Trong sắc ký có ba thành phần tương tác với nhau: Pha động, pha tĩnh, chất phân tích. Để có thể tách bằng sắc ký phân bố thành công cần lựa chọn điều kiện sắc ký để cân bằng lực tương tác giữa ba thành phần này.
Tùy vào độ phân cực của pha tĩnh và pha động chia sắc ký thành hai loại:
Sắc ký pha thuận: Pha tĩnh phân cực, pha động ít phân cực, chất phân tích là các chất ít phân cực hoặc không phân cực.
Sắc ký pha đảo: Pha tĩnh ít phân cực, pha động phân cực, chất phân tích là các chất phân cực hoặc ít phân cực.
a. Lựa chọn pha tĩnh
Pha tĩnh được chế tạo trên các nền silica (SiO2), nhôm oxyd (Al2O3), cao phân tử hữu cơ (cellulose), mạch cacbon. Trong đó, pha tĩnh phổ biến nhất được chế tạo từ silica.
Chất nhồi cột trong pha tĩnh trên nền silica:
Tính chất phân cực của pha tĩnh phụ thuộc vào gốc R:
Pha tĩnh không phân cực: R là gốc octadecyl, octyl, phenyl propyl.... Pha tĩnh phân cực: R là gốc amino, diol, cyano....
Yêu cầu với pha tĩnh:
Trơ, bền vững với môi trường sắc ký.
Có khả năng tách hỗn hợp chất tan trong điều kiện xác định. Tính chất bề mặt ổn định.
Cân bằng động học của sự tách xảy ra nhanh, lặp lại tốt. Cỡ hạt đồng nhất.
Pha động là dung môi để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký. Trong sắc ký pha đảo, pha động thường là dung môi phân cực như nước, methanol, acetonitril,... hoặc hỗn hợp của chúng. Pha động ảnh hưởng tới các thông số trong quá trình sắc ký như: thời gian lưu tR, độ phân giải Rs, độ chọn lọc α... nên cần lựa chọn pha động phù hợp.
Yêu cầu:
Trơ với pha tĩnh, bền vững theo thời gian. Hoà tan chất cần phân tích.
Có độ tinh khiết cao.
Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký. Có tính kinh tế và đảm bảo môi trường.
Các yếu tố của pha động ảnh hưởng tới kết quả phân tích: Thành phần.
pH.
Tốc độ dòng.
c. Lựa chọn Detector
Detector là một trong những bộ phận thiết yếu của HPLC. Khác với sắc ký khí, HPLC không có detector vạn năng, đáp ứng được tất cả các chất mà cần phải lựa chọn detector phù hợp dựa vào tính chất hóa lý của hợp chất cần phân tích.
Yêu cầu với detector: Đáp ứng nhanh, lặp lại.
Độ nhạy cao, có thể phát hiện chất phân tích ở khối lượng hoặc nồng độ thấp.
Vận hành ổn định, dễ sử dụng. Khoảng hoạt động tuyến tính rộng.
Ít thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng.
Hiện nay có nhiều loại detector, nhưng thường sử dụng detector của hai nhóm quang học và điện hóa. Phổ biến nhất là detector UV- Vis, tùy từng chất phân tích mà người ta đặt các bước sóng phát hiện khác nhau.
2.2.1.2. Đánh giá phương pháp định lượng đã xây dựng
Độ thích hợp của hệ thống sắc ký: Đánh giá qua độ lệch chuẩn tương đối RSD của hàm lượng mẫu qua 6 lần phân tích cùng một mẫu. Yêu cầu RSD ≤ 2%.
Độ tuyến tính: Phương trình hồi quy thể hiện sự phụ thuộc tuyến
tính giữa nồng độ và diện tích pic phải có hệ số R ≥ 0,995.
Tính chọn lọc - Độ đặc hiệu.
