trong dung dịch. Quan sát qua dụng cụ soi tiểu phân.
Đánh giá kết quả: Các thuốc tiêm có thể tích nhỏ hơn hoặc bằng 5 ml: soi 20
ố n g k h ô n g đ ư ợ c c ó q u á 2 ố n g c ó n h iều n h ất m ộ t v ật th ể. [1 ]
. pH: Dung dịch có chứa khoảng 50 mg MP natrisucciat trong 1 ml nước cất pha tiêm có pH trong khoảng 7,0-8,0.
Lấy chế phẩm pha với nước cất pha tiêm để được dung dịch có chứa khoảng 50 mg MP natrisuccinat. Tiến hành đo pH trên máy đo pH.[l]
. Định lượng: Theo HPLC như phần a mục 2.1.4.
2.2 Kết quả thực nghiệm và nhận xét
2.2.1 Nghiên cứu định lượng methylprednisolon trong chế phẩm bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao
Qua tham khảo tài liệu kết hợp với quá trình nghiên cứu tách MP natri succinat bằng HPLC với các điều kịên thiết bị như đã nêu ở mục 2.1.2. Chúng tôi đã lựa chọn pha động gồm clorobutan bão hoà nước, clorobutan, tetrahydrofuran, methanol và acid acetic băng (95:95:14:7:6), detector uv,
bước sóng 254 nm. Tốc độ dòng lml/phút. Kết quả sắc kí lỏng được ghi trong sắc đồ như hình 6 __ U nh-254nm Ratanbon Time Name * 1* 2 9 3 í 5.805 CT10/lần2 Chuẩn
Hình 6: sắc kí đồ của dung dịch chuẩn và bột đông khô pha theo C T 10 lần 2
Nhận xét: Pic dược chất trong hình 6 tách tốt, pic gọn (hẹp và tương đối cân), thời gian lưu của pic dược chất giữa mẫu chuẩn và mẫu thử gần tương đương.
. Đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa nồng độ MP natri succinat và diện tích pic
Tiến hành pha dung dịch MP natri succinat trong hỗn hợp dung môi với các nồng độ khác nhau và định lượng bằng HPLC như điều kiện đã chọn. Kết quả thu được ghi ở bảng 4 và biểu thị bằng đồ thị hình 7
Bảng 4: Tương quan giữa nồng độ MP natri succinat và diện tích pic Nồng độ
(mg/ml) 0.08 0.2 0.28 0.4 0.6
ệ A -
3- 4 ỡ^~x ) r ^
//in/? 7; Đổ' thị khảo sát sự phụ thuộc giữa nồng độ methylprednisolon natrỉ succỉnat và đáp ứng diện tích pic.
Nhận xét: Kết quả ở bảng 5 và đồ thị hình 7 cho thấy có sự phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ MP natri succinat trong khoảng đã khảo sát từ 0.08 mg/ml đến 0.6 mg/ml, vói hệ số tương quan r xấp xỉ bằng 1. Như vậy có thể sử dụng phương pháp HPLC với các điều kiện đã nêu để định lượng MP còn lại trong các mẫu thuốc tiêm đông khô.
2.2.2 Xây dựng công thức thuốc tiêm
a ) Ảnh hưởns của các yếu tố thuôc vê côns thức
> Ảnh hưởng của dung môi
Tiến hành pha chế dung dịch theo các CT 2, 3, 5, 6 với các tá dược khác nhau và đông khô theo các thông số ghi trong mục 2.1.4. Lượng MP natri succinat trong tất cả các CT là 53,05 mg tương ứng với 40 mg MP.
Bảng 5 - Tá dược sử dụng cho thuốc tiêm đông khô MP (CT2-> CT6)
CT Muối
Na2HP04.12H20 (mg)
Tá dược độn manitol (mg)
Dung môi vừa đủ lml
2 60 25 tert- butanol và nước(20:80)
3 60 25 nước cất
5 100 25 nước cất
6 100 25 tert-butanol và nước(20:80)
Sau đó đánh giá cảm quan, độ trong của bột đông khô. Kết quả ghi
trong bảng 6
Bảng 6 - Kết quả đánh giá bằng cảm quan về độ tan và độ trong của dung dịch pha lại từ bột đông khô các CTvới 1 mỉ nước cất pha tiêm
Dung môi CT Độ tan và độ trong
Nước 3,5 Tan, trong
Tert-butanol và nước 2 ,6 Tan, không trong
Thử nghiệm cho thấy bột pha theo CT 5 tan tốt hơn pha theo CT 6. Dựa vào kết quả khảo sát, chúng tôi chỉ sử dụng nước cất pha tiêm làm dung môi cho các công thức tiếp theo.
