4. Ý nghĩa của đề tài
2.2.4.Điều kiện nuôi cấy in vitro
Thời gian chiếu sáng: 16 giờ sáng/ 8 giờ tối Nhiệt độ: 25 ± 2o C
Độ ẩm: 50 – 60 %
ƣờng độ ánh sáng: 2000 lux.
2.3. Phƣơng ph p nghiên cứu
2.3.1. Bố tr th nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thức đƣợc nhắc lại 3 lần, 50 mẫu/công thức.
2.3.2. Nội dung nghiên cứu
2.3.2.1. Thí nghiệm 1: T o vật liệu in vitro t chồi cây hoa D yên thảo.
Chồi cây hoa Dã yên thảo đƣợc cắt dài khoảng 3 - 4 cm, cắt bỏ lá non, xử lý sơ bộ bằng cách: Rửa sạch nhiều lần dƣới vòi nƣớc máy, sau đó rửa trong dung dịch nƣớc xà phòng và đƣợc rửa lại bằng nƣớc cất 2-3 lần, đƣa mẫu vào trong tủ cấy vô trùng.
Trong tủ cấy vô trùng:
- Rửa chồi bằng nƣớc cất vô trùng. - Lắc etanol 70% (v/v) trong 2 phút.
- Lắc mẫu bằng hóa chất khử trùng với nồng độ và thời gian theo thí nghiệm.
- Rửa lại 3 - 5 lần bằng nƣớc cất vô trùng.
Chồi cây hoa Dã yên thảo đã khử trùng sơ bộ đƣợc sử dụng làm nguyên liệu cho thí nghiệm này theo các công thức bảng 2.1.
ảng 2.1. C c công thức thí nghiệm x c định hiệu quả của chất khử trùng
Công thức Chất xử lý/thời gian
ĐC Xử lý sơ bộ T1 Xử lý sơ bộ + Javen 5% (v/v)/5 phút T2 Xử lý sơ bộ + Javen 5% (v/v)/10 phút T3 Xử lý sơ bộ + Javen 5% (v/v)/12 phút T4 Xử lý sơ bộ + Javen 5% (v/v)/15 phút T5 Xử lý sơ bộ + Javen 10% (v/v)/3 phút T6 Xử lý sơ bộ + Javen 10% (v/v)/5 phút T7 Xử lý sơ bộ + Javen 10% (v/v)/7 phút
Mẫu cấy sau khi đƣợc khử trùng trong tủ cấy sẽ đƣợc cắt bỏ bề mặt tiếp xúc với chất khử trùng, vì các tế bào ở bề mặt tiếp xúc dƣới tác dụng của chất khử trùng mạnh dễ bị chết. Để đảm bảo cho chồi có thể hấp thụ chất dinh dƣỡng t môi trƣờng thì thao tác này rất quan trọng. Sau khi cắt tiến hành thấm khô mẫu, cấy vào bình tam giác có chứa môi trƣờng MS cơ bản. Đặt mẫu lên giàn nuôi cấy theo dõi t lệ mẫu nhiễm, t lệ mẫu sạch, t lệ mẫu sống sau 7 ngày nuôi cấy.
Chỉ tiêu theo dõi:
- T lệ mẫu nhiễm (%): (Tổng số mẫu nhiễm / Tổng số mẫu cấy vào)x100
- T lệ mẫu sống (%): (Tổng số mẫu sống / Tổng số mẫu cấy vào)x100 - T lệ mẫu chết (%): (Tổng số mẫu chết / Tổng số mẫu cấy vào)x100
2.3.2.2. Thí nghiệm 2: Nhân nhanh cây Dã yên thảo bằng phương pháp tạo m chồi in vitro.
Trong thí nghiêm này chúng tôi sử dụng BAP và Kinetin là 2 chất điều hoà sinh trƣởng thực vật thuộc nhóm ytokinin để tìm hiểu ảnh hƣởng của chúng đến khả năng tạo cụm chồi in vitro cây hoa Dã yên thảo.