Độ đúng: Đánh giá bằng phương pháp thêm chuẩn, phần trăm tìm
lại của mỗi nồng độ phải nằm trong khoảng 98% đến 102%.
Độ chính xác (độ lặp lại): Đánh giá qua độ lệch chuẩn tương đối RSD của hàm lượng mỗi mẫu thu được sau 6 lần phân tích độc lập. Yêu cầu RSD ≤ 2%.
2.2.2 Ứng dụng phương pháp đã xây dựng định lượng Cefepim trong chế phẩm đang lưu hành
Hàm lượng % cefepim trong chế phẩm so với hàm lượng ghi trên nhãn tính theo công thức:
%HL = 𝑆𝑡× 𝑚𝑐×𝑃 × 𝐾
𝑆𝑐 × 𝑚𝑏 (2.1)
Trong đó: St, Sc: Diện tích pic tương ứng của mẫu thử, mẫu chuẩn. mc: Khối lượng chất chuẩn.
P: Hàm lượng % cefepim trong chất chuẩn.
K: Khối lượng bột thuốc trung bình chứa 1g cefepim trong chế phẩm.
2.2.3 Phương pháp xử lý, đánh giá kết quả
Một số công thức tính toán: Giá trị trung bình
n
X
X
n i i
1 (2.2) Độ lệch chuẩn SD = ) 1 ( ) ( 1 2
n X X n i i (2.3) Độ lệch chuẩn tương đối
RSD =
100
X
S
CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CEFEPIM BẰNG HPLC
3.1.1. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử, mẫu chuẩn, mẫu trắng, pha động
3.1.1.1. Pha động: Đệm phosphat: acetonitril Đệm phosphat:
Cân khoảng 6,8g Kali dihydrophosphat cho vào cốc có chân 1,0 L. Thêm nước gần đầy, hòa tan KH2PO4.
Điều chỉnh pH bằng dung dịch KOH 1M.
Lọc bằng máy lọc hút chân không, màng lọc 0,45 µm. Siêu âm đuổi bọt khí 20 phút.
Acetonitril: Siêu âm đuổi bọt khí 20 phút.
3.1.1.2. Mẫu chuẩn:
Cân khoảng 0,1210g cefepim chuẩn. Hòa tan bằng dung dịch pha động, chuyển vào bình định mức 100,0 ml. Thêm đủ thể tích bằng pha động, lắc đều thu được dung dịch chuẩn có nồng độ 1mg/ml.
Hút 5,0ml dung dịch trên cho vào bình định mức 10,0 ml. Thêm đủ thể tích bằng pha động, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm thu được dung dịch cefepim chuẩn có nồng độ 0,5 mg/ml. Lấy dịch lọc để tiêm mẫu.
3.1.1.3. Mẫu thử
Cân khối lượng bột của 20 lọ thuốc, xác định khối lượng trung bình. Trộn đều bột của 20 lọ, cân khối lượng bột tương ứng với 0,025g cefepim .
Hòa tan bột bằng dung dịch pha động, cho vào bình định mức
25,0ml. Thêm dung dịch pha động cho đủ thể tích, lắc đều thu được dung dịch
thử có nồng độ 1mg/ml.
Hút chính xác 5,0ml dung dịch trên cho vào bình định mức 10,0 ml, thêm dung dịch pha động cho đủ thể tích, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm thu được dung dịch thử có nồng độ 0,5mg/ml. Lấy dịch lọc để tiêm mẫu.
3.1.1.4. Mẫu trắng:
Pha động lọc qua màng lọc 0,45 µm.
3.1.2. Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký.
Trong quá trình nghiên cứu, dựa vào các tính chất lý hóa của cefepim, cùng với việc tham khảo các tài liệu khoa học, tôi đã lựa chọn sắc ký HPLC pha đảo sử dụng cột C18. Trong quá trình thực nghiệm, tôi đã khảo sát các điều kiện sắc ký như: bước sóng, tốc độ dòng, tỷ lệ pha động....
