ị . — ■ -
Thể nhân dòng
Hình 1.10: Kỹ thuật DNA tái tổ hợp
1.3.2. Tóm tắt quy trình sản xuất Asparaginase bằng công nghệ DNA táitổ hợp tổ hợp
Chỉ 10 năm sau khi được chứng mũứi về hoạt động phân giải Asparagin (1970), Asparaginase đã được nghiên cứu sản xuất bằng phương pháp tái tổ hợp gen ừên khắp thế giới. Hiện nay, chế phẩm Asparaginase thưong mại đều có nguồn gen tò Escherichia coli và Erwmia chrysanthemy vì chỉ có 2 loại vi
37
khuẩn này mới có Asparaginase đáp ứng trong điều trị. Hiện nay, các phòng thí nghiệm vẫn đang tiếp tục nghiên cứu tìm cách sản xuất tối uu.
Dưới đây là một mô hình sản xuất Asparaginase theo công nghệ DNA tái tổ hợp [40].
• Một số thông tin về nguyên liệu: [40]
• Chủng được sử dụng: E.coli kl2 W31 ỉ 0.
• Khái quát về bộ gene của E.coỉỉ kỉ2 W3110: Tổng số gene 4468 gene, số
gene mã hóa cho protein 4333, kích cỡ gene 4.646.332 base
• Gene mã hóa cho Asparaginase: AnsB, vị trí nằm trong khoảng từ gene 3.098.338 đến gene 3.099.384. Độ dài 1047 bp / 348 aa. yggM < +117 ansB +176 > yggN
• Cặp mồi sử dụng trong sequencing:
Forward: 5’ATAATG-CGTAGGGATCCCGTAACT3’ Reverse: 5 TGGCAATGGATCCGAGTCTGAAGT3 ’
• Enzyme giới hạn Bamlỉl
• Trình tự cắt: 5’...G'^GATCC...3’ 3’...C C TA G ^G ...5’
• Các enzyme: Tag DNA polymerase, T4 DNA ligase (Biolabs)
• Chủng Escherichia coli DH5, chủng Escherichia coli BL21 (DE3)
• Vector pGEX- 2T bao gồm các vị trí mã hóa cho gen lacl, lacZ, gen mã hóa cho protein GST gồm vùng gắn với ribosom, promoter tac, mã khởi đầu, mã kết thúc, vùng nhân dòng đa vị MCS, gen mã hóa cho Beta lactamase, điểm khởi đầu sao chép pBR322.
Hình 1.11 : Đặc điểm vector pGEX-2T Các bước sản xuất Asparaginase tái tổ hợp gồm:[40]
Cắt và khuyếch đại gen ansB từ bộ gen của E.coli W 3110 đã được chiết tách
Ả
Tạo vector pGEX 2T- ansB
|p ^ Q ĩọ n d ò n g ^ b ằ n ^ ế bào
Biểu lộ gen bằng tếj à o ^ ^ l i BL21 ‘ĩị
Hình 1.12: Các bước sản xuất Asparaginase
❖ Bước 1: Tạo vector tái tổ hợp pGEX-2T
• C ắt và khuỵếch đại gene sử dụng kỹ thuật PCR
xế bào được phá vỡ cấu trúc bằng các tác nhân như trixton X100,SBS,
39 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Protein kết tủa và được loại ra, DNA của tế bào tan trong dịch đệm và được thu lại.
Đoạn gene ansB sẽ được cắt ra và khuyếch đại bằng kỹ thuật Polymerase chain reaction (PCR). Tiến hành phản ứng PCR với enzyme chịu nhiệt Tag DNA polymerase, mồi và đệm thích hợp. Chu trình nhiệt PCR được áp dụng :
biến tính 94°c trong 1 phút -> 55 °c trong 1 phút -> Tổng họp DNA ở 72 °c
trong 2 phút. Quá trình thực hiện gồm 30 chu trình. Sau 30 chu trình, gene ansB đã được khuyếch đại lên nhiều lần. Sau đó enzym giới hạn BamHl với trình tự nhận biết đặc hiệu 5’...G ^G A TC C ...3’- 3’...C C TA G ^G ...5’ sẽ cắt DNA thành những vùng đầu dính, cho sản phẩm cắt dài khoảng 1,2 kb. Bước tiếp theo, các sản phẩm của quá trình PCR sẽ được chạy điện di để tách, lọc những đoạn DNA mang gene ansB.
