D. NUÔI TRỒNG LAN MOKARA, ĐIỀU KIỆN THÍCH NGHI VÀ TÌNH HÌNH SÂU
E. NHÂN GIỐNG LAN MOKARA
E.I. Nhân Giống Lan Mokara Theo Cách Truyền Thống
E.I.1. Phương pháp nhân giống bằng hạt:
Hạt lan nảy mầm
Hạt lan rất nhỏ giống như hạt bụi và không có dự trữ chất dinh dưỡng cung cấp cho hạt trong giai đoạn đầu tiên của cuộc sống giống như những hạt táo, hạt đậu. Bởi vì lý do đó, hoa lan sinh sản một số lượng lớn, lên đến cả triệu hạt trong mỗi quả lan.
Trong thiên nhiên hạt lan sẽ nảy mầm, nhưng không phát triển trừ phi bị nhiễm trùng bởi địa y (nấm mốc cộng sinh, nấm mycorrhizal), các nấm này cung cấp đường và chất dinh dưỡng cần thiết cho các cây con cho đến khi cây này đủ sức tự sản xuất ra thức ăn.
Khi hạt lan nảy mầm, bắt đầu trở thành những trái banh, nhỏ được gọi là thân hành (protocorms – hạt mầm). Những hạt này màu trắng khi còn nhỏ và một thời gian sau trở thành màu xanh lục.
Hình trên, hạt Epidendrum radicans nảy mầm tạo nên thân hành màu xanh lục sau 2 tuần. Hạt mầm Cyrtopodium punctatum sống trong giá thể (media) đã được hơn 2 tháng.
Sau đó các hạt mầm này mọc dài ra và đủ mạnh để tạo ra chiếc lá đầu tiên. Khi lớn lên các mầm này sẽ đủ sức tự sản xuất ra thức ăn và không cần địa y (nấm mốc cộng sinh) nữa.
Nảy mầm cộng sinh trong vỏ
Trước khi cách nuôi cấy trong ống nghiệm (vitro) được khám phá ra, người ta xử dụng những địa y (nấm mốc) mọc trên rễ lan đã phát triển. Hạt tươi được gieo rất gần rễ các hạt cũ và giữ đủ ẩm để bắt đầu nảy mầm.
Khuyết điểm của phương pháp này là cây con có thể bị chết bởi sâu bọ, do đó không thể gieo hạt một số lượng lớn được.
Nảy mầm cộng sinh (symbiotic) trong ống nghiệm (in vitro)
Trong phương pháp này địa y (nấm mốc cộng sinh) đã được nuôi sẵn trong ống nghiệm. Hạt lan được khử trùng và chuyển vào trong ống nghiệm, sẽ tiêm nhiễm với địa y và bắt đầu phát triển.
Sự khó khăn của cách làm này là làm sao giữ cho sự phát triển của địa y và sự phát triển của hạt lan cân bằng. Nếu không cân bằng địa y sẽ phát triển quá nhanh và giết chết các hạt lan.
Nẩy mầm không cộng sinh (asymbiotic) trong ống nghiệm (in vitro)
Để giảm thiểu sự rủi ro thất bại người ta không dùng địa y cộng sinh để cho hạt lan ăn. Công việc này được làm bởi giá thể (media) mà hạt được trồng lên. Giá thể trồng cung
cấp cho hạt lan đường và chất dinh dưỡng cho đến khi chúng đủ lớn để tự sản xuất thức ăn.
E.I.2. Phương pháp lai
Chọn cặp bố mẹ tạo hạt:
Hoa bố mẹ có màu sắc hấp dẫn khác nhau ở cùng loại. Chú ý đến tính chống chịu, các cặp chọn nên có nguồn gốc địa lý cách xa nhau.Tính trội ở lan là đỏ hồng tím đỏ. Nắm vững các đặc điểm sinh trưởng của bố mẹ trong các thời kỳ đặc biệt là thời kỳ ra hoa.
Lai tạo giống:
Khi nụ to chín khử đực cây mẹ.
Thụ phấn cây bố : dùng kẹp gắp bao phấn chưa nở rồi cho vào lọ thuỷ tinh để trong nhiệt độ phòng 22-240 C để cho hạt phấn chín.
Khi hạt phấn nở tung ra thì đưa vào bình hút ẩm để bảo quản, chờ khi hoa cái chín thì thụ phấn nhân tạo.
Khi hoa cái nở 3-4 tiếng tiến hành thụ phấn nhân tạo. Sau 5-10 tuần tiến hành thu quả, không nên đề quả chính khô, thu tốt nhất là khi quả có màu vàng. Xử lý foocmalin 0.5% để chống nấm chống vi khuẩn, rồi ủ trong 2giờ, sau đó hong khô, chờ hạt nứt vỏ ta thu hạt.
