6.1.Ảnh hưởng của muối:
Wang (1967) đã nghiên cứu khả năng tiết enzyme protease của hệ nấm M.
hiemalis khi nĩ được phát triển trên mơi trường đậu nành. Kết quả chỉ cĩ một phần nhỏ
enzyme này được vi sinh vật tiết ra vào trong dịch lọc mơi trường, cịn phần lớn protease đều nằm ở bề mặt của hệ sợi. pH tối thích cho enzyme protease là 3.0–3.5. Khi
25 Giá đậu Nước Đun sơi Lọc Nước đậu Đun sơi Hấp Ống mơi trường Cấy giống Nuơi mốc giống Ống giống Bã đậu+bột mì+nước Trộn đều
Phân phối vào hộp nhơm hoặc bình tam giác Hấp Cấy giống Nuơi Trộn Rây Bột mì rang chín Bã Bào tử giống cho sản xuất
hình thành các enzyme cố định trên hệ sợi, nếu thêm NaCl hay các muối ion hĩa vào mơi trường nuơi cấy, các muối này sẽ tách một số enzyme ra khỏi bề mặt hệ nấm. Khi nồng độ NaCl lên đến 0.3M, lượng protease được giải phĩng là cực đại. Các hợp chất khơng cĩ khả năng ion hĩa như urea, glucose, và sucrose sẽ khơng thích hợp cho quá trình tách rửa protease. Do đĩ, cĩ thể kết luận rằng các enzyme protease đã liên kết với bề mặt hệ nấm bằng các liên kết ion. Trong quá trình giải phĩng các enzyme này, sẽ khơng cĩ sự tham gia của các phản ứng hĩa sinh, bởi vì quá trình tách rửa này diễn ra nhanh chĩng ngay cả ở 0°C.
Vì vậy, nếu vi sinh vật được cấy trên một mơi trường khơng cĩ muối, sẽ chỉ cĩ một phần nhỏ protease cĩ mặt trong dịch lọc mơi trường cấy, cịn hầu hết các enzyme này sẽ nằm dính với hệ sợi. Khi nấm mốc phát triển trong mơi trường cĩ chứa muối, khơng những cĩ thể phục hồi được một lượng lớn hoạt tính của enzyme trong dịch lọc mà cịn làm tăng cao tổng hoạt tính của protease, vì quá trình tách liên tục protease khỏi bề mặt hệ nấm sẽ làm cho vi sinh vật cĩ thể tổng hợp được nhiều enzyme protease hơn.
Khi nghiên cứu, M. hiemalis được phát triển trên mơi trường cĩ nồng độ muối thấp, do đĩ các protease sẽ bám trên hệ sợi, từ đĩ ta cĩ thể nghiên cứu vị trí của các enzyme trước khi được tách ra, và cĩ thể hiểu được quá trình ngâm muối trong lên men chao.
Như vậy, chức năng của NaCl trong quá trình lên men chao gồm cĩ: - Ức chế sự phát triển của nấm mốc và các vi sinh vật gây hại. - Tạo vị mặn cho sản phẩm.
- Giải phĩng các protease cố định trên bề mặt hệ nấm. Trong quá trình lên men chao, nấm mốc được cố định trên bề mặt khối tàu hủ, nhưng hệ nấm khơng thể thâm nhập sâu vào khối này, mặt khác các enzyme của nấm mốc tiết ra khơng phải là enzyme ngoại bào; do đĩ mà chúng chỉ liên kết lỏng lẻo với hệ nấm bằng các liên kết ion. Vì vậy, các enzyme này dễ dàng bị tách rửa bởi NaCl hay các dung dịch muối ion khác, từ đĩ các protease này sẽ thấm vào đậu hủ đã lên mốc và tiến hành phân giải protein.
Một tổ chức kiểm tra vệ sinh và an tồn thực phẩm ở Trung Quốc khi kiểm tra các sản phẩm trên thị trường đều phát hiện các vết nhiễm độc do vi khuẩn. Tuy nhiên, hàm lượng của endotoxin trong sản phẩm rất thấp nên khơng gây nguy hiểm, nhưng điều đĩ lại cho thấy cĩ vấn đề trong khâu vệ sinh khi chế biến. Vì nồng độ muối cao nên vi sinh vật khơng phát triển được, nhưng endotoxin cĩ thể gây độc nếu nồng độ muối được giảm xuống.
6.2. Ảnh hưởng của sự thủy phân:
Mùi vị của chao ngày càng đậm đà trong quá trình ngâm muối và ủ. Lúc này, các enzyme do nấm mốc tiết ra sẽ phân hủy các chất nền, tạo ra các sản phẩm của quá trình thủy phân protein và lipid, là những thành phần chính gây nên mùi vị êm dịu và đặc trưng cho chao.