Chúng tôi bổ sung P với nồng độ thay đổi t 0 – 1 mg/l và kinetin nồng độ 0,3mg/l, 0,5mg/l vào môi trƣờng MS để tiến hành thí nghiệm. ác mẫu sạch ở thì nghiệm 1 đƣợc chuyển sang môi trƣờng có bổ sung P và Kinetin và theo dõi theo t ng tuần.
a) Thí nghiệm 2a: Quan sát sự phát sinh hình thái trong quá trình tạo mô sẹo ã yên thảo in vitro.
b) Thí nghiệm 2b: nh hƣởng của P và Kinetin đến khả năng tạo cụm chồi cây ã yên thảo
ảng 2.2. Ảnh hƣởng của AP và inetin đến khả năng t o cụm chồi cây Dã yên thảo Công thức Thành phần môi trƣờng CT1 MS Đối chứng) CT2 MS + 0,5 mg/l BAP CT3 MS + 0,7 mg/l BAP CT4 MS + 1,0 mg/l BAP CT5 MS + 0,3 mg/l Kinetin CT6 MS + 0,5 mg/l Kinetin
Chỉ tiêu theo dõi: Hệ số nhân chồi = ∑ chồi tạo thành / ∑ chồi đƣa vào
Các chồi phát sinh sau khi thực hiện thí nghiệm 2 có kích thƣớc 2 – 3 cm đƣợc đƣa vào các môi trƣờng có bổ sung -NAA hoặc có bổ sung nƣớc d a với nồng độ khác nhau, nhằm xác định nồng độ -NAA và nƣớc d a thích hợp cho quá trình tạo rễ và tạo cây con khỏe mạnh. Nồng độ -N thay đổi t 0,1 – 0,5mg/l, nồng độ nƣớc d a thay đổi t 5% - 15%, các chồi sau khi cấy vào đƣợc theo dõi theo t ng tuần.
ảng 2.3. Ảnh hƣởng của α-NAA và nƣớc d a đến t o rễ cây D yên thảo in vitro Công thức Thành phần môi trƣờng CT1 MS Đối chứng) CT2 MS + 0,1 mg/l NAA CT3 MS + 0,3 mg/l NAA CT4 MS + 0,5 mg/l NAA CT5 MS + 5% nƣớc d a CT6 MS + 10% nƣớc d a CT7 MS + 15% nƣớc d a
Chỉ tiêu theo dõi: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Công thức nào tạo rễ (+) và công thức nào không tạo rễ (-) sau 4 tuần nuôi cấy.
- hiều dài trung bình rễ cm), số rễ/chồi sau 4 tuần nuôi cấy.
2.3.2.4. h nghiệm 4 n u ện cây Dã yên thảo in vitro ngo i m i trường t nhiên
Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng cây in vitro đã hoàn chỉnh có đủ
rễ, thân, lá để làm thí nghiệm.
Để cho cây ra ngoài tự nhiên cần có túi bầu, giá thể thích hợp, cây ở ống nghiệm lấy ra nhẹ nhàng tránh làm gãy, rửa sạch thạch còn bám ở rễ cây không rũ tránh làm đứt rễ. Vì hệ rễ của cây còn yếu và chƣa thích nghi với
việc hút nƣớc, muối khoáng t đất lên khi cho cây ra ngoài chúng tôi sử dụng giá thể xốp nhƣ bảng 2.4.
ảng 2.4. Ảnh hƣởng của gi thể tới t lệ sống của D yên thảo
Giá thể Số cây cấy
át ẩm 20
Đất thịt + cát + mùn cƣa 20
Tro trấu + sơ d a +đất thịt +cát 20
hỉ tiêu theo dõi là số cây chết và số cây sống sau 4 tuần. T lệ sống của cây = ( ∑ cây sống / ∑ cây cấy ) x 100
2.3.2. Phương pháp phân t ch số liệu
Số liệu thu thập đƣợc xử lý thống kê bằng chƣơng trình Excel 2007 theo mô tả của Nguyễn Văn Mã và ctv, 2013 [5].