Khi hạt tách ra lâu nhất là ba ngày sau phải gieo hạt ngay. Hạt lan vỏ cứng khả năng hút nước rất kén, rất khó nảy mầm. Do đó khi gieo hạt lan phải qua khâu xử lý hạt, và phải gieo hạt trong môi trường nhân tạo.
Khâu xử lý hạt như sau: cho hạt vào lọ thuỷ tinh đổ nước oxy già nồng độ 3% ngâm trong 16 phút, sau đó hút dung dịch oxy già ra ngoài rửa 3 lần với nước cất. Sau đó cho vào phòng cấy vô trùng để cấy. Chiếu sáng 18 giờ. Nếu không có ánh sáng tự nhiên chiếu sánh nhân tạo 4000lux.
Môi trường nhân tạo gồm các thành phần sau:
Ca(PO4)2 0.2gam+nước cất+2 giọt HCl 0,1N
MgSO4.7H2O 0,5 gam (NH4)2SO4 0,25 gam KH SO4 0,225 gam Fe2(CuH4O3).3H2O 0,28 gam MnSO4.4H2O 0,007gam Sacaroza 20 gam Agar 10 gam Nước cất 1lit
E.I.3. Phương pháp nhân giống bằng cách cắt ngọn
Cây mẹ có độ tuổi từ 6 tháng đến 1 năm có thể cho ghép cắt cành để nhân giống. Cắt cành tốt nhất là vào đầu mùa mưa, điều kiện môi trường thuận lơi, khí hậu mát mẻ, cây cỏ phát triển tốt. Có thể cắt cành vào bất cứ diệp nào trong năm miễn phù hợp về điều kiện môi trường
Mỗi lần cắt cho nhiều cây con, một đoạn 3-5cm với ít nhất hai tầng gió rễ là có thể tách thành cây mới. Cây con sau khi tách trồng trong giá thể mới như cây trưởng thành,và cây con sau khi tách phần có ngọn sẽ nhanh cho hoa hơn. Cây con cần để nơi có độ ấm cao, thoáng, ít nắng, tưới theo kiểu phun sương 4 lần trong ngày, khi cây có rễ chắc mới bắt đầu bón phân và đưa ra nắng. Cây mẹ sau khi cắt ngọn sẽ ra chồi nách và phát triển thành thân mới.
Nên nhớ là cây phải được cắt bằng kéo cất cành đã được khử trùng và sau đó phải trét vadơlin có trộn Zineb, sơn, hoặc vôi vào vết cắt để tránh sự nhiễm trùng và cuối cùng ta làm những động tác tiếp tục như cây thay chậu.
Một phương pháp khác được đề cập đến, tuy đơn giản nhưng có hiệu quả hơn. Dây đồng là dụng cụ duy nhất dùng cho công tác này, được buộc vào thân cây và xiết chặt, vì thế mạch dẫn nhựa bị ức chế là nguyên nhân tạo sự kích thích cây mọc chồi mới. Khi chồi nhú ra khỏi thân, ta gỡ dây đồng ra, cây con sẽ lớn dần. Tốt nhất là đợi cây con phát triển thành thục và mọc rễ ta sẽ cắt cây con lìa khỏi thân cây mẹ. Tuyệt đối đừng bao giờ cắt ngọn cây mẹ để phần gốc còn lại nuôi dưỡng cây con, vì nó sẽ mắc phải những khuyết điểm như phương pháp trên.
Với phương pháp này ta sẽ có cây con mới nhưng sức khỏe cây mẹ vẫn bình thường, cây không bị ” xốc” bảo đảm sự ra hoa trong mùa kế tiếp.
E.I.4. Phương pháp nhân giống bằng cách tách cây con (keiki)
Cây con là một cây nhò dâm ra từ thân hay cuống hoa cũ. Tách cây con là một kỹ thuật đơn giản dễ làm và cây con tách ra có tỉ lệ sống cao. Ngoại trừ với Phalaenopsis sự xuất hiện của cây con báo hiệu cây già hoặc chăm sóc kém.
