Chuẩn bị
- Bản mỏng Silica gel 60 F254 , 4x10 cm, hoạt hóa ở 1100 C trong 60 phút. - Dung môi triển khai: Khảo sát các hệ:
(I) Toluen – ethylacetat – acid formic (5:6:1)
(II) Chloroform – methanol – nước (65:35:10), lắc kỹ, lấy lớp dưới. (III) Chloroform – methanol - acid formic (9:1: 0,2)
- Hiện màu: Thuốc thử vanilin sulfuric (100 ml Vanillin 1% /EtOH 96%+ 2 ml dung dịch H2SO4 đặc).
Chiết xuất
- Dung dịch thử: Lấy 5g cao dược liệu vào bình nón, thêm 60ml methanol, đậy nắp kín, đun cách thủy 15 phút, lọc. Chiết 2 lần như trên. Gộp dịch chiết methanol, cô trên cách thủy đến cạn. Khuấy kỹ cắn với n – butanol 2 lần, mỗi
lần 20ml, khuấy trong 5 phút. Gộp dịch chiết butanol, cô trên cách thủy đến cắn. Hoà tan cắn trong 1ml ethanol 96% được dung dịch chấm sắc ký.
- Dung dịch đối chiếu: Lấy 1g huyền sâm đã cắt nhỏ, thêm 20ml butanol, đun sôi hồi lưu trong 1 giờ, để nguội, lọc. Cô dịch lọc trên cách thủy đến cạn. Hòa cắn trong 1ml ethanol 96% được dung dịch chấm sắc ký.
Tiến hành
Chấm riêng biệt lên bản mỏng 6l mỗi dung dịch thử và dung dịch đối chiếu. Sau khi triển khai sắc kí, lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng, quan sát dưới đèn UV; phun thuốc thử hiện màu, sấy ở 1200C cho đến khi hiện rõ vết. Chụp ảnh bằng thiết bị chụp ảnh Camag, xử lý kết quả bằng phần mềm Wincats, Videoscan.
Kết quả: Trong các hệ dung môi, hệ (III) tách vết và hiện màu tốt nhất sau khi hiện màu bằng thuốc thử vanilin sulfuric (Bảng 3.6, Hình 3.5).
Bảng 3.6. Kết quả phân tích sắc ký đồ của cao và huyền sâm sau khi hiện màu.
STT Rf Màu sắc Cao HS 1 0,05 Đen +++ +++ 2 0,09 Đen +++ ++ 3 0,14 Xanh đen +++ 4 0,18 Xanh lá ++ + 5 0,27 Tím ++ 6 0,30 Tím +++ 7 0,36 Nâu ++ +++ 8 0,42 Xanh lá +++ +++ 9 0,49 Hồng nhạt + 10 0,56 Hồng nhạt + 11 0,68 Hồng ++ ++ 12 0,72 Tím +++ 13 0,95 Tím ++ Hình 3.5. Sắc ký đồ cao-HS sau khi hiện
Nhận xét: Kết quả phân tích sắc ký đồ sau khi phun thuốc thử cho thấy: có 6 vết tương đương giữa cao và huyền sâm.
3.2.6. Cát cánh, Thiên môn, Mạch môn
Chuẩn bị
- Bản mỏng: Silica gel 60 F254 , 6x10 cm, hoạt hóa ở 1100 C trong 60 phút. - Dung môi khai triển: Khảo sát trên các hệ:
(I) Chloroform - methanol (10:1)
(II) Chloroform - methanol - acid formic (19:1) (III) Toluen – ethylacetat ( 9:1)
(IV) Toluen – ethylacetat – acid formic (5:5:1)
- Hiện màu: Thuốc thử vanilin sulfuric (100 ml Vanillin 1% /EtOH 96% + 2 ml dung dịch H2SO4 đặc).
Chiết xuất:
- Dung dịch thử: Lấy 5 g cao lỏng, thêm 10ml methanol, đun hồi lưu cách thủy 20 phút, lọc lấy dịch chiết, thủy phân dịch chiết bằng HCl 5% khoảng 1 giờ, chiết bằng 5ml chloroform x 2 lần. Cô dịch chiết chloroform đến cắn, hòa tan cắn trong 1ml ethanol 96% thu được dung dịch chấm sắc ký.
- Dung dịch đối chiếu: Lấy 4 g dược liệu mỗi loại, cắt nhỏ, làm tương tự như với dung dịch thử, bắt đầu từ “thêm 10ml methanol… sắc ký”.
- Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 6l dung dịch thử và 5µl dung dịch đối chiếu. Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng, quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254, 366 nm; phun thuốc thử hiện màu, sấy ở 1200 C cho đến khi hiện rõ vết. Chụp ảnh bằng thiết bị chụp ảnh Camag, xử lý kết quả bằng phần mềm Wincats, Videoscan.
Kết quả: Trong các hệ dung môi trên, hệ (IV) cho kết quả tách vết và hiện màu tốt nhất sau khi hiện màu bằng thuốc thử vanilin sulfuric (Bảng 3.7, Hình 3.6).
Hình 3.6. Sắc ký đồ CC- cao- TM- MM sau khi hiện màu
Bảng 3.7. Kết quả phân tích sắc ký đồ của CC-cao-TM-MM sau khi hiện màu
STT Rf Màu sắc Cát cánh Cao Thiên môn Mạch môn
1 0,08 Đen + 2 0,15 Đên + 3 0,22 Tím ++ 4 0,25 Tím ++ + +++ ++ 5 0,30 Xanh dương ++ 6 0,32 Tím nhạt + 7 0,40 Xanh lá +++ ++ +++ 8 0,51 Tím ++ ++ ++ ++ 9 0,56 Tím nhạt + 10 0,60 Vàng ++ 11 0,73 Tím ++ ++ +++ 12 0,76 Hồng đậm +++ 13 0,79 Tím + +++ 14 0,85 Tím ++ ++ ++ ++ 15 0,95 Tím ++ ++ ++ +++ Chú thích: (+): Có vết (++): vết đậm (+++): vết rất đậm
Nhận xét: Kết quả phân tích sắc ký đồ cho thấy: - Giữa cao và cát cánh có 6 vết tương đương. - Giữa cao và thiên môn có 6 vết tương đương. - Giữa cao và mạch môn có 4 vết tương đương.
3.3. Nghiên cứu tác dụng sinh học:
Mẫu nghiên cứu: Cao lỏng Vĩ Ngân (cao 5/1), pha loãng với nước cất theo tỉ lệ thích hợp ở các mức liều khác nhau.
3.3.1. Tác dụng giảm ho:
Tiến hành:
40 chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 10 con: - Lô 1 (chứng): uống nước cất, thể tích 0,2ml/10g.
- Lô 2 (đối chiếu): uống codein phosphat liều 20 mg/kg. - Lô 3: uống cao lỏng Vĩ Ngân liều 63,36 g dược liệu/kg. - Lô 4: uống cao lỏng Vĩ Ngân liều 190,08g dược liệu/kg.
Chuột được uống thuốc thử liên tục trong 3 ngày vào các buổi sáng. Ngày thứ 3 sau khi uống thuốc thử 1 giờ, tiến hành gây ho cho cả 4 lô chuột bằng khí amoniac liều 0,5ml/bình thủy tinh chuyên dụng. Xác định thời gian tiềm tàng (t) là thời gian tính từ khi thả chuột vào bình đến khi chuột xuất hiện cơn ho đầu tiên và tổng số cơn ho trung bình trong 10 phút, so sánh mức độ tăng (t) và mức độ giảm số cơn ho của các lô thử so với lô chứng và lô đối chiếu.
Kết quả:
Trên mô hình gây ho cho chuột nhắt trắng bằng khí amoniac, thời gian tiềm tàng xuất hiện cơn ho và tổng số cơn ho được trình bày trong bảng 3.8, 3.8; hình 3.7; 3.8. * Khác biệt so với nhóm chứng với P ≤ 0,05
** Khác biệt so với nhóm chứng với P ≤ 0,01 *** Khác biệt so với nhóm chứng với P ≤ 0,001
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của cao lỏng Vĩ Ngân lên thời gian tiềm tàng xuất hiện cơn ho.