CHƢƠNG 3: T QUẢ VÀ THẢO LU N 3.1. T o vật liệu khởi đầu in vitro t chồi cây hoa D yên thảo
Môi trƣờng nuôi cấy mô thực vật trong đó có môi trƣờng MS) là môi trƣờng thích hợp cho nấm mốc và vi khuẩn phát triển. Khi môi trƣờng bị nhiễm mốc thì cây in vitro sẽ không sạch bệnh, cây giống ra ngoài môi trƣờng sau này cũng không bằng cây ngoài tự nhiên, nhƣ vậy thì nuôi cấy mô sẽ vô nghĩa. òn khi môi trƣờng bị nhiễm khuẩn thì cây in vitro sẽ bị thối và chết,
chính vì vậy mà thí nghiệm nuôi cấy mô đòi hỏi mức độ vô trùng là tuyệt đối. Thí nghiệm 1 này có vai trò quyết định trong nuôi cấy mô tế bào, nếu thí nghiệm không thành công thì sẽ không có mẫu vô trùng để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
Mục đích của thí nghiệm 1 là tìm ra công thức khử trùng tối ƣu, v a vô trùng mà mẫu vẫn sống và sinh trƣởng tốt. ông thức khử trùng này phụ thuộc vào nồng độ các chất khử trùng, thời gian khử trùng, thao tác của ngƣời làm… Nếu nồng độ các chất khử trùng và thời gian khử trùng quá cao hoặc quá thấp thì khử trùng đều không cho kết quả tốt, bên cạnh đó thao tác của ngƣời làm cũng rất quan trọng. Trong khi thực hiện các thao tác ngƣời làm cần chú ý hạn chế cho tay ra khỏi buồng vô trùng, thƣờng xyên khử trùng tay bằng cách xịt cồn, khử trùng dụng cụ bằng cách đốt cồn. Kết quả cần đạt đƣợc trong thí nghiệm này là tạo đƣợc vật liệu khởi đầu mẫu đã vô trùng và sống tốt) để làm nguyên liệu phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
Xử lý sơ bộ đóng vai trò quan trọng tới sự thành công của quá trình tạo vật liệu in vitro. Trong giai đoạn này, chúng tôi sử dụng etanol 70% để khử trùng sơ bộ, vì etanol là chất lỏng, có sức căng bề mặt thấp, tạo điều kiện cho các chất khử trùng khác có thể xâm nhập tốt hơn.
hồi ã yên thảo sau khi xử lý sơ bộ đƣợc sử dụng làm nguyên liệu cho các công thức khử trùng nhƣ bảng 2.1. Kết quả sau khi đánh giá đƣợc thể hiện trong bảng 3.1 và hình 3.1 nhƣ sau:
ảng 3.1. Hiệu quả chất khử trùng đối với chồi cây hoa D yên thảo
Công thức T lệ mẫu nhiễm (%) T lệ mẫu chết (%) Hiệu quả khử trùng (%) ĐC 100 0 0 T1 100 0 0 T2 46 24 30 T3 40 14 46 T4 18 28 54 T5 52 6 42 T6 10 32 58 T7 4 96 0
H nh 3.1 Hiệu quả chất khử trùng trên mẫu đỉnh sinh trƣởng cây D yên thảo
Kết quả cho thấy, mẫu khử trùng ở các công thức Đ và CT1 (Javen 5%/5 phút) không cho hiệu quả khử trùng, mẫu khử trùng bị nhiễm khuẩn và mốc sau vài ngày nuôi cấy. Còn CT7 (Javen 10%/7 phút) cũng không cho hiệu quả khử trùng vì thời gian khử trùng và nồng độ Javen cao làm chết các tế bào thực vật. Các công thức còn lại cho hiệu quả khử trùng vẫn ở mức thấp, trong đó hiệu quả cao nhất là CT6 (Javen 10%/5 phút) đây đƣợc coi là công thức tối ƣu vì nồng độ và thời gian khử trùng phù hợp với cây. Các công thức: CT2(Javen 5%/10 phút), T3 Javen5%/12 phút) Javen cũng cho thấy hiệu quả khử trùng nhƣng hiệu quả chƣa cao. Vì nồng độ Javen thấp khả năng diệt nấm mốc và khuẩn thấp lên t lệ mẫu nhiễm vẫn ở mức cao. Còn CT4(Javen 5%/15 phút) tuy nồng độ Javen thấp nhƣng vì thời gian khử trùng cao lên số mẫu chết vẫn nhiều, CT5 (Javen10%/3 phút) tuy nồng độ Javen cao nhƣng vì thời gian khử trùng ngắn lên số mẫu nhiễm vẫn cao, hiệu quả khử trùng vẫn thấp.
