Từ 3 MT nuôi cấy bề mặt tốt nhất, chọn một MT lên men chìm tốt nhất.
Từ các dạng chủng và biến chủng thu đƣợc, lựa chọn chủng (biến chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất.
Tìm hệ DM khai triển có khả năng tách hỗn hợp kháng sinh tốt nhất. Tách, tinh chế kháng sinh từ dịch chiết DM hữu cơ.
2.2.4. Sơ bộ xác định một số t nh chất và cấu tr c của kháng sinh thu đƣợc.
Tiến hành đo phổ IR, phổ UV-VIS, phổ khối MS.
2.3. Phƣơng pháp thực nghiệm
2.3.1. Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn
Cấy zigzag xạ khuẩn trên ống thạch nghiêng có chứa MT nuôi cấy th ch hợp, ủ cho phát triển ở 28-29oC. Sau 6-10 ngày, xạ khuẩn đã phát triển tốt, cho các ống giống vào tủ lạnh bảo quản ở 2oC, định kỳ 3-6 tháng cấy chuyền.
2.3.2. Sơ bộ xác định hình thái xạ khuẩn theo ISP
Các môi trƣờng, ISP2, ISP3, đƣợc hấp tiệt khuẩn cho vào ống nghiệm (10 ml), mỗi môi trƣờng làm 4 ống nghiệm, đặt nghiêng.
Cấy zigzag bào tử Streptomyces 184.213 lên bề mặt thạch trong tủ vô tr ng. Để tủ ấm 28-290C. Quan sát sự phát triển của xạ khuẩn sau khi cấy 7, 14, 21 ngày. Đọc kết quả:
+ Màu khuẩn ty khí sinh: Quan sát bề mặt khuẩn lạc:Màu đ (R) , màu vàng (Y), xanh lá cây (G), xanh da trời (B), tím (V), xám (Gy), trắng (W). Trƣờng hợp có màu xen kẽ thì ghi màu liền nhau.
+ Màu khuẩn ty cơ chất: Quan sát mặt dƣới của ống nghiệm. Có thể có màu vàng nâu ánh đ hoặc da cam, vàng nâu, vàng nâu ánh xanh da trời hoặc tím, vàng nâu lẫn xanh lá cây. Nếu có các màu trên ghi ký hiệu (1), không ghi ký hiệu (0).
+ Dạng chuỗi bào tử : Thẳng (R), uốn cong (RF), móc câu (RA), lò xo (S).Bề mặt bào tử: phẳng nhẵn (sm), sần sùi mụn cơm (wa), có gai (sp), có tóc (ha). Quan sát bằng kính hiển vi có độ phóng đại cao.
+ Sắc tố hòa tan: Nằm ngay trong môi trƣờng nếu có màu đ , tím, vàng, xanh… thì k hiệu (1), không màu ghi ký hiệu (0).
uy n tắc: kháng sinh từ mẫu thử khuếch tán vào MT thạch dinh dƣỡng đã cấy VSV kiểm định, ức chế sự phát triển của VSV tạo thành vòng vô khuẩn.
iến h nh:
+Tạo hỗn dịch VSV: lấy một vòng que cấy VSV kiểm định cấy vào 2,5ml MT canh thang, ủ ở 37oC trong 18-24h (đối với vi khuẩn) để tạo thành hỗn dịch VSV có nồng độ 106-108 tế bào/ml.
+ Cấy hỗn dịch VSV vào MT thạch thƣờng đã tiệt tr ng và để nguội đến 45-50oC với tỷ lệ 2,5:100 (105 tế bào/1ml), lắc đều, đổ vào đĩa Petri vô tr ng với thể t ch 20ml/đĩa.
+ Đƣa mẫu thử vào MT kiểm định theo 1 trong 3 cách sau: - Phƣơng pháp khối thạch
- Phƣơng pháp khoanh giấy lọc - Phƣơng pháp giếng thạch
+Các đĩa Petri có mẫu thử đƣợc ủ trong tủ ấm 37oC trong 18-24h (đối với vi khuẩn). Mỗi mẫu đƣợc thử song song trên 3 đĩa với c ng một loại VSV kiểm định.