Keiki
E.I.5. Phương pháp nhân giống bằng cách chiết
Cách ngọn 20-30cm, cắt một lớp cắt để bóc vỏ đi. Bọc quanh vết cắt bằng một tảng rêu giữ ẩm, có tẩm dung dịch tạo rễ. Sau khi rễ được tạo thành cây con được tách ra và để vào chậu
Đây là phương pháp nhân giống đơn giản bằng cách cây con được cắt thẳng từ đọan trên cùng (đọt) của cây mẹ. Thông thường tùy theo yêu cầu quy cách hom giống tối thiểu phải bao gồm từ 2- 3 rễ đâm ra từ thân cây mẹ. Kích cỡ thường để trồng là tối thiểu 25 – 30 cm, có thể tới 50 – 60 cm. Hom càng dài thì khả năng cây càng khỏe do có nhiều rễ, sau khi cắt trồng sang vườn mới thì khả năng phục hồi nhanh, mau ra hoa trở lại. Tùy theo đặc tính giống, sau 3 tháng cây con cắt từ đọt đã có thể cho hoa nhưng thông thường để dưỡng cây người ta cắt bỏ các phát hoa ở giai đọan này.
Nhược điểm của phương pháp này là giống đợt đầu nhân ra với số lượng hạn chế, cứ một cây mẹ thì cắt được một đọt - tức 1 cây con. Tuy nhiên sau khi cắt đọt, cây mẹ nếu chăm sóc tốt từ các nách lá, tập trung phần trên gần chỗ cắt sẽ ra tiếp tục các mầm cây con. Thông thường từ cây mẹ sẽ ra được 2 - 3 chồi, tối đa có thể 4 chồi, sau khỏang 6 tháng cây con sẽ phát triển hòan chỉnh và có thề tách ra để trồng. Giá thành cây giống cũng cao giống như cây mẹ.
E.I.7. Phương pháp nhân giống bằng hom cải tiến
Biện pháp cắt hom lấy phần ngọn làm cây giống, còn phần gốc sẽ phát triển các chồi con thành cây thành phẩm để trồng đang được nhà vườn trồng lan cắt cành Mokara áp dụng rộng rãi. Tuy nhiên, một điểm hạn chế của phương pháp này là hệ số nhân chồi không cao. Từ một cây mẹ ban đầu, sau khi cắt hom, lấy phần ngọn ta được 01 cây thành phẩm thì số lượng chồi con sinh ra không nhiều, từ 2 – 3 chồi, tối đa có thể 4 chồi. Để cải thiện hệ số này, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm bằng áp dụng các biện pháp kỹ thuật để tác động vào để nâng cao khả năng ra chồi của các giống Mokara. Các lọai phân bón lá có hàm lượng đạm cao như 31-11-11 kết hợp lọai có chứa axit amin, rong biển được phun liên tục vào thời điểm trước khi cắt đọt 1 tháng và sau khi cắt 6 tháng.
Cây lan Mokara được xử lý ra chồi sau khi cắt đọt 3 tháng
Kết quả thu được cho thấy: đối với cả 2 giống thí nghiệm, tất cả các công thức có xử lý phân bón lá 31-11-11 kết hợp với rong biển, phân Terra Sorb ( có chứa acid amin ) đã cho số lượng chồi thu được cao hơn hẳn so với đối chứng từ 64 – 114%. Cũng như cao hơn so với công thức chỉ xử lý phun phân bón lá lọai 31-11-11. Số lượng chồi đạt tiêu chuẩn sau 6 tháng cắt đọt trong công thức này cũng cao hơn so với công thức đối chứng và công thức phun 31-11-11. Trong công thức có xử lý rong biển là lọai phân bón lá có chứa chất kích thích sinh trưởng Cytokinin. Đây là loại chất điều hòa sinh trưởng có tác dụng kích thích sự phân hóa cơ quan của thực vật, đặc biệt là phân hóa chồi. Nếu tỷ lệ Auxin cao hơn Cytokinin thì kích thích ra rễ, còn tỷ lệ Cytokinin cao hơn Auxin thì kích thích sự phát triển của chồi nách, giải phóng cây khỏi sự kìm hãm của chồi ngọn. Ngòai
ra, lọai phân bón có chứa acid amin cũng góp phần cho sự phát triển về chiều cao của các chồi nách sau khi đọt cây mẹ bị cắt.
E.II. Nhân Giống Lan Mokara In vitro
E.II.1. Khái quát phương pháp nuôi cấy in vitro
Khái quát chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật
Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô PGS-TS Lê Văn Hoàng- Nhà xuát bản và kỹ thuật Hà Nội
Năm 1665, Robert Hooke quan sát thấy tế bào sống dưới kính hiển vi và đưa ra khái niệm tế bào. Năm 1838, Matthias Schleiden và Theodore Schwann đã đề xướng học thuyết cơ bản của sinh họclà học thuyết tế bào.
Năm 1875, Oscar Hertwing chứng minh bằng quan sát kính hiển vi sự thụ thai là do sự hợp nhất của nhân trứng và nhân tinh trùng. Sau đó, Hermann P., Schneider F.A và Butschli O. đã mô tả chính xác quá trình phân chia tế bào.
