Sau khi tổng hợp xong được xác định độ tinh khiết bằng SKLM và đo nhiệt độ nóng chảy. Chất được đánh giá sơ bộ là tinh khiết nếu khi chạy trên hệ dung môi thích hợp thu được vết sắc ký là 1 vết gọn, rõ, không có vết phụ và nhiệt độ nóng chảy dao động trong khoảng hẹp.
2.3.3 Xác định cấu trúc
Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được dựa trên kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng phân tử (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H - NMR).
Phổ hồng ngoại (IR):
Được ghi tại Phòng Phân tích cấu trúc phân tử - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000-400cm-1. Mẫu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ khoảng 1: 200 rồi ép dưới dạng viên nén dưới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm [1, 2].
Phổ khối lượng phân tử (MS):
Được ghi theo phương pháp ESI trên máy LC/MS/MS-Xevo TQMS tại Phòng Phân tích phổ - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam .
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H - NMR):
Được ghi trên máy Brucker AV-500MHz tại Phòng Phân tích phổ - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3.4 Thử tác dụng sinh học
Thử tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm: được tiến hành theo phương pháp
khuếch tán trên thạch, thực hiện tại Bộ môn Vi sinh - Sinh học của Trường Đại học Dược Hà Nội.
Thử tác dụng gây độc tế bào ung thư: tại viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn
lâm Khoa học Việt Nam theo phương pháp phương pháp của Monks (1991). Hiện đang được áp dụng tại Viên nghiên cứu ung thư Quốc gia của Mỹ (NCI).
Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 3.1 Tổng hợp hóa học
Các chất được tổng hợp theo sơ đồ sau:
3.1.1 Tổng hợp acid 3-(benzo[d]imidazol-2-yl)propanoic (I)
+ Quy trình tổng hợp:
Hòa tan hỗn hợp gồm: 5,4g (0,05mol) 1,2-phenylen diamin và 30 ml xylen trong bình cầu 250mL. Thêm tiếp 10g (0,1mol) anhydrid succinic. Lắp sinh hàn và đun hồi lưu, kết hợp khuấy từ trong 3h.
Theo dõi phản ứng bằng SKLM với pha động n-BuOH:AcOH:H2O = 9:2:2,5. Xử lý, tinh chế: hỗn hợp phản ứng sau khi kết thúc được làm lạnh, gạn lấy tủa. Hòa tan tủa thu được trong 60ml HCl 1M (ở 600C). Làm lạnh, lọc lấy dịch qua phễu lọc Buchner. Dịch lọc được thêm 1g than hoạt, dùng đũa thủy tinh khuấy ở 600C trong 10 phút. Lọc qua phễu lọc Buchner, rửa 2 lần với 10ml nước nóng. Dịch lọc được đổ vào cốc có mỏ, làm lạnh và trung hòa dịch lọc bằng natri acetat đến pH= 6 thì xuất hiện tủa màu trắng. Để trong 12h để tủa hết sản phẩm. Lọc qua phễu lọc Buchner, rửa tủa 3 lần với 10ml nước lạnh, thu được 6,65g sản phẩm thô. Kết tinh lại sản phẩm trong EtOH 700, thu được tinh thể trắng, hình kim, nhẹ.
+ Kết quả:
Khối lượng: 7,03g (hiệu suất 74,0%).
Cảm quan: tinh thể màu trắng, hình kim, nhẹ.
T0nc: 229-2300C.
Rf = 0,64 (n-BuOH: AcOH: H2O = 9: 2: 2,5).
3.1.2 Tổng hợp acid 3-(5-nitro-1H-benzo[d]midazol-2-yl)propanoic (II) + Quy trình tổng hợp: + Quy trình tổng hợp:
Cho 10 ml dung dịch H2SO4 đặc vào bình cầu 1 cổ 100mL, làm lạnh bên ngoài bằng nước đá. Thêm 5,0 g (26,18 mmol) chất I, khuấy đều rồi thêm từ từ 2,5 ml dung dich HNO3 đặc (27,04 mmol), khuấy trong 2h ở nhiệt độ phòng. Theo dõi phản ứng bằng SKLM với pha động n-BuOH:AcOH:H2O = 9:2:2,5. Xử lý, tinh chế: đổ hỗn hợp phản ứng vào cốc có mỏ 250mL chứa 30 ml nước cất được làm lạnh bên ngoài bằng nước đá. Khuấy đều, thêm từ từ dung dịch
NaOH 30% đến pH= 4 -5, xuất hiện kết tủa. Để yên khoảng 30 phút. Lọc tủa, rủa bằng nước cất, sấy dưới đèn hồng ngoại thu được sản phẩm màu vàng. + Kết quả:
Khối lượng: 5,5 g (hiệu suất 89,1%).
Cảm quan: Chất rắn màu vàng.