Hình 3.2. Chồi cây hoa D yên thảo. (Tr i mẫu in vitro vô trùng sau 5 ngày nuôi cấy, (Phải mẫu in vitro bị nhiễm sau 5 ngày nuôi cấy
Sơ đồ quy trình đơn giản tạo vật liệu in vitro t đỉnh sinh trƣởng của cây Dã yên thảo ở hình 3.3. ƣớc 1. ã yên thảo ngoài tự nhiên ƣớc 2. Đỉnh sinh trƣởng sử dụng làm thí nghiệm
ƣớc 3. Rửa mẫu với xà phòng dƣới vòi nƣớc máy
ƣớc 4. Khử trùng mẫu ƣớc 5. Thấm khô, cắt mẫu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ƣớc 6. Mẫu sau khử trùng đƣợc cấy vào môi trƣờng
Hình 3.3. C c bƣớc đơn giản t o vật liệu in vitro t đỉnh sinh trƣởng của cây D yên thảo
3.2. Nhân nhanh cây D yên thảo bằng phƣơng ph p t o cụm chồi in vitro
Mục đích của thí nghiệm nhân nhanh cây ã yên thảo là tạo ra lƣợng lớn chồi in vitro t một chồi ban đầu, lƣợng chồi tạo ra trong thí nghiệm này đƣợc dùng làm nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo. Trong đó quan trọng nhất là thí nghiệm rèn luyện cây in vitro để tạo cây giống đây cũng là mục
đích quan trọng của đề tài nghiên cứu. Trong thí nghiệm này đối với các loài cây khác nhau thì hệ số nhân giống khác nhau ví dụ đối với cây úc thì hệ số chồi đạt đƣợc trong khoảng 5 – 20 chồi). Hầu hết các loài t một chồi cấy vào môi trƣờng bổ sung chất kích thích sinh trƣởng sẽ bật ra nhiều chồi, nhƣng với cây ã yên thảo t một chồi cấy vào sẽ tạo mô sẹo. Mô sẹo sau này mới phát triển thành các chồi, chính vì vậy trong thí nghiệm nhân nhanh ã yên thảo chúng tôi làm thêm thí nghiệm quan sát sự phát sinh hình thái ở giai đoạn mô sẹo.
3.2.1. Quan sát sự phát sinh hình thái trong quá trình tạo mô sẹo Dã yên thảo in vitro thảo in vitro
Ở cây hai lá mầm: Sự phát triển phôi theo nghĩa hẹp, bắt đầu với hợp tử và kết thúc ở giai đoạn lá mầm. Sự phát triển thông qua các giai đoạn hình cầu, hình tim, hình ngƣ lôi hình cá đuối) và giai đoạn lá mầm có thể phân chia thành các bƣớc có trình tự khác nhau, đƣợc đại diện ở 3 sự kiện chủ yếu: - Sự phân chia không đối xứng của hợp tử, dẫn đến làm cho các tế bào ở đỉnh thì nhỏ, các tế bào cơ bản thì lớn.
- Sự hình thành khuôn mẫu một cách rõ ràng, xảy ra ở giai đoạn hình cầu. - Sự chuyển biến của giai đoạn lá mầm xảy ra đồng thời với sự bắt đầu của mầm rễ, mầm lá thông qua mầm của thân [19].
Diễn biến các pha:
Giai đoạn hình cầu duy trì trong một thời gian, sự phân chia của những tế bào bên trong dẫn đến sự hình thành trục phôi và sự biệt hóa vùng. ở giai
đoạn phôi hình cầu, khi số lƣợng tế bào tăng lên hơn 100 thì phôi chuyển sang hình tim bởi vì sự phát triển định vị tại hai điểm đối diện nhau trong vùng đỉnh.
Đầu giai đoạn phôi hình tim, có xấp xỉ 200 tế bào và là nguồn gốc chủ yếu của các cơ quan trong hạt nhƣ lá mầm, trụ dƣới lá mầm, rễ nguyên thủy, cũng nhƣ những loại mô cơ bản, tiền mạch, vỏ phân sinh ngọn và vỏ là thấy rõ về mặt cấu trúc. Kết thúc là giai đoạn hai lá mầm đã hình thành rõ rệt, sự biệt hóa các vùng, cơ quan [20].