• Cắt vector pGEX-2T bằng RE BamHl
Vector pGEX-2T là một plasmid thuộc họ pGEX. vector pGEX-2T mang các đặc điểm thuận lợi cho việc chuyển gene. Trên vector pGEX-2T có vùng chứa gene kháng ampicillin và vùng gen lacZ làm dấu hiệu nhận biết, vùng promoter tac được cảm ứng bởi IPTG sẽ gắn với ARN polymerase tăng hiệu suất tổng họp protein, vùng MCS cho phép chọn lựa enzyme giới hạn thích họp, vùng gene mã hóa cho protein GST sẽ cho sản phẩm kết hợp với protein cần biểu lộ tạo điều kiện tốt cho bước tinh chế protein.
Trên vector giới hạn pGEX-2T có điểm cắt của BamHl nằm ở vị trí 915 của vector trong vùng MCS. Như vậy, sử dụng vector pGEX-2T có thể cắt gene ansB nhưng đồng thời sản phẩm Asparaginase gắn với protein GST cho phép dễ dàng chiết tách Asparaginase dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa GST và thrombin.
❖ Tạo vector tái tổ hợp giữa vector pGEX-2T và gene ansB.
Gắn nối vector pGEX-2T đã mở vòng và gene ansB bằng T4 DNA ligase. Do khả năng xúc tác hình thành liên kết giữa nhóm 5’-phosphate và nhóm 3’- OH tự do nên enzyme T4 DNA ligase có thể gắn nối 2 phân tử DNA có đầu dính bổ sung nhau để tạo thành DNA tái tổ hợp [49].
❖ Bước 2: Chọn lọc các vector tái tổ hợp mang gen ansB
Biến nạp sản phẩm sau phản ứng gắn nối vào E.coli DH5 bằng phương pháp sock nhiệt.
Để tiến hanh nhân dòng plasmid, ngày nay thường hay sử dụng 3 chủng E.coli sau: DH5 alpha, Top 10 F' hoặc XI 1 blue. E.coli DH5 có hiệu suất chuyển đổi cao (trên 108-109 plasmid pUC19 được chuyển vào trong tế bào trong mỗi |ig plasmid) .Nhưng, E.coli DH5 lại không cho hiệu suất biểu hiện gene cao.
Vector tái tổ hợp pGEX-2T-ansB được biến nạp vào tế bào E.coli DH5
bằng phương pháp sock nhiệt. Dựa trên sự biến tính của thành tế bào dưới tác dụng của nhiệt độ và CaCli DNA chui vào trong tế bào. Sau 30 phút, tế bào sẽ biểu hiện gene kháng kháng sinh có trong plasmid ngoại lai [3]. Te bào được nuôi dưỡng sinh trưởng, nhờ vậy, vector tái tổ hợp pGEX-2T-ansB cũng được nhân bản một lượng lớn.
Việc sàng lọc ra tế bào đã dung nạp plasmid có chứa đoạn gene ansB dựa trên tính kháng kháng sinh ampicillin và khả năng chuyển hóa 5-bromo 4- cloro 3-indolyl |3-D-galactopyranoside (X-gal) của P-galatosidase của plasmid
pGEX-2T. Môi trường nuôi cấy E.colỉ DH5 sẽ gồm có kháng sinh ampicillin
và X-gal.
❖ Phương Dháp tách plasmỉd từ tế bào E.coli
Các tế bào mang plasmid sau khi nuôi cấy đến pha dừng thì được ly tâm thu lại. Thành và màng tế bào được phá vỡ bằng kiềm và chất tạo sức căng bề
41
mặt. Sau đó DNA hệ gene và protein được tủa lại bằng muối acetate kali và loại bỏ khỏi DNA plasmid bằng cách ly tâm. DNA plasmid được tủa lại bằng cồn[3].
• Phản ứng cắt kiểm tra một số mẫu plasmid bằng BamHl và sử dụng điện di để kiểm tra mẫu plasmid.