3.1.2.1. Lựa chọn bước sóng
Để xác định bước sóng phù hợp, tiến hành quét phổ hấp thụ dung dịch cefepim 0,5mg/ml. Phổ hấp thụ được ghi ở hình 3.1.
Hình 3.1: Phổ hấp thụ tử ngoại của cefepim
Phổ hấp thụ của dung dịch cefepim chuẩn 0,5 mg/ml cho cực đại hấp thụ ở bước sóng 236, 248, 256 nm. Để giảm ảnh hưởng của dung môi và tạp chất nhưng vẫn đảm bảo độ nhạy của phương pháp, tôi chọn bước sóng 256 nm.
3.1.2.2. Lựa chọn pha động
Trong quá trình khảo sát, có sự tham khảo các tài liệu khoa học, chúng tôi nhận thấy hệ dung môi đệm phosphat: acetonitril cho pic khá cân đối, ngoài ra acetonitril có độ nhớt thấp nên có thể tiến hành sắc ký ở áp suất thấp.
Sau khi lựa chọn dung môi chúng tôi khảo sát pha động có chứa acetonitril và đệm phosphat ở pH = 3 và pH = 5.
Sau khi lựa chọn pH, khảo sát lựa chọn tỷ lệ pha động phosphat pH= 5: acetonitril lần lượt là 75:25; 85:15; 90:10 (v/v).
Sau quá trình khảo sát, hệ dung môi đệm phosphat pH=5: acetonitril= 85:15 (v/v), là hệ dung môi cho thời gian lưu thích hợp, pic đối xứng.
3.1.2.3. Lựa chọn tốc độ dòng
Tiến hành sắc ký theo những điều kiện đã khảo sát ở trên với tốc độ dòng lần lượt 0,8ml/phút, 1ml/phút, 1,2ml/phút nhằm lựa chọn được tốc độ dòng phù hợp đảm bảo phân tách tốt, định lượng được cefepim, rút ngắn thời gian phân tích.
Qua kết quả thực nghiệm, tốc độ dòng 1ml/phút cho pic đối xứng, thời gian lưu thích hợp.
Vậy từ các kết quả khảo sát trên, điều kiện sắc ký được lựa chọn: Cột sắc ký Apollo C18 (4,6 × 250mm, 5µm).
Detector UV λ= 256nm.
Pha động: Acetonitril: Đệm phosphat pH = 5 (15:85, v/v). Thể tích tiêm 20µl.
Tốc độ dòng 1ml/phút.
3.1.3. Tiến hành định lượng.
Chuẩn bị pha động, cho hệ thống chạy ổn định với pha động.
Tiêm lần lượt dung dịch thử và dung dịch chuẩn vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã chọn.
Ghi lại diện tích pic thu được của các mẫu.
3.2. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG.
Để đảm bảo phương pháp định lượng đã xây dựng ở trên thích hợp để định lượng cefepim trong chế phẩm thuốc, chúng tôi tiến hành thẩm định phương pháp. Gồm các chỉ tiêu: Tính chọn lọc – Độ đặc hiệu Độ thích hợp của hệ thống sắc ký Độ tuyến tính Độ đúng Độ chính xác 3.2.1. Tính chọn lọc – Độ đặc hiệu
Mục đích: Thể hiện khả năng phương pháp phân tích có thể phân biệt rõ chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác trong mẫu.
Tiến hành:
Chuẩn bị mẫu trắng, mẫu cefepim chuẩn (0,5 mg/ml), mẫu cefepim
thử (0,5 mg/ml) như mục 3.1.1, mẫu cefepim thử thêm chuẩn như bảng 3.4.
Tiến hành tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã lựa chọn.