Protein của đậu nành sẽ được protease của nấm mốc thủy phân thành các peptid và acid amin. Điều này được chứng minh bằng sự cĩ mặt của các acid amin tự do như acid aspartic, acid glutamic, serine, alanine, và leucine / isoleucine trong dịch chiết.
Các lipid của đậu nành bị thủy phân thành một lượng lớn các acid béo. Khi bổ sung rượu vào dung dịch, sẽ tạo nên phản ứng hĩa học nhằm hình thành các ester, những hợp chất này tạo ra hương thơm dễ chịu cho sản phẩm. Ngồi ra, etanol cũng cĩ tác dụng ngăn ngừa sự phát triển của các vi khuẩn khơng mong muốn.
6.3. Ảnh hưởng của các phương pháp bảo quản:
Vấn đề thời hạn sử dụng của chao vẫn cịn nhiều điều phải giải quyết. Hiện tại người ta đang tìm một phương pháp bảo quản cho chao mà khơng dùng cồn, vì cồn sẽ tạo ra vị gắt cho sản phẩm. Một vấn đề khác là quá trình ngâm đậu, vì nĩ tạo ra vị quá mặn. Do đĩ mà các phương pháp bảo quản truyền thống bị hạn chế, làm giảm lượng tiêu thụ sản phẩm.
Để tránh các hiện tượng trên, Wai đã đề xuất phương pháp áo ngồi tồn bộ khối đậu lên mốc một lớp parafin (ở nhiệt độ 60°C). Khối đậu này đầu tiên được ngâm trong dung dịch NaCl 7%, sau đĩ được phủ một lớp parafin nĩng chảy. Khi parafin đơng đặc lại, sản phẩm được cho vào một thùng chứa bằng thủy tinh, để ở nhiệt độ phịng trong một tháng, lúc đĩ lớp parafin sẽ nứt ra, phần sản phẩm bên trong sau khi kiểm tra cảm quan cho thấy kết quả đạt yêu cầu về chất lượng.
6.4. Ảnh hưởng của các peptid:
Theo một nghiên cứu của một số trường Đại học ở Trung Quốc và các trung tâm nghiên cứu ở Nhật về hoạt tính của các enzyme chống Oxy hĩa và tăng huyết áp của hai sản phẩm sufu (Bắc Kinh, Trung Quốc) và tofuyo (Okinawa, Nhật) – là một sản phẩm tương tự như chao; kết quả cho thấy các enzyme chống Oxy hĩa và tăng huyết áp trong chao cĩ hoạt tính khá cao. Người ta cho rằng điều này là do trong chao chứa nhiều peptid cĩ khối lượng phân tử khoảng 10 kDa.
Các nhà khoa học cho rằng một số hợp chất cĩ hoạt tính sinh lý khi được tạo thành, hoạt tính của nĩ sẽ được giữ trong quá trình lên men. Yasuda và các cộng sự đã thí nghiệm, ghi nhận lại những thay đổi hĩa học trong sản phẩm tofuyo, được lên men từ giống nấm Monacus. Theo báo cáo, trong sản phẩm, protein là thành phần thay đổi rõ rệt nhất. Ở đầu giai đoạn lên men, hàm lượng các loại protein chính trong đậu nành cĩ mặt khá nhiều, nhưng chỉ sau 3 tháng, các protein này đều biến mất ngoại trừ các tiểu phân cơ bản của glycinin. Từ đĩ, họ kết luận rằng thành phần của tofuyo chính là các tiểu phân này và các peptid cĩ khối lượng phân tử 11–15 kDa.
Hiện nay, đã cĩ nhiều nghiên cứu cho thấy nhiều loại peptid cĩ hoạt tính chống Oxy hĩa. Các nhà khoa học đã phân tích cấu trúc của một số peptid chống Oxy hĩa từ enzyme β–conglycinin trong đậu nành, và xác định được 5 loại oligopeptid (chứa 6–16 acid amin). Khi phân tích từ các enzyme chống tăng huyết áp β–conglycinin và glycinin, họ xác định được trong đĩ chứa các 4 loại peptid cĩ 6–7 acid amin.
Từ kết quả này, các nhà khoa học đang nghiên cứu tiếp về cấu trúc của các peptid này, và mối liên quan giữa các peptid với hoạt tính của 2 enzyme trên, nhưng trong tương lai sẽ phát triển theo hướng ứng dụng chao trở thành một loại thực phẩm chức năng.