Quá trình trên được kiểm chứng bằng phưong pháp cắt đoạn plasmid bằng BamHl, sau đó đưa vào điện di kiểm tra đoạn plasmid có độ dài tương ứng như cũ. Nếu có, phản ứng thành công. Đe xác định rõ hơn về trình tự đoạn gene được đưa vào plasmid, người ta sử dụng kỹ thuật DNA sequencing.
*> Bước 3: Biểu hiện trên E.coli BL21(DE3)
Tế bào E.coli BL2Ỉ(DE3) thuộc chủng E.coli B, được xác định lần đầu tiên
vào năm 1946, có khả năng sản xuất protein tốt hơn chủng E.coli kl2 và là
loại E.coli được sử dung rộng rãi nhất để biểu lộ gene.
E.coli BL21 (DE3) có vùng hệ thống biểu hiện T7 promoter nên có khả
năng sản xuất nhiều protein. Đặc biệt, E.coli BL2I (DE3) biểu hiện các gene
có các promoter tac, try, Ằ,PL giúp cho việc biểu hiện các gene tốt hơn các (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
loại E.coli khác. Hơn nữa, BL21 thiếu 2 gene mã hóa cho lon và OmpT
protease. Protease ỉon là 1 loại protease nôị bào E.coli tạo ra đê phân hủy
protein dị thường. Nó sẽ phân hủy protein trước khi tế bào được dung giải.
OmpT là 1 loại protease ngoại bào đính trên bề mặt màng tế bào để E.coli
phân hủy protein ngoại bào. Nó sẽ phân hủy protein sau khi tế bào được dung giải. Vì vậy, hiệu suất quy trình được đảm bảo hon.
Biến nạp vector tái tổ họp vào tế bào Escherichia coli BL21 (DES)
bằng phương pháp sock nhiệt.
Plasmid pGEX-2T-ansB được khuyếch đại ở tế bào E.colỉ DH5 được
• Cảm ứng promoter để tế bào E.coli BL21 (DE3) biểu hiện ansB.
Nuôi cấy các thể biến nạp có vector tái tổ hợp mang gene trong môi trường có chất cảm ứng promoter là isopropylthio-P-galactoside (IPTG) để protein tái tổ họp có thể được tế bào chủ tổng hợp[49’.
❖ Một số nhận xét về sản xuất Asparaginase bằng công nghệ DNA tái tổ
hợp.
Quy trình sản xuất Asparaginase bằng công nghệ DNA tái tổ hợp cũng giống với sản xuất các protein tái tổ hợp khác (recombinant protein) gồm các bước cơ bản là tách DNA của tế bào vật chủ, cắt gene mã hóa cho protein, gắn gene vào plasmid thích hợp. Chuyển vector tái tổ họp vào các loại tế bào biểu hiện gene thích hợp. Tuy nhiên, điểm khác nhau cơ bản là lựa chọn vật chủ thích hợp. Loại thứ nhất là tế bào eukaryota, người ta chỉ sử dụng loại tế bào này làm vật chủ khi cần nghiên cứu về tác động đặc trưng cho kiểu tế bào eukaryota của protein bởi thao tác khó, sản lượng thấp hơn nhiều so với
prokaryota. Tế bào prokaryota, đặc biệt là Escherichia coli cho sản lượng cao,
dễ nuôi cấy và thao tác dễ dàng. Đối với sản xuất Asparaginase, đầu tiên vector plasmid-gene sẽ được cấy vào tế bào nhân dòng (competen cell) sau đó được chiết ra và dung nạp vào tế bào biểu hiện. Việc sử dụng các tế bào chuyên biệt đòi hỏi mất nhiều công sức và thời gian hơn tuy nhiên đạt được hiệu suất cao trong sản xuất.
43
CHƯƠNG 2: BÀN LUẬN
2.1. v ề ứng dụng trong điều trị ung thư bạch cầu cấp dòng lympho
Asparaginase lần đầu tiên được phát hiện bởi Lang (1904), sau đó 57 năm hoạt động tiêu diệt khối u của Asparaginase được Broome (1961) chứng minh. Vào những năm thập kỷ 70, Asparaginase bắt đầu được các nhà khoa học kết hợp với các tác nhân kháng ung thư khác trong giai đoạn điều trị thuyên giảm ALL. Asparaginase được kết hợp với các tác nhân kháng ung thư khác trong hóa trị liệu và thu được những kết quả khả quan tuy nhiên việc điều trị vẫn gặp phải các tác dụng không mong muốn nhất định.