Năm 1883, Wilhem Roux lần đầu tiên lý giải về phân bào giảm nhiễm ở cơ quan sinh dục.
Năm 1902, Haberlandt lần đầu tiên nuôi cấy mô cây một lá mầm nhưng không thành công.
Năm 1934, Kogl lần đầu tiên xác định vai trò của IAA, một hoomon thực vật đầu tiên thuộc nhóm auxin có khả năng kích thích sự tăng trưởng và phân chia tế bào.
Năm 1939, ba nhà khoa học Gautheret, Nobecourt, White đã đồng thời nuôi cấy mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô thượng tầng ở cà rốt và thuốc lá.
Năm 1941, Overbeek và cộng sự đã sử dụng nước dừa nuôi cấy phôi non ở cây cà Datura.
Năm 1955, Miller và cộng sự đã phát minh ra cấu trúc và sinh tổng hợp từ chất kinetin-hoomon có vai trò trong quá trình phân bào và phân hoá chồi ở mô nuôi cấy.
Năm 1957, Skoog va Millert đã phát hiện vai trò tỷ lệ nồng độ của các chất auxin và cytokinin trong môi trường nuôi cấy. Năm 1952, Morel và Martin đã tạo ra cây sạch
bệnh virus của 6 giống khoai tây từ nuôi cấy đinh sinh trrưởng. Cùng năm đó hai ông đã thực hiện vi ghép invitro thành công. Năm 1960, Morel đã thực hiện bước ngoặc cách mạng trong sử dụng kỹ thụât nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong nhân nhanh giống địa lan Cymbidium mở đầu thành công trong sự nghiệp vi nhân giống thực vật.
Năm 1960, Coking lần đầu tiên sử dụng enzyme phân giải thành tế bào và đã tạo ra số lượng tế bào trần rất lớn.
Năm 1971, Takebe và cộng sự đã tái sinh được cây từ tế bào trần mô thịt lá ở thuốc lá.
Năm 1972, Carlson và cộng sự lần đầu tiên thực hiện lai tế bào soma giữa các loài, tạo được cây từ dung hợp tế bào trần từ hai loài thuốc lá Nicotiana glauca và Nicotiana langsdorfii.
Năm 1978, Melchers đã tạo được cây lai soma giữa cà chua và thuốc lá bằng lai xa hai tế bào trần của hai cây này.
Năm 1964, Guha và Maheshwari tạo thành công cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà chua Datura.
Năm 1959, Tulecke và Nickell đã thử nghiệm thử sinh khối mô thực vật bằng nuôi cấy chìm.
Năm 1977, Noguchi đã nuôi cấy tế bào thuốc lá trong bioreator dung tích 20.000lít.
Năm 1981, trên cơ sở quan sát các biến dị xảy ra phổ biến trong nuôi cấy mô và đã đưa ra khái niệm biến dị soma. Năm 1974, Zaenen và cộng sự đã phát hiện plasmid Ti đóng vai trò yếu tố gây khối u ở cây trồng.
Năm 1977, Chilt và cộng sự đã chuyển thành công T-DNA vào thực vật.
Năm 1979, Marton đã xây dựng quy trình chuyển gen vào tế bào trần bằng nuôi cấy tế bào trần và Agrobacterium.Năm 1982, đã chuyển thành công DNA vào tế bào trần.
Năm 1985, Fraley và cộng sự đã thiết kế vertor chuyển gen vào thực vật. Cùng năm ấy Horsch cũng đã chuyển gen vào mảnh lá bằng Agribacterium tumefacienns và tái sinh cây chuyển gen.
Năm 1994, thương mại hoá cây cà chua chuyển gen “Flavr-savr”.
E.II.2. Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào thực vật
Khái niệm chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là sự nuôi cấy vô trùng các cơ quan, mô, tế bào thực vật trên môi trường nuôi cấy đựợc xác định rõ: Việc nuôi cấy được duy trì dưới điều kiện kiểm soát. Vi nhân giống là phương pháp nhân nhanh với số lượng lớn và giảm giá thành.
E.II.3. Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào thực vật
Haberlandt 1902, lần đấu tiên đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kỳ của mỗi cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hoá đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó.
Khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh đó là tính toàn năng của tế bào. Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận vủa phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Cho đến nay con người đã hoàn toàn chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh.
Cơ thể thực vật trưởng thành là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều tế bào khác nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử liên tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh mang chức năng riêng biệt (chuyên hoá). Sau đó từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành