2 3 Tổng hợp hóa học
Tổng hợp N-(2-(4-((2,4-dioxothiazolidin-5-yliden)methyl)phenoxy)ethyl) benzensulfonamid (4a) và một số dẫn chất có công thức cấu tạo dƣới đây:
N H O NH S O O S R O O 4a. R = H, 4b. R = 2-Cl, 4c. R = 3-Cl 4d. R = 4-Cl, 4e. R = 4-OCH3, 4f. R = 4-CH3 N-(2-(3-((2,4-dioxothiazolidin-5-yliden)methyl)phenoxy)ethyl)-2-cloro benzensulfonamid (4b). N-(2-(3-((2,4-dioxothiazolidin-5-yliden)methyl)phenoxy)ethyl)-3-cloro benzensulfonamid (4c). N-(2-(3-((2,4-dioxothiazolidin-5-yliden)methyl)phenoxy)ethyl)-4-cloro benzensulfonamid (4d). N-(2-(3-((2,4-dioxothiazolidin-5-yliden)methyl)phenoxy)ethyl)-4-methoxy benzensulfonamid (4e). N-(2-(3-((2,4-dioxothiazolidin-5-yliden)methyl)phenoxy)ethyl)-4-methyl benzensulfonamid (4f).
2.3.2. Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết và khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp
Kiểm tra độ tinh khiết. Khẳng định cấu trúc.
2.3.3. Th tác dụng inh học của các chất tổng hợp được
Tác dụng ức chế HDAC của tế bào ung thƣ đại trực tràng. Tác dụng độc trên tế bào ung thƣ đại trực tràng.
2.4.Phƣơng pháp nghiên cứu
2 4 Phương pháp tổng hợp hóa học và kiểm tra độ tinh khiết
Tổng hợp 6 dẫn chất 4a-f bằng phƣơng pháp hóa học.
Dùng phƣơng pháp kết tinh lại để tinh chế sản phẩm thu đƣợc. Dùng TLC để theo dõi quá trình tiến triển của phản ứng.
Kiểm tra sơ bộ độ tinh khiết của sản phẩm bằng TLC và đo nhiệt độ nóng chảy.
2 4 2 Phương pháp khẳng định cấu trúc
Các chất tổng hợp đƣợc khẳng định cấu trúc bằng các loại phổ sau: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hƣởng từ proton (1H-NMR), phổ cộng hƣởng từ carbon (13C-NMR).
Phổ hồng ngoại (IR): đƣợc ghi tại khoa Hóa, trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Hà nội trên máy GX - Perkin Elmer -USA với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000 - 500cm-1. Các mẫu rắn đƣợc phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ 1/200 rồi ép dƣới dạng phim mỏng dƣới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm.
Phổ khối (MS): đƣợc ghi tại khoa Hóa, trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Hà nội trên máy LTQ Orbitrap XLTM
và viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam trên máy Agilent 6310 Ion Trap với chế độ ESI.
Phổ 1H-NMR và 13C-NMR: đƣợc ghi trên máy Bruker Avence – 500MHz tại viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam sử dụng DMSO làm dung môi, chất chuẩn nội là tetramethylsilan (TMS).
2 4 3 Phương pháp th tác dụng inh học
2.4.3.1. Thử tác dụng ức chế HDAC
Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp đƣợc đánh giá gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3, H4 trong tế bào ung thƣ đại tràng SW620. Phân tích dựa trên Western Blot có thể khẳng định đƣợc tác dụng của các mẫu thử làm tăng hoặc giảm sự acetyl hóa histon H3, H4 khi so sánh với mẫu trắng.
Nguyên liệu và nuôi cấy tế bào:
Các tế bào ung thƣ đại tràng (SW620) đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng RPMI (bổ sung L-glutamin, 10% huyết thanh bào thai bò FBS (fetal bovine serum)), gọi là môi trƣờng nuôi cấy hoàn chỉnh (complete medium). Tất cả các tế bào đƣợc ủ ở 37oC với 5% (w/v) CO2 và 95% (w/v) không khí.
Trƣớc khi sử dụng, các mẫu thử nghiệm dạng bột đƣợc hòa tan trong DMSO để tạo dung dịch gốc nồng độ 10 mg/mL. Các dung dịch gốc sau đó đƣợc pha loãng bằng môi trƣờng nuôi cấy hoàn chỉnh để tạo các dung dịch làm việc ở nồng độ 10μg/mL.
Phân lập histon và Western Blot
Tế bào SW620 (khoảng 1 x 106) đƣợc ủ với mẫu thử trong 24 giờ, song song làm mẫu trắng (mẫu tế bào không ủ với mẫu thử). Sau đó, các tế bào đƣợc xử lý và rửa bằng dung dịch nƣớc muối sinh lý có đệm phosphat.
Tiếp theo, tế bào đƣợc dung giải trong dung dịch dung giải đệm (20 mM Tris-HCl (pH 7,5); 150mM NaCl; 1mM Na2EDTA; 1mM EGTA; 1% triton; 2,5% Na pyrophosphate; 1 mM β-glycerophosphat; 1mM Na3VO4; 1 μg/mL leupeptin), ủ trong đá 15 phút. Hỗn dịch đƣợc ly tâm và phần dịch đƣợc thu hồi để tiến hành điện di trên gel.
Histon đƣợc điện di qua gel SDS-PAGE 10% và chuyển vào màng PVDF. Các màng đƣợc ủ qua đêm cùng kháng thể 1 là kháng acetyl histon H3, kháng acetyl histon H4 (milipore), tiếp theo ủ với kháng thể 2 là kháng thể IgG thỏ liên hợp peroxidase của ngựa trong 2 giờ.
Các dải có phản ứng dƣơng tính đƣợc phát hiện nhờ sự phát quang đã đƣợc tăng cƣờng. Các thí nghiệm đƣợc làm lặp lại ít nhất 3 lần một cách độc lập.
2.4.3.2. Thử độc tính tế bào
Thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ (độc tính tế bào) in vitro đƣợc thực hiện tại khoa Dƣợc, trƣờng Đại học Quốc gia Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc theo phƣơng pháp MTT và giá trị IC50 đƣợc tính trên phần mềm GraphPad Prism.
Dòng tế bào thử nghiệm: SW620 (tế bào ung thƣ đại tràng). Dòng tế bào ung thƣ đƣợc sử dụng từ Ngân hàng tế bào ung thƣ của Viện nghiên cứu sinh học và công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) và đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng DMEM (Dulbecco s minimum essential medium) hoặc môi trƣờng RPMI 1640 bổ sung 10% FBS (huyết thanh bào thai bò).
Độc tính tế bào của các chất đƣợc thử bằng phƣơng pháp MTT theo các bƣớc sau:
Bƣ c 1: Chu n bị
Các tế bào ở pha logarit đƣợc tripsin hóa và phân tán vào hỗn dịch đơn tế bào trong môi trƣờng DMEM hoặc RPMI bổ sung 10% FBS. Điều chỉnh nồng độ khoảng 1,5.104 đến 3,5.104 tế bào, sau đó chia đều vào các giếng của đĩa 96 giếng, mỗi giếng 200µl, các đĩa sau đó đƣợc ủ ở 37oC trong điều kiện 5% CO2.
Sau 24 giờ ủ, các mẫu thử đƣợc chuẩn bị trong 20 µL môi trƣờng DMEM/RPMI bổ sung 10% FBS từ dung dịch gốc 10 mg/ mL trong dimethyl sulfoxid (DMSO) rồi thêm 2 µL mẫu thử vào các giếng ở nhiều nồng độ khác nhau. Các đĩa này sau đó đƣợc ủ thêm 48 giờ. Tất cả các mẫu đƣợc chuẩn bị sau cho nồng độ cuối cùng của DMSO không quá 0,1%.
Bƣ c 2: Tiến hành thử
Sau 48 giờ ủ, thêm vào mỗi giếng 20 µL thuốc nhuộm MTT (nồng độ MTT 5 mg/ mL trong muối đệm phosphat – PBS). Các đĩa đƣợc ủ thêm 3 giờ ở 37oC trong điều kiện 5% CO2. Tiếp theo mỗi giếng đƣợc cho 100 µL dung dịch DMSO, để 5 phút cho MTT formazan đƣợc hòa tan. Độ hấp thụ đƣợc đọc ở bƣớc sóng 510 nm.