Ghi lại sắc ký đồ. Kết quả:
1. Mẫu trắng
Hình 3.2: Sắc ký đồ mẫu trắng
2. Mẫu dung dịch cefepimchuẩn 0,5 mg/ml
3. Mẫu dung dịch cefepimthử 0,5 mg/ml
Hình 3.4: Sắc ký đồ mẫu cefepim thử 0,5 mg/ml
4. Mẫu dung dịch cefepim thử thêm chuẩn
Hình 3.5: Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn của cefepim
Đối với các hệ thống sắc ký có sử dụng detector mảng diod có thể xác định tính chọn lọc thông qua xác định độ tinh khiết của pic hoặc so sánh phổ của chất chuẩn và chất thử.
Độ tinh khiết: 999,986
Hình 3.6: Độ tinh khiết của pic sắc ký của cefepim
Tiến hành chồng phổ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn, thu được kết quả:
Hệ số Match 999,998
Hình 3.7 : Chồng phổ cefepim của dung dịch chuẩn và thử.
Nhận xét:
Trên hình 3.2 ta thấy trong khoảng thời gian phân tích 8 phút của mẫu trắng không xuất hiện pic.
Trên hình 3.3, 3.4, 3.5 ta thấy trong mẫu dung dịch cefepim chuẩn, cefepim thử, và mẫu cefepim thử thêm chuẩn đều cho 1 pic có thời gian lưu tR= 4,63 phút.
Trên hình 3.6, độ tinh khiết của pic đạt 999,986. Trên hình 3.7, hệ số phù hợp đạt 999,998.
Điều này chứng tỏ pic trên sắc ký đồ là của cefepim, phương pháp định lượng có độ đặc hiệu cao.
3.2.2. Độ thích hợp của hệ thống.
Nguyên tắc: Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần cùng một dung dịch mẫu chuẩn cefepim vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã chọn. Độ thích hợp của hệ thống được thể hiện thông qua số đĩa lý thuyết, hệ số đối xứng, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu, diện tích pic.
Tiến hành:
Tiêm mẫu qua hệ thống sắc ký theo chương trình đã chọn, ghi lại diện tích pic, thời gian lưu, hệ số đối xứng.
Bảng 3.1: Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống sắc ký
STT Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU.s) Hệ số bất đối xứng 1 4,629 19863,6 0,814 2 4,630 19860,7 0,811 3 4,631 19858,7 0,814 4 4,631 19822,4 0,812 5 4,635 19863,0 0,811 6 4,632 19817,6 0,813 Trung bình 4,6313 19847,67 RSD 0,04% 0,11% Nhận xét:
Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích pic đều nhỏ hơn 2%.
Các giá trị của hệ số bất đối xứng0,8 ≤AF≤ 1,5.
Như vậy, chương trình đã chọn sử dụng để định lượng cefepim trong chế
phẩm là phù hợp.
3.2.3. Khoảng tuyến tính
Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của cefepim trong khoảng nồng độ biến thiên từ 0,25mg/ml đến 0,7 mg/ml.
Tiến hành:
Hút chính xác các thể tích dung dịch cefepim chuẩn 1mg/ml đã chuẩn bị ở mục 3.1.1. cho vào bình định mức 10,0 ml như bảng 3.2, thêm dung môi pha động vừa đủ đến vạch thu được dung dịch có nồng độ từ 0,25 mg/ml đến 0,7 mg/ml. Lắc đều.
Tiêm lần lượt các dung dịch chuẩn vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã lựa chọn.
Ghi lại giá trị diện tích pic tương ứng với các nồng độ chất chuẩn cefepim.
Kết quả khảo sát độ tuyến tính:
Bảng 3.2: Cách pha dung dịch chuẩn và kết quả khảo sát độ tuyến tính Nồng độ (mg/ml) 0,25 0,375 0,5 0,625 0,7 Thể tích dd cefepim (ml) 2,5 3,75 5,0 6,25 7,0 Thể tích dd pha động(ml)
Thêm vừa đủ dung dịch pha động vào bình định mức 10,0 ml.