> Ảnh hưởng của hệ đệm
Để đánh giá ảnh hưởng của hệ đệm tới các chế phẩm đông khô, trước hết chúng tôi tiến hành pha chế các dung dịch theo CT 1, CT 4 và đông khô với các thông số ở mục 2.1.4. Sau đó, đánh giá độ tan của bột đông khô, pH của dung dịch pha lại với 1 ml nước cất pha tiêm của chế phẩm pha theo các công thức chỉ dùng natri dihydrophosphat với tỉ lệ khác nhau. Kết quả ghi trong bảng 7
Bảng 7- Đánh giá cảm quan và pH của dung dịch pha theo CT từ 1-6 sau đông khô CT Na2HP04.12H20 (mg) Độ tan pH dd trước đông khô pH dd hoà tan lại ApH 1 44,02 - 8,22 8,65 0,43 2 60 + 8,28 8,67 0,39 4 90 + 8,30 8,61 0,31 5 100 + 8,31 8,69 0,38 6 100 + 8,33 8,63 0,30 Nhân xét:
thêm dung dịch dinatri hydrophosphat, bột tan hết, dung dịch trong. Tăng tỉ lệ dinatri hydrophosphat trong các CT từ 2- 6, thấy bột đông khô tan tốt. Sau thời gian bảo quản, giá trị pH chênh lệch của dung dịch pha lại và dung dịch trước đông khô ÀpH: 0,31- 0,43.
Tiếp theo, tiến hành pha chế các dung dịch theo CT 7-> CT 12 để đông khô, dùng hệ đệm natri dihydrophosphat và dinatri hydrophosphat (trừ CT 12), tá dược độn, nút cao su đã xử lí, dung môi nước vừa đủ 1 ml, pH của dung dịch trước đông khô > 8.
1 LHp
N». * Bảng 8 - Tá dược sử dụng cho thuốc tiêm đông khô từ CT 7-> CT12
CT Hệ đệm Tá dược độn Nút cao su tráng Silicon 7 Na2HP04^ 2 f ì 20(44mg) NaH2POU2H2O(4,0mg) lactose(25mg) - 8 lầnl 8 lần2 Na2HPoVtmO<44mg)
NaH2PO4.^ H 2O(4,0mg) lactose(25mg)
+ với 8 lầnl - với 8 lần2 9 Na2HP04.1 W )(58,3m g )
NaH2P04.12H20(5,3mg) lactose(25mg) + 10 lầnl Na2HPQK12H20(4Ímg)
NaH2m .l2 H 2O(4,0mg) lactose(25mg) + 10 lần2 Na2HPƠ*4 2 H20£44iíĩg) NaH2P04.12H2O(4,0mg) lactose(25mg) + 11 Na2HP04.12H20(58,3mg) NaH2P04(l2H20(5,3ipg) lactose(25mg) PVP(lOmg) + 12 Na2HP04.lÌH 20(10Ồmg) HP-P Cy D (25mg) - - : không + : có
Sau đó đánh giá độ tan, pH của dung dịch pha lại, giá trị pH chênh lệch giữa dung dịch trước đông khô và dung dịch sau đông khô. Kết quả được ghi trong bảng 9.
Bảng 9-Đánh giá độ tan, pH của dung dịch pha theo CT 7—> 12 sau đông khô
CT Độ tan pH dd trước đông khô pH dd pha lại ApH 7 tan 8,1 8,26 0,16 81ần2 tan 8,05 8,32 0,27 8 lầnl tan 8,05 8,25 0,20 9 tan 8,02 8,29 0,27 10 lần 1 tan 8,07 8,30 0,23 10 lần 2 tan 8,08 8,31 0,23 11 tan 8,08 8,27 0,19 hân xét:
Với các chế phẩm đông khô dùng hệ đệm natri dihydrophosphat và