Bƣ c 3: Tính kết quả
Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu thử mà ở đó, độ hấp thụ giảm đi 50% so với nhóm chứng (trắng âm tính là giếng chỉ thêm môi trƣờng nuôi cấy): kết quả cuối cùng là giá trị trung bình của 4 lần đo độc lập với giá trị độ hấp thụ khác nhau không quá 5%. Giá trị IC50 đƣợc tính dựa trên phần mềm GraphPad Prism.
Trong phƣơng pháp thử này, IC50 20 µg/ ml đƣợc coi là có hoạt tính.
Tác dụng ức chế PTP1B đƣợc đánh giá trên mô hình in vitro. Đƣợc thực hiện tại bộ môn Dƣợc lý, trƣờng Đại học Dƣợc Hà nội.
Nguyên vật liệu
Mẫu thử: 6 chất tổng hợp 4a-f.
Bộ kít định lƣợng PTP1B do hãng Biomol International L.P (Mỹ) cung cấp. Trong đó, bao gồm enzym PTP1B, cơ chất IR5, BIOMOL Red Reagent và các dung dịch đệm cần thiết khác.
Tiến hành
Dựa vào phản ứng dephosphoryl phân tử tyrosin đã đƣợc phosphoryl hóa (pTyr1158) trong tiểu đơn vị của receptor của insulin (IR) khi có mặt protein tyrosin phosphatase 1B (PTP1B). Phần phosphat tự do (Pi) tạo ra từ phản ứng này đƣợc định lƣợng dựa trên phản ứng giữa xanh malachit, ammonium molybdat và Pi trong môi trƣờng acid (phƣơng pháp định lƣợng xanh Malachit kinh điển: classic malachite green reagent) tạo xanh malachit phosphomolybdat. Định lƣợng xanh malachit phosphomolybdat tạo thành bằng phƣơng pháp đo quang ở bƣớc sóng 620 nm. Lƣợng xanh malachit phosphomolybdat tạo thành tỷ lệ thuận với lƣợng phosphat tự do (Pi) có trong hỗn hợp phản ứng.
Tính kết quả
Tỷ lệ phần trăm ức chế hoạt động của PTP1B đƣợc tính theo công thức:
Trong đó: I là tỷ lệ phần trăm ức chế hoạt động của enzym.
Achứng = mật độ quang của lô chứng - mật độ quang của lô chứng trắng Athử = mật độ quang của lô mẫu thử
`CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Hóa học
3.1.1. Tổng hợp các dẫn chất
Nhân thiazolidin-2,4-dion đƣợc tổng hợp theo sơ đồ sau:
Cl OH O H2N NH2 S NH O O + i S
Các dẫn chất TZD đƣợc tổng hợp theo sơ đồ chung dƣới đây:
S Cl O O S N H O O Br S N H O O O iii iv S N H O O O
1a-f 2a-f 3a-f
4a-f NH S O O R R R R CHO ii 4a. R = H, 4b. R = 2-Cl, 4c. R = 3-Cl 4d. R = 4-Cl, 4e. R = 4-OCH3, 4f. R = 4-CH3 Hình 3.1. Sơ đồ tổng hợp các dẫn chất 4a-f
Ghi chú: i) HCl, H2O, hồi lưu, 2h; ii) 2-bromoethanamin, DMF, TEA, 25oC, 24h; iii) p-hydroxybenzaldehyd, MeOH, K2CO3, hồi lưu, 24h; iv) thiazolidin-2,4-dion, EtOH, piperazin, 80oC, 24h. 3.1.1.1. Tổng hợp thiazolidin-2,4-dion Sơ đồ phản ứng: Cl OH O H2N NH2 S NH S NH O NH O O + - H2O - HCl + HCl; + H2O - NH4Cl S Tiến hành phản ứng:
Cho 9.45g (0.1mol) acid monocloroacetic và 7.6g (0.1mol) thioure vào bình cầu dung tích 500ml. Thêm 100ml nƣớc cất, lắp sinh hàn, đun hồi lƣu bằng bếp điện có áo bọc. Sau khi dung dịch sôi khoảng 1h, rót tiếp 10ml HCl 10% qua sinh
hàn vào bình cầu. Tiếp tục hồi lƣu thêm 2h nữa. Kiểm tra phản ứng bằng TLC với pha động DCM : MeOH : AcOH = 90 : 10: 1.