+Đánh giá kết quả: đo đƣờng k nh vòng vô khuẩn bằng thƣớc kẹp Palmer độ ch nh xác 0,02mm. Đánh giá kết quả dựa trên đƣờng k nh vòng vô khuẩn xử l theo công thức:
̅ = ∑ s = √∑ ̅
Trong đó:
̅ (mm): đƣờng k nh trung bình vòng vô khuẩn, (mm): đƣờng k nh vòng vô khuẩn thứ i, s: độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh,
n: số thực nghiệm tiến hành song song (thông thƣờng n = 3).
2.3.4. Xác định môi trƣờng nuôi cấy thích hợp
Mục đ ch: Tìm MT nuôi cấy và bảo quản chủng Streptomyces 184.213 ổn định và cho HTKS cao nhất.
Tiến hành: Streptomyces 184.213 đƣợc cấy trên 5 MT: MT1, MT2, MT5, MT6, MT7 trong hộp Petri, ủ ở 28ºC trong 6 ngày. Thử HTKS bằng phƣơng pháp khối thạch ( làm 3 mẫu song song), chọn MT có HTKS cao nhất.
2.3.5. Sàng lọc ngẫu nhiên
Pha hỗn dịch bào tử: Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 184.213 cho vào ống nghiệm chứa 10ml nƣớc vô tr ng, lắc cho bào tử phân tán đều, thu đƣợc hỗn dịch bào tử ở nồng độ pha loãng 10-1 (định ƣớc). Sau đó, pha loãng lần lƣợt đến nồng độ 10-6 bằng nƣớc vô tr ng.
Cấy bào tử: D ng pipet vô tr ng hút ch nh xác 0,1ml hỗn dịch bào tử ở các nồng độ pha loãng 10-6, 10-5, nh lên bề mặt thạch của MT2 trong đĩa Petri. D ng que chang dàn đều hỗn dịch bào tử lên trên bề mặt thạch. Tiến hành trên 3 đĩa cho mỗi nồng độ pha loãng. Cho các đĩa vào tủ ấm 28o
C ủ trong 6 ngày cho xuất hiện các khuẩn lạc mọc riêng rẽ.
Ph p chọn lọc ngẫu nhiên: sau 6 ngày chọn các khuẩn lạc phát triển đặc th , mọc riêng rẽ rồi lấy ra cấy zigzac, sau 6 ngày đem thử HTKS bằng phƣơng pháp khối thạch.
2.3.6. Đột biến
Pha hỗn dịch bào tử nhƣ phần sàng lọc ngẫu nhiên, đƣợc hỗn dịch bào tử ở nồng độ pha loãng 10-1 (định ƣớc).
Sau đó, d ng 1ml hỗn dịch bào tử này pha loãng đến nồng độ 10-6 để làm mẫu chứng, 9ml còn lại để đem đi đột biến.
Đột biến dƣới tác dụng của ánh sáng UV: 9ml hỗn dịch bào tử ở nồng độ 10-1
đựng trong đĩa Petri vô tr ng (không đậy nắp trên) đƣợc chiếu ánh sáng UV ( =254nm) với khoảng cách và thời gian th ch hợp (khoảng cách 60cm, thời gian 2-5 phút), sau đó lấy ra, để chỗ tối 2h, rồi d ng pipet vô tr ng pha loãng đến nồng độ 10-5
,10-4 bằng nƣớc vô tr ng.
Cấy các bào tử sau đột biến: d ng pipet vô tr ng hút ch nh xác 0,1ml mẫu chứng 10-6 và 0,1ml hỗn dịch đã đột biến ở các nồng độ 10-4 và 10-5 vào các đĩa Petri có chứa MT2, sau đó d ng que chang vô tr ng dàn đều giọt hỗn dịch bào tử trên
bề mặt thạch, mỗi nồng độ pha loãng làm 3 đĩa song song. Các đĩa Petri sau khi cấy đƣợc ủ ở nhiệt độ 28oC trong 6 ngày đến khi xuất hiện khuẩn lạc. Đếm các khuẩn lạc, xác định % độ sống sót theo công thức:
% độ sống sót = x 10-6 + k × 100% Trong đó:
Nm: trung bình số khuẩn lạc trong mẫu có nồng độ bào tử 10-k
, No: trung bình số khuẩn lạc trong mẫu chứng.