Hình 3.4. Quá trình phát sinh phôi ở cây 2 lá mầm (Arabidopsis)[21]
Nguồn tham khảo hình 3.4:
https://www.google.com.vn/search?tbm=isch&q=angiosperm+embryo+devel opment
Quá trình tạo mô sẹo của cây ã yên thảo cũng xảy ra sự phát sinh phôi giống nhƣ phát sinh phôi hợp tử. ác chồi đƣợc cấy trong môi trƣờng bổ xung P tạo mô sẹo theo dõi theo t ng tuần bắt đầu t tuần 1. Thứ tự xuất hiện phôi trên mô sẹo bắt đầu t phôi cầu tiếp đến là phôi tim, cá đuối và cuối cùng là lá mầm. Ở môi trƣờng bổ sung P 1mg/l một số mẫu có hiện tƣợng mô sẹo phát triển không giới hạn tạo các cụm chồi vô định hình cho tới khi môi trƣờng hết chất dinh dƣỡng thì chết chứ không bật thành t ng chồi. òn ở các môi trƣờng khác thì mô sẹo vẫn phát triển và phát sinh thành chồi riêng
Phôi hình cầu Phôi hình tim
Phôi cá đuối Phôi 2 lá mầm
Hình 3.5. Quá trình phát sinh phôi soma của cây D yên thảo
3.2.2. Ảnh hưởng của BAP và inetin đến khả năng tạo cụm chồi cây Dã yên thảo
Thí nghiệm tiến hành trên môi trƣờng MS (Murashige & Skoog, 1962) có bổ sung BAP với nồng độ t 0 mg/l P đến 1,0 mg/l BAP kết quả thu đƣợc ở bảng sau:
ảng 3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ AP và inetin đến hệ số nhân chồi cây D yên thảo
Công thức Nồng độ BAP (mg/l)
Chồi/ bình Hệ số nhân chồi an đầu Sau 7 tuần
Đ 0,0 2 4 2,00 CT1 0,5 2 135 67,5 CT2 0,7 2 183 91,5 CT3 1,0 2 206 103 CT4 0,3 2 2 0 CT5 0,5 2 2 0
Hình 3.6 Ảnh hƣởng của nồng độ AP và inetin đến hệ số nhân nhanh t chồi cây hoa D yên thảo
Kết quả bảng 3.2 và hình 3.6 trên cho thấy: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mẫu cấy trong môi trƣờng MS không bổ sung P đối chứng) cho hệ số nhân thấp và mẫu có xu hƣớng phát triển thành cây hoàn chỉnh, trong khi môi trƣờng bổ sung P cho hiệu quả nhân nhanh rõ rệt. Trong đó nồng độ P tăng t 0,5mg/l tới 1,0 mg/l làm hệ số nhân chồi tăng bằng chứng là ở
cao hơn hẳn tới 103. Tuy nhiên ở các nồng độ bổ sung P chất lƣợng chồi không cao, chồi con còi, chậm cao. Ở thí nghiệm này chúng tôi còn thực hiện cấy mẫu vào môi trƣờng bổ sung chất kích thích sinh trƣởng Kinetin, nhƣng qua vài tuần quan sát cho thấy môi trƣờng này không cho hệ số nhân nhanh chồi mà chồi cấy vào còn có hiện tƣợng bị trắng lá và không sinh trƣởng.
Hình 3.7. Cụm chồi D yên thảo sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trƣờng có bổ sung AP
3.3. T o rễ cây D yên thảo in vitro (Ảnh hƣởng của α-NAA và nƣớc d a đến khả năng t o rễ
Rễ là bộ phận không thể thiếu của cây, rễ giúp cây hút nƣớc và muối khoáng, để cây in vitro có thể sinh trƣởng tốt ngoài môi trƣờng tự nhiên thì
cần hoàn thiện bộ rễ. hính vì vậy thí nghiệm này có mục đích tìm ra môi trƣờng thích hợp kích thích sự ra rễ của cây Dã yên thảo in vitro. Trong thí