Xử lý hỗn hợp phản ứng:
Rót hỗn hợp phản ứng vào cốc có mỏ, để vào tủ lạnh, sẽ xuất hiện các tinh thể. Để kết tinh lạnh trong 24h. Lọc tủa qua phễu lọc Buchner, rửa 2 lần với 50ml nƣớc cất lạnh.
Tẩy màu: chất rắn sau khi thu đƣợc, đƣợc hòa tan trong 50ml nƣớc nóng, thêm 50mg than hoạt, dùng đũa thủy tinh khấy nóng 10 phút. Lọc qua phễu lọc Buchner, rửa 2 lần với 10ml nƣớc nóng. Dịch lọc thu đƣợc đổ vào cốc có mỏ, để vào tủ lạnh trong 24h. Sản phẩm sẽ kết tinh, màu trắng ánh vàng. Lọc dung dịch qua phễu lọc Buchner, rửa tủa 3 lần với 10ml nƣớc lạnh. Thu đƣợc TZD
Kết quả Khối lƣợng TZD: 8.4g Cảm quan: màu trắng ánh vàng. Hiệu suất: 72% Nhiệt độ nóng chảy: 124.5-126.2oC. 3.1.1.2. Tổng hợp N-(2-bromoethyl)benzensulfonamid và dẫn chất (2a-f) Sơ đồ tổng hợp: S Cl O O + H2N Br S N H Br O O 1a-f 2a-f R R a. R = H, b. R = 2-Cl, c. R = 3-Cl d. R = 4-Cl, e. R = 4-OCH3, f. R = 4-CH3 TEA DMF, 25oC, 24h a.Tổng hợp N-(2-bromoethyl)benzensulfonamid (2a) - Tiến hành phản ứng:
Cho 0.3ml benzensulfoclorid (1a) (d=1.184g/ml) tƣơng đƣơng với 2mmol và 2ml DMF vào bình cầu dung tích 50ml, làm lạnh dung dịch bằng nƣớc đá. Thêm 450mg (2.2 mmol) 2-bromoethanamin vào bình cầu. Tiếp tục thêm từ từ 0.6ml TEA, lắc đều trong hỗn hợp nƣớc đá sao cho màu của dung dịch không đƣợc đậm lên. Phản ứng đƣợc tiến hành trong nhiệt độ phòng, kết hợp khuấy từ 200
vòng/phút, thời gian 24h. Kiểm tra phản ứng bằng TLC với pha động DCM : MeOH = 40 : 1.
- Xử lý phản ứng:
Thêm dần 10ml dung dịch nƣớc lạnh, tiếp tục acid hóa với 10ml dung dịch HCl 5% (kiểm tra bằng giấy quỳ vạn năng). Chiết thu sản phẩm 3 lần bằng dung môi dicloromethan, mỗi lần 5-10ml dung môi. Thu lớp dung môi, làm khan bằng Na2SO4. Gộp dịch chiết của 3 lần. Cất quay thu hồi dung môi bằng máy cất quay chân không ở 40oC đến khi thu đƣợc sản phẩm. Sấy sản phẩm ở 60oC trong 4h. Thu đƣợc chất 2a. - Kết quả: Khối lƣợng chất 2a: 0.39g. Cảm quan: màu trắng ngà. Hiệu suất: 75%. Nhiệt độ nóng chảy: 145-1470C. b.Tổng hợp N-(2-bromoethyl)-2-clorobenzensulfonamid (2b) Dẫn chất 2b đƣợc tổng hợp từ 0.42g (2mmol) 2-clorobenzensulfoclorid (1b) và 450mg (2.2mmol) 2-bromoethanamin. Quá trình tiến hành phản ứng và xử lý tƣơng tự nhƣ tổng hợp dẫn chất 2a. Phần xử lý: sau khi cho HCl 5%, xuât hiện tủa màu trắng. Lọc tủa bằng phễu thủy tinh và sấy khô. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Khối lƣợng dẫn chất 2b: 0.44g. Cảm quan: màu trắng đục Hiệu suất: 74%. Nhiệt độ nóng chảy: 146-1470 C. c.Tổng hợp N-(2-bromoethyl)-3-clorobenzensulfonamid (2c) Dẫn chất 2c đƣợc tổng hợp từ 0.42g (2mmol) 32-clorobenzensulfoclorid (1c) và 450mg (2.2mmol) 2-bromoethanamin. Quá trình tiến hành phản ứng và xử lý tƣơng tự nhƣ tổng hợp dẫn chất 2a. Phần xử lý: sau khi cho HCl 5%, xuât hiện tủa màu trắng. Lọc tủa bằng phễu thủy tinh và sấy khô. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Khối lƣợng dẫn chất 2c: 0.43g. Cảm quan: màu trắng đục
Hiệu suất: 73%.