Lô chuột N
Thời gian tiềm tàng (giây)
(X SE)
Mức độ tăng thời gian tiềm
tàng so với chứng (%) P Lô 1: Chứng 9 118,00 ± 22,05 Lô 2: Codein phosphat 20mg/kg 9 226,00* ± 44,43 91,53 P 2-1 < 0,05
Lô 3: Vĩ Ngân liều
63,36 g dược liệu/kg 10 240,40 ± 55,19 103,39
P3-1 > 0,05 P 3-2 > 0,05
Lô 4: Vĩ Ngân liều
190,08 g dược liệu/kg 9 268,89* ± 59,45 127,11
P4-1 < 0,05
P4-2 > 0,05 P4-3 > 0,05
Hình 3.7. Biểu đồ biểu thị thời gian tiềm tàng xuất hiện cơn ho ở chuột.
Nhận xét: Cao lỏng Vĩ Ngân ở mức liều 190,08 g dược liệu/kg có tác dụng kéo dài thời gian tiềm tàng xuất hiện cơn ho trên chuột nhắt trắng so với lô chứng với mức tăng 127,11%, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P ≤ 0,05).
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của cao lỏng Vĩ Ngân lên tổng số cơn ho. Lô chuột N Tổng số cơn ho trong 10 phút (X SE) Mức độ giảm số cơn ho so với lô
chứng (%)
P
Lô 1: Chứng 9 30,33 ± 6,30
Lô 2: Codein
phosphat 20mg/kg 9 9,33*± 3,75 69,24 P 2-1 < 0,05
Lô 3: Vĩ Ngân liều
63,36g dược liệu/kg 10 14,30* ± 3,34 52,85 PP 3-1 < 0,05
3-2 >0,05
Lô 4: Vĩ Ngân liều
190,08 g dược liệu/kg 9 7,00* ± 3,39 76,92 P4-1 = 0,05 P4-2 > 0,05 P4-3 > 0,05 30.33 9.33 * 14.30 * 7.00 * 0 5 10 15 20 25 30 35 40
Lô 1 Lô 2 Lô 3 Lô 4
Số lầ n h o Lô thí nghiệm
Hình 3.8. Biểu đồ biểu thị tổng số cơn ho ở chuột.
Nhận xét: Cao lỏng Vĩ Ngân ở cả 2 mức liều đều có tác dụng giảm số cơn ho ở chuột so với lô chứng. Mức giảm số cơn ho cao nhất ở lô chuột uống Vĩ Ngân liều 190,08 g dược liệu/kg là 76,92%. Sự giảm số cơn ho ở 2 mức liều có ý nghĩa thống kê (P ≤ 0,05).
3.3.2. Tác dụng long đờm:
- Lô 1 (chứng): uống nước cất với thể tích 20ml/kg/ngày.
- Lô 2 (đối chiếu): N-acetylcystein 120mg/kg (Gói 200 mg pha vừa đủ 30ml, uống 0,2 ml/10g).
- Lô 3: uống cao lỏng Vĩ Ngân liều 63,36g dược liệu/kg. - Lô 4: uống cao lỏng Vĩ Ngân liều 190,08g dược liệu/kg.
Cho chuột uống thuốc thử với liều như trên trong 3 ngày. Ngày thứ 3 (ngày cuối cùng) sau uống thuốc 1 giờ, tiêm màng bụng cho tất cả các chuột dung dịch phenol đỏ 0,25% với liều 25ml/kg. Sau 30 phút tiêm nhắc lại một liều như vậy.
Chờ 30 phút sau, giết chuột bằng gây ngạt hơi chloroform, bộc lộ khí quản và luồn vào đó một kim tù. Rửa khí quản bằng cách dùng bơm tiêm lấy 0,5ml dung dịch NaHCO3 5% bơm vào khí quản, hút nhẹ nhàng rồi chuyển vào trong một ống nghiệm đã được đánh dấu từ trước.
Làm như vậy 3 lần đối với mỗi con, tập trung dịch rửa của cùng một con trong một ống nghiệm (thể tích dịch rửa thu được của các chuột bằng nhau). Ly tâm dịch rửa lấy dịch trong. Đo độ hấp thụ quang (ABS) của dịch rửa khí quản ở bước sóng 265 nm.
Kết quả: Kết quả mật độ quang được trình bày trong bảng 3.10, hình 3.8.
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của cao lỏng Vĩ Ngân lên mật độ quang.