Tiến hành sàng lọc với các khuẩn lạc sau khi đột biến tƣơng tự nhƣ phần SLNN. Làm song song mẫu chứng. Phần trăm biến đổi hoạt t nh đƣợc xác định theo công thức:
% biến đổi hoạt t nh = ̅̅ x 100% Trong đó:
̅ : đƣờng k nh trung bình vòng vô khuẩn của biến chủng thứ i sau đột biến, ̅ : đƣờng k nh trung bình vòng vô khuẩn của mẫu chứng.
Sau đột biến, lựa chọn ra các biến chủng có tỉ lệ biến đổi hoạt t nh dƣơng cao nhất d ng cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.3.7. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh
Nguyên tắc: Xác định các MT nuôi chìm tối ƣu cho việc sản xuất kháng sinh, sử dụng giống cấp 1 để lên men gián đoạn trong các MTdt tƣơng ứng.
Tiến hành:
+ Tạo giống cấp 1: Chủng giống Streptomyces184.213 sau khi nuôi cấy trên thạch nghiêng đủ 6 ngày tuổi đƣợc cấy vô tr ng sang bình nón chứa 100ml MT2dt bằng 10ml nƣớc vô tr ng, lắc trên máy lắc tròn ở nhiệt độ 28oC ± 0,1oC, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 48h.
+ Lên men chọn môi trƣờng: sau 48h nhân giống, tiến hành lên men trên 3 MTdt khác nhau để chọn MT lên men tốt nhất. Giống cấp 1 đƣợc cấy vô tr ng sang bình nón 500ml chứa các MTdt với tỷ lệ Vgiống : Vmôi trƣờng = 1:10. Các bình lên men đƣợc lắc ở nhiệt độ 28oC ± 0,1oC, tốc độ 140 vòng/phút
trong 120h. Sau đó lọc hoặc ly tâm rồi thử HTKS bằng phƣơng pháp giếng thạch.
+ Lên men chọn chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất: các dạng chủng, biến chủng cần thử đƣợc nhân giống cấp 1 trên MT2dt, sau đó lên men trên môi trƣờng tối ƣu chọn đƣợc ở bƣớc trên.
2.3.8. Phƣơng pháp xác định độ bền nhiệt, độ bền pH của dịch kháng sinh
2.3.8.1. Xác định độ bền nhiệt
Lấy 3 ống dịch kháng sinh, mỗi ống 5-7 ml:
+ Ống 1: Để ở nhiệt độ thƣờng.
+ Ống 2: Đun sôi cách thủy 30 phút.
+ Ống 3: Đun sôi trực tiếp 10 phút
Sau đó, đem thử HTKS bằng phƣơng pháp giếng thạch.
2.3.8.2. Xác định độ bền pH
Lấy 5 ống nghiệm khoảng 5 ml dịch chiết kháng sinh.
Chỉnh pH trong 5 ống về pH 3, 5, 7, 9, 11 bằng NaOH 0,1N và HCl 0,1M. Thử HTKS sau 1 ngày và 5 ngày bằng phƣơng pháp giếng thạch. Trƣớc khi
thử, chỉnh về pH =7.
2.3.9. Phƣơng pháp chiết kháng sinh từ dịch lọc bằng dung môi hữu cơ.
Mục đ ch: xác định DM và pH chiết tối ƣu cho dịch lọc Tiến hành:
+ Dịch lọc sau khi loại b sinh khối thì chỉnh về pH= 3, 5, 7, 9, 11 bằng dung dịch NaOH 1N và HCl 1M.
+ Chuyển dịch lọc và DMHC vào bình gạn với tỷ lệ Vdung môi : Vdịch lọc = 1:5.
+ Lắc kỹ 1 -3 phút để 2 pha tiếp xúc tốt với nhau. Để yên 1- 1,5h cho phân lớp, sau đó gạn riêng lớp dung môi và nƣớc.
+ Thử HTKS của lớp DM và lớp nƣớc bằng phƣơng pháp khoanh giấy lọc.
2.3.10.Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc k lớp m ng
Pha hỗn hợp dung môi theo đúng tỷ lệ, cho vào bình sắc k (không quá 1cm), để bão hòa trong 30 phút.
D ng mao quản đƣờng k nh 0,5mm chấm dung dịch cần sắc k lên bản m ng, chấm nhiều lần, để khô tự nhiên.
Đặt bản m ng vào bình sắc k . Cho dung môi chạy lên khoảng 3/4 chiều dài bản m ng thì lấy ra, đánh dấu đƣờng DM chạy.