T0nc= 143-1460C. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Rf = 0,75(n-BuOH: AcOH: H2O = 9: 2: 2,5)
3.1.3 Tổng hợp Ethyl 3-(5-nitro-1H-benzimidazol-2-yl)propanoat (III)
+ Quy trình tổng hợp:
Thêm 75ml EtOH tuyệt đối vào bình cầu 2 cổ 250mL, làm lạnh 0- 50C, vừa khuấy vừa thêm từ từ 1,00 ml (13,61mmol) SOCl2, sau đó thêm tiếp 3,0 g (12,71 mmol) chất II. Lắp sinh hàn, đun hồi lưu trong 3h. Sục khí N2 trong suốt quá trình phản ứng.
Theo dõi phản ứng bằng SKLM với pha động n-BuOH:AcOH:H2O = 9:2: 2,5. Xử lý: hỗn hợp phản ứng sau khi kết thúc được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm. Làm lạnh bằng đá, thêm 30ml nước lạnh và trung hòa bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa đến pH= 6-7 thì sẽ xuất hiện tủa màu vàng nhạt. Lọc thu tủa qua phễu Buchner. Rửa tủa 2 lần với 10ml nước, hút kiệt và sấy khô dưới đèn hồng ngoại.
+ Kết quả:
Khối lượng: 2,4 g (hiệu suất71,3 %).
Cảm quan: chất rắn màu vàng nhạt.
T0nc= 121-124oC.
3.1.4 Tổng hợp 3-(5-nitro-1H-benzo[d]imidazol-2-yl)propanehydrazid (IV)
+ Quy trình tổng hợp:
Hòa tan 2,0 g (7,60 mmol) chất III vào 20 ml ethanol tuyệt đối trong bình cầu 100mL. Sau đó, thêm 10 ml (103,1 mmol) hydrazin monohydat 50%. Lắp sinh hàn và đun hồi lưu kết hợp khuấy từ trong 5h.
Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dm pha động CHCl3:MeOH= 9:1. Xử lý, tinh chế: sau phản ứng hỗn hợp được mang cất quay chân không để
loại bớt ethanol, để nguội và thêm 10ml nước lạnh thấy xuất hiện kết tủa, lọc tủa bằng phễu lọc Buchner, rửa tủa hai lần bằng nước, mang sấy tủa dưới đèn hồng ngoại. Tinh chế bằng cách kết tinh lại trong EtOH 500.
+ Kết quả:
Khối lượng: 1,2 g (hiệu suất 63,4%).
Cảm quan: chất rắn màu vàng. Rf= 0,48 (n-BuOH:AcOH:H2O= 9: 2: 2,5). T0 nc=118-1210C. 3.1.5 Tổng hợp 5-(2-(5-nitro-1H-benzo[d]imidazol-2-yl)ethyl)-1,3,4-oxadiazol-2- thiol (V) + Quy trình tổng hợp:
Hòa tan 1,0g (4,02 mmol) 3-(5-nitro-1H-benzo[d]imidazol-2- yl)propanehydrazid (IV) vào 40 ml EtOH 960 trong bình cầu 100mL, thêm 0,23g (4,10 mmol) KOH. Sau đó cho từ từ 0,25ml (4,02 mmol) dung dịch CS2. Lắp sinh hàn đun hồi lưu trong 3h, sau đó tiếp tục khuấy ở nhiệt độ phòng qua đêm.
Theo dõi phản ứng bằng SKLM với pha động BuOH:MeOH:H2O= 10:1:3. Xử lý, tinh chế: thêm 10 ml H2O vào hỗn hợp sau phản ứng, sau đó dung dịch
này được trung hòa tới pH= 5-6 bằng dung dịch HCl 1M, xuất hiện kết tủa, tiếp tục khuấy 30 phút, lọc tủa sấy dưới đèn hồng ngoại. Tinh chế bằng kết tinh lại trong EtOH.
+ Kết quả:
Khối lượng: 0,96 g (hiệu suất 82,1%).
Cảm quan: chất rắn màu vàng tươi.
Rf= 0,76 (BuOH: MeOH: H2O= 10:1 :3). T0 nc= 271-2740C. 3.1.6 Tổng hợp N-(4-(4-(5-(2-(5-nitro-1H-benzo[d]imidazol-2-yl)ethyl)-1,3,4- oxadiazol-2-ylthio)butoxy)phenyl)acetamid (VIa) + Quy trình tổng hợp:
Hòa tan 0,2g ( 0,69 mmol) 5-(2-(5-nitro-1H-benzo[d]imidazol-2-yl)ethyl)- 1,3,4-oxadiazole-2-thiol (V) trong 10ml aceton, thêm 0,5g (3,6 mmol) bột K2CO3 khan. Khuấy hoạt hóa trong 1h, thêm tiếp 0,19 g ( 0,69 mmol) N-(4- bromobutoxy)phenyl acetamid. Lắp sinh hàn, sục khí N2 trong suốt quá trình phản ứng, đun hồi lưu trong 3h.
Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dm pha động CH2Cl2:MeOH=20:1. Xử lý, tinh chế: sau phản ứng mang lọc loại K2CO3, dịch lọc được cô chân
không loại bớt aceton, thêm 10ml H2O thấy xuất hiện kết tủa, khuấy thêm 30 phút, lọc tủa, sấy dưới đèn hồng ngoại. Tinh chế bằng cách kết tinh lại trong EtOH.
+ Kết quả:
Khối lượng: 0,25 g (hiệu suất 72,9%).
Cảm quan: chất rắn màu trắng hơi vàng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Rf= 0,23 (CH2Cl2:MeOH=20:1)
Tnc0= 290-2920C.
3.1.7 Tổng hợp 2-(benzylthio)-5-(2-(5-nitro-1H-benzo[d]imidazol-2-yl)ethyl)- 1,3,4-oxadiazol (VIb)
+ Quy trình tổng hợp:
Hòa tan 0,2g (0,69 mmol) chất V trong 10ml aceton, thêm 0,5g (3,6 mmol) bột K2CO3 khan. Khuấy hoạt hóa trong 1h, thêm 0,08ml (0,74 mmol) benzyl
clorid. Lắp sinh hàn, sục khí N2 trong suốt quá trình phản ứng, đun hồi lưu trong 2h.
Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dm pha động CH2Cl2:MeOH=20:1. Xử lý, tinh chế: sau phản ứng mang lọc loại K2CO3, dịch lọc được cô chân
không loại bớt aceton, thêm 10 ml H2O thấy xuất hiện kết tủa, khuấy thêm 30 phút, lọc tủa, sấy dưới đèn hồng ngoại. Tinh chế bằng cách kết tinh lại trong EtOH.
+ Kết quả:
Khối lượng: 0,21 g (hiệu suất 79,9%).
Cảm quan: chất rắn màu vàng nhạt. Rf= 0,42 (CH2Cl2:MeOH=20:1). Tnc0= 184-1860C. 3.1.8 Tổng hợp 2-((1H-benzo[d]imidazol-2-yl)methylthio)-5-(2-(5-nitro-1H- benzo[d]imidazol-2-yl)ethyl)-1,3,4-oxadiazol (VIc) + Quy trình tổng hợp:
Hòa tan 0,2g ( 0,69 mmol) chất V trong 7 ml DMF, thêm 0,5g (3,6 mmol) bột K2CO3 khan. Khuấy hoạt hóa trong 1h, thêm 0,16 g (0,69 mmol) 2- cloromethyl-5-nitro-1H benzo[d]imidazol. Lắp sinh hàn, sục khí N2 trong suốt quá trình phản ứng, đun hồi lưu trong 2,5h.
Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dm pha động CH2Cl2:MeOH=20:1. Xử lý, tinh chế: sau phản ứng mang lọc loại K2CO3, dịch lọc được cất quay
chân không loại bớt DMF,trong quá trình cất quay thêm EtOH nhiều lần,sau đó thêm 10 ml H2O thấy xuất hiện kết tủa, khuấy thêm 30 phút, lọc tủa, sấy dưới đèn hồng ngoại. Tinh chế bằng cách kết tinh lại trong EtOH.
+ Kết quả:
Khối lượng: 0,23 g (hiệu suất 71,4%).
Cảm quan: chất rắn màu vàng sậm.
Rf= 0,33 (CH2Cl2:MeOH=20:1).
3.1.9 Tổng hợp tác nhân thế
Trong đề tài có dùng 3 tác nhân thế là: N-(4-bromobutoxy)phenyl acetamid, benzyl clorid, 2-cloromethyl-5-nitro-1H-benzo[d]imidazol. Benzyl clorid là hóa chất có sẵn trong phòng thí nghiệm. 2 tác nhân còn lại được tổng hợp như sau:
Tổng hợp N-(4-bromobutoxy)phenyl acetamid:
Sơ đồ 3.2. Sơ đồ tổng hợp N-(4-bromobutoxy)phenyl acetamid
Cho 1,0 g (6,6 mmol) 4-acetylaminophenol phản ứng với 6,3 ml 1,4- dibromobutan (52,8 mmol) trong 30 ml acetonitril, xúc tác 5,46 g (39,6 mmol) K2CO3 ở 400C trong 5 h. Sau phản ứng loại loại bỏ K2CO3, cất chân không đến thể tích không đổi. Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi pha động cloroform:methanol = 9:1. Sau phản ứng cho n-hexan vào bình cất, khuấy thấy xuất hiện kết tủa, lọc tủa. Hòa tan tủa trong ethyl acetat, rửa bằng NaOH để loại hết 4- acetylaminphenol. Cất chân không loại ethyl acetat thu được sản phẩm là bột màu trắng.