Diện tích pic (mAU.s)
10123,28 15028,45 19840,43 24511,37 27940,51
Kết quả Phương trình hồi quy: y= 39152,63x + 304,02
nồng độ (mg/ml)
Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ với diện tích pic của cefepim
Nhận xét:
Kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ khảo sát, diện tích pic thu được tỷ lệ thuận với nồng độ dung dịch thể hiện qua đường thẳng hồi quy y=39152,63 x + 304,02 và hệ số tương quan R= 0,9997.
Như vậy, phương pháp tuyến tính trong khoảng nồng độ 0,25 mg/ml đến 0,7 mg/ml.
3.2.4. Độ chính xác
Nguyên tắc: Độ chính xác của một phương pháp phân tích được xác định bằng cách định lượng nhiều lần các dung dịch thử cùng một mẫu với số lượng đủ để xác định tính toán thống kê độ lệch chuẩn hay độ lệch chuẩn tương đối.
Trong HPLC tiến hành định lượng 6 lần, tính độ lệch chuẩn tương đối RSD, yêu cầu RSD ≤ 2%. Tiến hành: y = 39,152.6259x + 304.0213 R² = 0.9994 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8
Chuẩn bị dung dịch chuẩn, dung dịch thử như phần 3.1.1.
Tiêm mẫu qua hệ thống sắc ký theo chương trình đã chọn, ghi lại diện tích pic.
Kết quả khảo sát độ chính xác:
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp
STT Khối lượng (g) Diện tích pic
(mAU.s) Hàm lượng % 1 0,0482 19582,37 99,40 2 0,0486 20615,5 103,78 3 0,0485 20389,07 102,61 4 0,0483 19870,5 100,65 5 0,0484 20138,67 101,80 6 0,0483 19827,35 100,44 Trung bình 0,0483 101,45 RSD 1,57%
Mẫu chuẩn: SC = 19840,43 (mAU.s), hàm lượng 82,62%.
Nhận xét:
Kết quả thẩm định độ chính xác của phương pháp cho thấy trong điều kiện sắc ký đã chọn, độ lệch chuẩn tương đối là 1,57% < 2%. Như vậy phương pháp có độ chính xác tốt.
3.2.5. Độ đúng
Nguyên tắc: Độ đúng được tính toán dựa trên tỷ lệ phần trăm phục hồi trong định lượng khi thêm một lượng chất tan đã biết cho vào mẫu đo, hoặc
dựa vào sự sai biệt giữa trị số trung bình và giá trị thực chấp nhận cùng với khoảng tin cậy.
Tiến hành:
Dung dịch thử 1mg/ml làm tương tự như phần 3.1.1. Pha dung dịch chuẩn 0,5 mg/ml tự như phần 3.1.1.
Thêm vào mẫu thử một lượng chất chuẩn 0,5 mg/ml tương ứng khoảng 10%, 20%, 30% so với lượng hoạt chất có sẵn như bảng 3.4. Thêm đủ thể tích bằng dung dịch pha động, lắc đều. Mỗi nồng độ làm 3 mẫu.
Lọc qua màng lọc 0,45 µm. Tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã chọn. Ghi lại diện tích pic.
Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.4 : Cách pha các dung dịch khảo sát độ đúng
STT Thể tích mẫu thử 1mg/ml (ml) Thể tích mẫu chuẩn 0,5mg/ml (ml) Thêm dung dịch pha động vừa đủ vào bình định mức 10,0 ml. 10% 5 1 20% 5 2 30% 5 3
Bảng 3.5 : Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp STT Lượng thêm vào Diện tích pic (mAU.s) Lượng chuẩn thêm vào (mg/ml) Lượng tìm lại (mg/ml) % tìm lại 1.1 10% 21857.46 0,05 0,0508 101,66 1.2 21870,63 0,05 0,0512 102,33 1.3 21811,16 0,05 0,0497 99,33 Trung bình 101,11 RSD 1,56% 2.1 20% 23785,27 0,1 0,0994 99,41