2.1.1. ư u nhưọc điểm của Asparaginase trong hiệu quả điều trị ung thư bạch cầu cấp dòng lympho
• ưu điểm của Asparaginase
Asparaginase được kết hợp với các thuốc khác trong giai đoạn điều trị thuyên giảm. Trước đây, ở giai đoạn này các tác nhân hóa học cơ bản được sử dụng là: 1 tác nhân ức chế sự phân bào (Vincristin), 1 hormone liều cao để diệt tế bào ung thư và có thể thêm tác nhân ức chế tổng hợp DNA (Doxorubicin). Trong một nghiên cứu tiến hành với 499 bệnh nhân sử dụng Vincristin và Doxorubicin, số người thuyên giảm sau đợt điều trị là 86%.[44]
Kể từ những năm 70, Asparaginase được sử dụng kết hợp với các thuốc cơ bản và đem lại hiệu quả điều trị cao hơn, 90-95% trẻ em mới mắc lần đầu đạt thuyên giảm sau giai đoạn điều trị thuyên giảm [44]. ư u điểm của Asparaginase tiếp tục được khẳng định qua 1 nghiên cứu của Ertel (1979). Nhóm gồm 413 bệnh nhân ALL tái phát (trước đây chưa điều trị bằng Asparaginase và không còn đáp ứng với 6-Mercaptopurine) được điều trị bằng Asparaginase, liều điều trị từ 300 tới 12,000 lU/m^, dùng 3 lần 1 tuần, 6- Mercaptopurine được dùng đồng thời theo đường uống với tác dụng ức chế
miễn dịch. Kết quả : 9,5% bệnh nhân tái phát thuyên giảm sau đợt điều trị với liều 300IU W ; 35,1% với liều 3000 lU/m^ 53,5% với liều 6000 I ư W ;
62,5% với liều 12000 lu/m^. Đợt điều trị kéo dài 4 tuần, 3 lần 1 tuần. Chỉ
6,5% bệnh nhân gặp các phản ứng mẫn cảm.
Asparaginase không có hiện tượng kháng chéo với các tác nhân kháng ung thư khác nên có thể kết họp với các thuốc khác. Vì vậy, đối với bệnh nhân ALL tái phát, giai đoạn thuyên giảm điều trị dùng phác đồ 3 thuốc Vincristin và Prednisone và Asparaginase tỷ lệ thuyên giảm từ 30-75% tùy thuộc vào chế độ điều trị trước đây. Nếu thêm 1 Anthracyclin như Daunomycin, Doxorubin thì tỷ lệ thuyên giảm lên tới 80% đến 95%. Sau nghiên cứu này, Asparaginase đã được thêm vào phác đồ điều trị giai đoạn tấn công, kết hợp với Vincristin, Prednisone có thể có thêm 1 Anthracycline như Doxorubin. Hiệu quả của phác đồ kết hợp Asparaginase vào giai đoạn tấn công là hơn 90% trẻ em mới mắc thuyên giảm hoàn toàn.
Asparaginase được dùng theo đưòng IM đã được chứng minh hiệu quả tương đương với đường IV và ít gặp phản ứng dị ứng hơn. Mặc dù ở bệnh nhân ALL, số lượng tiểu cầu giảm đáng kể, tuy nhiên khi sử dụng Asparaginase qua đường IM, không xảy ra hiện tượng chảy máu [31].
• Nhược điểm của Asparaginase
Tuy là một thuốc hữu dụng trong điều trị, Asparaginase vẫn gây ra nhiều các phản ứng bất lợi khác, điển hình là ức chế tổng hợp protein, các phản ứng quá mẫn của cơ thể. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Asparaginase chủ yếu tấn công vào tế bào lymphoblast do thủy phân nguồn Asparagin ngoại bào, khiến những tế bào không thể tự tổng họp AsDaragin nàv bị mất đi nguồn nguyên liệu cho tổng hợp protein. Kết auả là chúng bị tiêu diệt. Tuy nhiên do thủy phân Asparagin trong huyết tương nên
45
một số mô có mức độ tổng hợp protein cao cũng bị ảnh hưởng, điển hình là gan.