Xác định vết theo các phƣơng pháp sau:
+ Nhìn bằng mắt thƣờng (những vết có màu),
+ Soi đèn tử ngoại,
+ Hiện hình VSV: đặt bản m ng vào đĩa Petri đã tiệt tr ng, đổ một lớp vừa phải môi trƣờng thạch thƣờng đã cấy VSV kiểm định sao cho bản m ng chìm trong thạch. Để vào tủ 37oC, ủ trong 18-24h, vòng vô khuẩn xuất hiện nếu có kháng sinh.
T nh hệ số Rf :
Rf =
Trong đó: a: khoảng cách từ vạch xuất phát đến tâm vết
b: khoảng cách từ vạch xuất phát đến vạch dung môi.
2.3.11.Thu kháng sinh thô bằng phƣơng pháp cất quay.
Pha DMHC thu đƣợc sau khi chiết đƣợc cất quay bằng máy cất quay chân không Buchi WaterBath B480. Cạo lấy cắn, gom lại, vết đƣợc hòa tan bằng một lƣợng nh methanol, đổ gộp vào đĩa petri sạch, sấy ở 50ºC đến khô. Thu lấy kháng sinh thô, cân.
2.3.12.Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc k cột
Pha DM chạy theo đúng tỷ lệ.
Chuẩn bị cột: Cột đƣờng k nh 1cm, dài 50cm, rửa sạch, tráng cồn, sấy khô. Chất nhồi cột: Silicagel 60 F 254 Merck cỡ hạt 0,040-0,063 mm.
Cân khoảng 6g hạt, hoạt hóa ở 110oC trong 30 phút. Đem hòa 5 g với hệ dung môi chạy sắc k và đƣa lên cột.
Bột kháng sinh thô đƣợc hòa tan trong một lƣợng tối thiểu methanol, rồi trộn với 1g Silicagel đã hoạt hóa. Sấy ở 50oC cho bay hết methanol rồi cho lên cột. Ổn định cột trong 30 phút. Cho DM chạy qua cột với tốc độ 0,5ml/ phút. Lấy các phân đoạn vào ống nghiệm sạch, mỗi phân đoạn khoảng 1-5 ml.
Xác định các phân đoạn có chứa kháng sinh cần tách: thử HTKS các phân đoạn bằng phƣơng pháp khoanh giấy lọc. Các phân đoạn có HTKS đƣợc tiến hành sắc k lớp m ng với hệ DM tách tốt nhất. Các phân đoạn ch nh là các phân đoạn có những vết có Rf tƣơng đƣơng và có hoạt t nh kháng sinh mạnh.
2.3.13.Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu đƣợc.
Bột kháng sinh tinh khiết đƣợc đem đi đo các thông số: phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại, phổ khối để sơ bộ dự đoán cấu trúc kháng sinh.
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT
3.1. Sơ bộ xác định đặc điểm hình thái của Streptomyces 184.213( Hình p1,p2)
Quan sát trực tiếp bề mặt khuẩn lạc và quan sát chuỗi bào tử, bề mặt bào tử dƣới k nh hiển vi điện tử. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.1
Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái của Streptomyces 184.213
Đặc điểm Đặc trưn của Streptomyces 184.213
Màu khuẩn ty khí sinh Y( vàng)
Màu khuẩn ty cơ chất 1
Sắc tố hòa tan 1
Chuỗi bào tử SRF( uốn cong, lò xo)
Bề mặt bào tử Wa( sần sùi)
Hình ảnh chuỗi bào tử và bề mặt bào tử xạ khuẩn Streptomyces 184.213( sau 10 ngày nuôi cấy trên MT ISP 2) đƣợc giới thiệu ở hình p1và p2.
3.2. Kết quả xác định MT nuôi cấy th ch hợp: ( bảng 3.2)
Tiến hành nuôi cấy riêng rẽ Streptomyces 184.213 trên 5 MT riêng rẽ. Sau 6 ngày đem thử HTKS trên 2 chủng VSV kiểm định. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.2
Bảng 3. : Kết quả thử HTKS chọn MT nuôi cấy th ch hợp
Môi trƣờng B.subtilis P.mirabilis
̅ (mm) s ̅ (mm) s MT1 19,56 0,21 20,38 0,37 MT2 20,32 0,12 21,17 0,33 MT5 18,96 0,24 19,71 0,31 MT6 19,41 0,19 20,49 0,43 MT7 19,48 0,33 20,31 0,41
Nhận xét: Chọn MT2 là MT nuôi cấy và bảo quản chủng Streptomyces 184.213 cho các nghiên cứu tiếp.