Lô chuột N Mật độ quang (X SE) Mức tăng mật độ quang (%) so với chứng P Lô 1: Chứng 10 0,406 ± 0,036
Lô 2: N-acetyl cystein
liều 120 mg/kg 10 0,528* ± 0,023
30,05 % P 2-1 < 0,05
Lô 3: Vĩ Ngân liều
63,36 g dược liệu/kg 10 0,447 ± 0,035
10,10 % P3-1 > 0,05 P 3-2 > 0,05
Lô 4: Vĩ Ngân liều
190,08g dược liệu/kg 10 0,664*** ± 0,015
64,28 %
P4-1< 0,001 P4-2 <0,001 P4-3 <0,001
Hình 3.9. Biểu đồ biểu thị mật độ quang ở bước sóng 265 nm.
Nhận xét:
Mức độ hấp thụ quang ở bước sóng 265 nm của dịch rửa phế quản ở lô chuột uống cao lỏng Vĩ Ngân liều 190,08g dược liệu/kg tăng 64,28 % so với lô chứng. Sự tăng mật độ quang có ý nghĩa thống kê (P < 0,001).
3.4. Bàn luận
3.4.1. Thành phần hóa học
Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học cho thấy trong cao lỏng có các thành phần cơ bản tương tự như thành phần của các vị thuốc, bao gồm: flavonoid, saponin, tanin, acid amin, polysaccharid, đường khử.
Như vậy, hai nhóm chất chính trong cao lỏng là flavonoid và saponin. Do đó, chúng tôi đã tiến hành chiết chọn lọc theo từng nhóm chất đối với các dược liệu chỉ có thành phần chính là một trong hai nhóm chất này, nhóm flavonoid: xạ can, núc nác; nhóm saponin: cát cánh, mạch môn, thiên môn. Phương pháp này tốn dung môi và nhiều công đoạn nhưng có ưu điểm là loại được nhiều tạp chất và các nhóm chất khác, vì vậy sẽ cho kết quả chính xác hơn. Đối với các dược liệu có cả hai thành phần trên là cam thảo, kim ngân hoa, chúng tôi đã tiến hành chiết không chọn lọc: dùng dung môi methanol, n-butanol để chiết nhiều thành phần có trong dược liệu và cao lỏng.
Trên sắc ký đồ của các dược liệu, ngoài các vết tương đương với cao lỏng còn xuất hiện nhiều vết khác, cụ thể: cát cánh có thêm 3 vết, thiên môn có thêm 4 vết, mạch môn có thêm 3 vết, huyền sâm có thêm 4 vết, núc nác có thêm 3 vết, xạ can có thêm 1 vết, cam thảo có thêm 4 vết, kim ngân hoa có thêm 3 vết do trong quá trình bào chế, một số thành phần trong dược liệu đã bị giảm hoặc mất đi. Ngoài ra một số vết xuất hiện giữa các dược liệu khá giống nhau (cát cánh, thiên môn, mạch môn) có thể do cấu trúc gần giống nhau giữa các thành phần trong cùng nhóm chất. Một số vết trong cao có màu đậm hơn hoặc nhạt hơn so với các vết tương ứng của dược liệu có thể do sự biến đổi các chất trong quá trình bào chế cao, chiết xuất dược liệu, lượng mẫu chấm.
Qua quá trình nghiên cứu và triển khai sắc ký lớp mỏng để xác định dấu vân tay của các vị thuốc, chúng tôi nhận thấy rằng, để có kết quả tốt thì cần phải thực hiện các bước khảo sát về khối lượng mẫu nghiên cứu cần dùng, hệ dung môi khai triển, lượng mẫu chấm trên bản mỏng, và tính lặp lại của kết quả. Từ các kết quả trên, chúng tôi đề xuất một số chỉ tiêu trong tiêu chuẩn kĩ thuật của cao lỏng như sau.