Những tác dụng bất lợi trên gan vẫn chưa hoàn toàn giải thích được cơ chế. Một số hậu quả dẫn tới như giảm albumin huyết tương, tăng phophatase kiềm, tăng bilirubin huyết thanh, transaminase. Hầu hết các bệnh nhân đều giảm đáng kể cholesterol huyết thanh và lipoprotein trong khi dùng Asparaginase. Chức năng gan và mô nhanh chóng hồi phục sau khi ngừng thuốc. 2 trường hợp tử vong do gan nhiễm mỡ đã được NCI báo cáo. Tác dụng ức chế tổng hợp protein ở gan của Asparaginase dẫn tới giảm các yếu tố V,VII, VIII,IX và kéo dài thời gian prothrombin ,thromboplastin do giảm nồng độ fibrinogen trong máu. Những triệu chứng này mất đi nhanh chóng khi ngừng thuốc và lại xuất hiện nhanh chóng khi dùng lại.
Một tác dụng bất lợi đáng kể của Asparaginase là gây ra viêm, chảy máu tụy cấp với triệu chứng đau ở vùng bụng. NCI đã báo cáo có 4 trong 300 bệnh nhân chết do viêm tụy cấp. Mặt khác, Asparaginase ức chế tổng hợp insulin nên nồng độ insulin trong máu giảm, đường huyết tăng. Vì thế nên thận trọng đối với điều trị Asparaginase cho bệnh nhân tiểu đường.
Các phản ứng quá mẫn nhẹ như mày đay chiếm tỷ lệ khá cao. Nguyên nhân ban đầu được cho là nội độc tố vi khuẩn hay các thành phần khác của cơ thế vi sinh vật. Tuy nhiên, bệnh nhân sử dụng các dạng bào chế khác nhau của các hãng khác nhau đều xuất hiện các biểu hiện quá mẫn chung. Một số nghiên cứu cho thấy Asparaginase là nguyên nhân gây ra các phản ứng dị ứng này.
2.1.2. So sánh Asparaginase tự nhiên và Asparaginase được polyethylene glycol hóa
Asparaginase được nghiên cứu để chiết tách từ rất nhiều các cơ thể vi sinh vật nhưng chỉ có Asparaginase được chiết tách từ Escherichia coli và Erwinia
chrysanthemy có khả năng đáp ứng như một tác nhân kháng ung thư. Tuy nhiên, Asparaginase của 2 loại vi khuẩn này vẫn có rất nhiều các tác dụng không mong muốn và đôi khi nguy hiểm, đe dọa tính mạng.
Đe hạn chế tác dụng không mong muốn và và giảm liều, chế phẩm Asparaginase kết họp với Polyethylene glycol (Pegasparagase) đã được bào chế, nghiên cứu trong lâm sàng và điều trị. Pegaspargase được kết hợp với các đơn vị monomethoxypolyethylen glycol, có khối lượng 5000 Da. Sự kết hợp này dẫn đến giảm phản ứng dị ứng do hệ miễn dịch không nhận biết protein ngoại bào vì chúng được “che” bởi các phân tử PEG. Hơn nữa, Pegaspargase có khối lượng phân tử lớn hơn nên có thể kéo dài thời gian bán thải và thời gian tồn tại trong huyết tương.
Bảng 1.4: So sánh giữa 3 loại Asparaginase
'— ^ L o ạ i Asparaginase Đặc điểm ^ --- E.coli E. chry- santhemi 1 PEG- Asparaginase
Hoạt độ(IU/ mg protein) 280-400 650-700 280-400
Km(micromol) L-asparaginase 12 12 12 Km(micromol)L-glutaminase 3000 1400 3000 Tỷ lệ hoạt độ lớn nhất L-Gln/L-Asp 0,03 0,1 0,03
Khối lượn phân từ(Da) 141.000 138.000 146.000
Điểm đẳng điện 5,0 8,7 5,0
Thời gian bán thải(ngày) 0,6-1,0 0,5 6-7
Thời gian bị đào thải khỏi cơ thê (ngày)
BN không dị ứng vớiAsparaginase 7-10 5-7 14-35
BN dị ứng với Asparaginase 0 0 1-3