Kết quả: - Khối lượng: 1,54 g (hiệu suất 81,54%).
- Cảm quan sản phẩm: bột màu trắng.
- Rf = 0,63 (hệ dung môi khai triển cloroform : methanol = 9:1). - To
nc = 99,50C – 1020C.
Tổng hợp 2-cloromethyl-5-nitro-1H-benzimidazol:
Giai đoạn 1: tổng hợp 2-cloromethyl benzo[d]imidazol
Cho 2,16g (0,02 mol) o-phenylendiamin đun hồi lưu 3h với 2,84g (0,03 mol)acid cloroacetic trong 20 ml acid HCl 4N. Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi pha động n-BuOH:AcOH:H2O = 9:2:2,5 Hỗn hợp sau phản ứng được thêm 20 ml nước, trung hòa một cách từ từ bằng dung dịch amonium hydroxyd tới pH=6-7, xuất hiện kết tủa, lọc tủa sấy bằng đèn hồng ngoại. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả:
- Cảm quan: chất rắn thu được có màu vàng.
- Khối lượng: 2,5 g (hiệu suất 76,3%).
- T0
nc = 143-145 0C
Giai đoạn 2: nitro hóa 2-cloromethyl benzo[d]imidazol
Cho 5 ml dung dịch H2SO4 đặc vào bình cầu 1 cổ 100mL, làm lạnh bên ngoài bằng nước đá. Thêm 2,0 g (12,06 mmol) sản phẩm ở trên, khuấy đều rồi thêm từ từ 1,2 ml dung dich HNO3 đặc (13,04 mmol), khuấy trong 3 h ở nhiệt độ phòng.Theo dõi phản ứng bằng SKLM với pha động n-BuOH:AcOH:H2O = 9:2:2,5. Đổ hỗn hợp phản ứng vào cốc có mỏ 100mL chứa 15 ml nước cất được làm lạnh bên ngoài bằng nước đá. Khuấy đều, thêm từ từ dung dịch NaOH 30% đến pH= 4 -5, xuất hiện kết tủa. Để yên khoảng 30 phút. Lọc tủa, rửa bằng nước cất, sấy dưới đèn hồng ngoại thu được sản phẩm màu vàng.
Kết quả:
- Khối lượng: 1,7g ( 76,2 hiệu suất %).
- Cảm quan: Chất rắn màu vàng.
- T0
Bảng 3.1. Kết quả tổng hợp hóa học Stt Chất Công thức hóa học R Cảm quan Hiệu suất (%) 1 I Tinh thể hình kim, trắng 74,0 2 II Chất rắn màu vàng 89,1 3 III Chất rắn màu vàng nhạt 71,3 4 IV Chất rắn màu vàng 63,4 5 V Chất rắn màu vàng tươi 82.1 6 VIa Chất rắn màu trắng vàng 72,9 7 VIb Chất rắn vàng nhạt 79,9 8 VIc Chất rắn vàng sậm 71,4
3.2 Kiểm tra độ tinh khiết
Các chất đã tổng hợp được kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM và đo nhiệt độ nóng chảy cụ thể là:
+ SKLM:
- SKLM được tiến hành trên bản nhôm tráng sẵn silicagel GF254 70-230 mesh, quan sát dưới đèn tử ngoại 254 nm.
- Dung môi hòa tan: EtOH.
- Hệ dung môi pha động: thích hợp tùy thuộc từng chất
+ Đo nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt: 8 chất sau khi tinh chế đều có dạng chất rắn, được sấy khô và đo nhiệt độ nóng chảy.
Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy của từng chất được trình bày trong bảng sau:
Bảng 3.2: Kết quả giá trị Rf và T0nc của các chất tổng hợp được
Stt Chất Hệ dung môi khai triển Rf T0nc (0C)
1 I n-BuOH:AcOH: H2O = 9: 2: 2,5 0,64 229-230 2 II 0,75 143-146 3 III CH2Cl2: MeOH= 20: 1 0,55 121-124 4 IV BuOH: AcOH: H2O= 9: 2: 2,5 0,48 118-121 5 V BuOH: MeOH: H2O= 10:1 :3 0,76 271-274 6 VIa CH2Cl2: MeOH = 20:1 0,23 290-292 7 VIb 0,42 184-186 8 VIc 0,33 143-145 Nhận xét:
Trên sắc ký đồ hiện ra 1 vết sản phẩm gọn, rõ, không có vết phụ khi soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm.
Nhiệt độ nóng chảy của các chất dao động trong khoảng hẹp 2÷3 0C. Sơ bộ kết luận được các chất tổng hợp được là tinh khiết.
Tiến hành đo phổ để xác định cấu trúc của các chất sản phẩm V, VIa, VIb, VIc.