Bảng 3.8. Một số chỉ tiêu đề xuất trong tiêu chuẩn kĩ thuật của cao lỏng Vĩ Ngân. Chỉ tiêu định tính Yêu cầu
Phản ứng hóa học Flavonoid Phản ứng Cyanidin + Với FeCl3 +
Với kiềm (NaOH 10%,NH3) +
Phản ứng diazo hóa + Saponin Tạo bọt + Phản ứng Salkowski + Libermann- Burchard + Sắc ký lớp mỏng Cao- kim ngân hoa
Hệ dung môi: Toluen- CHCl3- aceton- HCOOH (8:5:7:0,2) Quan sát ở bước sóng 366nm Có 5 vết tương đương: Rf = 0,08; 0,25; 0,28; 0,32; 0,59 (màu xanh) Cao- cam thảo
Hệ dung môi: EtOAc– a.acetic băng-HCOOH- H2O (15:1:1:2) Quan sát ở bước sóng 254 nm Có 3 vết tương đương: Rf= 0,20; 0,28; 0,48 (màu đen) Cao - xạ can
Hệ dung môi: Toluen-EtOAc- HCOOH (5:6: 1,5)
Quan sát: phun TT KOH/EtOH
Có 2 vết tương đương: Rf= 0,55 (tím nhạt) Rf= 0,64 (nâu nhạt) Cao-
núc nác
Hệ dung môi: CHCl3 - EtOAc - HCOOH (2:2:1) Quan sát ở bước sóng 254 nm Có 3 vết tương đương: Rf= 0,13; 0,25; 0,75 (màu đen) Cao- huyền sâm
Hệ dung môi: CHCl3 – MeOH- HCOOH (9:1: 0,2)
Quan sát: TT vanilin sulfuric
Có 6 vết tương đương:
Rf= 0,05; 0,09; 0,18; 0,36; 0,42; 0,68 (đen, đen, xanh lá, nâu, xanh lá, hồng)
Cao- Saponin (cát cánh, thiên môn, mạch môn)
Hệ dung môi: Toluen-EtOA- HCOOH (5:5:1)
Quan sát: phun TT vanilin sulfuric
Cao-CC,TM: có 6 vết tương đương: Rf= 0,25; 0,40; 0,51; 0,73; 0,85; 0,95 (tím, xanh lá, tím, tím, tím, tím, tím)
Cao-MM: có 4 vết tương đương: Rf= 0,25; 0,51; 0,85; 0,95 (đều tím)
3.4.2. Tác dụng sinh học
Nguyên tắc tính liều
Liều bình thường: 1 bài thuốc 88g/người (50 kg)/ngày, tương đương với liều 1,76 g/kg/ngày đối với người. Theo tương đương sinh học, liều của chuột nhắt trắng gấp 12 lần người [26], do vậy liều bình thường của chuột là 21,12 g/kg/ngày, từ đó làm cơ sở cho tính liều thử tác dụng sinh học. Qua khảo sát ở một số mức liều khác nhau, chọn ra mức liều 63,36 và 190,08 g dược liệu/kg để thử tác dụng sinh học.
Tác dụng giảm ho
Codein có tác dụng giảm ho do ức chế trực tiếp trung tâm ho, nhưng làm khô và tăng độ quánh của dịch tiết phế quản. Dùng codein trong trường hợp ho khan gây khó chịu, mất ngủ và trong các chứng đau nhẹ và vừa. Đây là thuốc ho dùng khá phổ biến nên trong nghiên cứu, codein được chọn làm thuốc đối chứng trên mô hình gây ho bằng khí amoniac ở chuột nhắt trắng.
Các kết quả nghiên cứu cho thấy cao lỏng Vĩ Ngân liều 190,08g dược liệu/kg có tác dụng làm tăng thời gian tiềm tàng xuất hiện cơn ho và làm giảm số cơn ho của chuột nhắt trắng trên mô hình gây ho bằng amoniac.
Tác dụng long đờm
N- acetylcystein: Dùng làm thuốc tiêu chất nhày trong bệnh nhày nhớt, các bệnh lý hô hấp có đờm nhày quánh như trong viêm phế quản cấp hoặc mạn, làm thuốc giải độc khi dùng quá liều paracetamol. N- acetylcystein là một trong những thuốc long đờm sử dụng phổ biến nhất trên lâm sàng nên được chọn làm thuốc đối chứng trong mô hình thực nghiệm.
Các kết quả nghiên cứu cho thấy, cao lỏng Vĩ Ngân ở mức liều 190,08 g dược liệu/kg có tác dụng long đờm thông qua làm tăng nồng độ phenol đỏ trong dịch rửa khí phế quản chuột nhắt trắng.
Như vậy, cao lỏng Vĩ Ngân liều 190,08 g dược liệu/kg có tác dụng giảm ho và long đờm trên chuột nhắt trắng, tác dụng này phù hợp với tác dụng của các vị thuốc trong phương thuốc.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