3.3. Kết quả thử HTKS sau SLNN
Thử HTKS của 33 dạng chủng thu đƣợc sau sàng lọc ngẫu nhiên bằng phƣơng pháp khối thạch. Kết quả ch nh đƣợc trình bày ở bảng 3.3:
Bảng 3.3: Kết quả HTKS sau SLNN STT Dạng chủng B.subtilis P.mirabilis ̅ (mm) s ̅ (mm) s 1 01 17,13 0,21 18,67 0,37 2 03 19,29 0,12 21,17 0,33 3 04 21,15 0,24 22,71 0,31 4 09 21,39 0,19 22,69 0,43 5 17 19,67 0,33 20,61 0,41 6 19 18,49 0,83 20,03 0,13 7 20 21,09 0,53 22,37 0,53 8 24 20,71 0,42 22,27 0,52 9 28 21,49 0,93 22,82 0,65 10 33 21,24 0,83 22,36 1,63 Nhận xét: Sau SLNN, HTKS dạng chủng 04, 09 có HTKS cao nhất. Các dạng
chủng này đƣợc cấy giữ lại giống để tiến hành nghiên cứu tiếp theo.
3.4. Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 1.
Đem đột biến chủng SLNN 09 bằng ánh sáng UV theo 2.3.6, thời gian 3.5 phút, tỷ lệ sống sót là 0,21%
Thử HTKS các biến chủng sau đột biến bằng phƣơng pháp khối thạch. Kết quả ch nh đƣợc trình bày ở bảng 3.4
Bảng 3.4: Kết quả thử HTKS sau đột biến UV lần 1 STT Biến chủng B.subtilis P.mirabilis ̅ (mm) s % biến đổi hoạt tính ̅ (mm) s % biến đổi hoạt tính 1 ĐB 1.2 21,58 0,25 100,9 22,86 0,34 100,8 2 ĐB 1.4 22,04 0,37 103,1 23,12 0,27 102,8 3 ĐB 1.6 22,64 0,26 105,9 23,38 0,46 107,8 4 ĐB 1.9 22,44 0,35 104,9 22,88 0,62 100,9 5 ĐB 1.11 22,96 0,14 107,3 24,68 0,42 110,6 6 ĐB 1.14 22,34 0,51 104,4 22,86 0,64 100,8 7 ĐB 1.17 20,66 0,19 96,6 22,36 1,01 98,6 8 ĐB 1.25 22,14 0,43 103,6 23,28 0,28 102,6 9 ĐB 1.28 21,1 0,36 98,6 22,08 0,22 97,3 10 ĐB 1.31 21,27 0,72 99,4 23,03 1,05 101,5 Chứng 21,39 0,19 100,00 22,69 0,43 100,00
Nhận xét: Sau ĐB1 HTKS biến chủng ĐB 1.6, ĐB 1.11 có HTKS cao nhất. Các
biến chủng này đƣợc cấy giữ lại giống tiến hành nghiên cứu tiếp theo.
3.5. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2
Tiến hành: Tiến hành ĐB các bào tử của biến chủng ĐB 1.11 sau đột biến lần 1 bằng ánh sáng UV, bƣớc sóng 254 nm, trong thời gian 2,5 phút , tỷ lệ sống sót là 0,19%
Kết quả: Kết quả HTKS của 10 biến chủng sau ĐB2 và mẫu chứng bằng phƣơng pháp khối thạch đƣợc giới thiệu ở bảng 3.5
Bảng 3.5: Kết quả thử HTKS sau đột biến UV lần 2
STT Biến chủng B.subtilis P.mirabilis ̅ (mm) s % biến đổi hoạt tính ̅ (mm) s % biến đổi hoạt
tính 1 ĐB 2.2 22,48 0,57 97,9 24,66 0,23 99,9 2 ĐB 2.6 23,04 0,33 100,3 24,82 0,38 100,6 3 ĐB 2.4 23,46 0,49 102,2 24,84 0,29 100,6 4 ĐB 2.7 22,92 0,51 99,8 23,96 0,40 97,1