Nhiệt độ nóng chảy: 145-1470C.
d.Tổng hợp N-(2-bromoethyl)-4-clorobenzensulfonamid (2d)
Dẫn chất 2d đƣợc tổng hợp từ 0.42g (2mmol) 4-clorobenzensulfoclorid (1d) và 450mg (2.2mmol) 2-bromoethanamin. Quá trình tiến hành phản ứng và xử lý tƣơng tự nhƣ tổng hợp dẫn chất 2a. Phần xử lý: sau khi cho HCl 5%, xuât hiện tủa màu trắng. Lọc tủa bằng phễu thủy tinh và sấy khô. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Khối lƣợng dẫn chất 2d: 0.42g. Cảm quan: màu trắng đục Hiệu suất: 71%. Nhiệt độ nóng chảy: 145-1480 C. e.Tổng hợp N-(2-bromoethyl)-4-methoxybenzensulfonamid (2e) Dẫn chất 2e đƣợc tổng hợp từ 0.42g (2mmol) 4-methoxybenzensulfoclorid (1d) và 450mg (2.2mmol) 2-bromoethanamin. Quá trình tiến hành phản ứng và xử lý tƣơng tự nhƣ tổng hợp dẫn chất 2a. Phần xử lý: sau khi cho HCl 5%, xuât hiện tủa màu trắng. Lọc tủa bằng phễu thủy tinh và sấy khô. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Khối lƣợng dẫn chất 2e: 0.48g. Cảm quan: màu trắng. Hiệu suất: 82%. Nhiệt độ nóng chảy: 153-1550C. f.Tổng hợp N-(2-bromoethyl)-4-methylbenzensulfonamid (2f) Dẫn chất 2f đƣợc tổng hợp từ 0.40g (2mmol) 4-methylbenzensulfoclorid (1f) và 450mg (2.2mmol) 2-bromoethanamin. Quá trình tiến hành phản ứng và xử lý tƣơng tự nhƣ tổng hợp dẫn chất 2a. Phần xử lý: sau khi cho HCl 5%, xuât hiện tủa màu trắng. Lọc tủa bằng phễu thủy tinh và sấy khô. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Khối lƣợng dẫn chất 2f: 0.44g. Cảm quan: màu trắng ánh vàng. Hiệu suất: 80%.
Nhiệt độ nóng chảy: 150-1520
Sản phẩm trung gian 2a-f đƣợc sử dụng làm nguyên liệu để tổng hợp tạo các dẫn chất 3a-f. 3.1.1.3. Tổng hợp N-(2-(4-formylphenoxy)ethyl)benzensulfonamid và dẫn chất (3a-f) Sơ đồ tổng hợp S N H Br O O + HO CHO S N H O O O 2a-f 3a-f R R CHO a. R = H, b. R = 2-Cl, c. R = 3-Cl d. R = 4-Cl, e. R = 4-OCH3, f. R = 4-CH3 K2CO3 MeOH, 80oC, 24h a. Tổng hợp N-(2-(4-formylphenoxy)ethyl)benzensulfonamid (3a) - Tiến hành phản ứng:
Hoạt hóa hydroxybenzaldehyd: cân hỗn hợp phản ứng gồm 240mg (2 mmol) p-hydroxybenzaldehyd cùng 286mg K2CO3 vào trong bình cầu 50ml. Thêm tiếp 10ml dung môi MeOH và gia nhiệt lên 80oC. Quá trình hoạt hóa diễn ra trong vòng 30-60 phút.
Hòa tan 0.42g (2mmol) tinh thể N-(2-bromoethyl)benzensulfonamid (2a) trong 10ml dung môi MeOH, dùng pipet hút và đƣa từ từ vào dung dịch đã đƣợc hoạt hóa. Giữ nhiệt độ ở 80oC, tốc độ khấy từ 200 vòng/phút, hồi lƣu trong khoảng 24h. Kiểm tra phản ứng bằng TLC với pha động DCM : MeOH = 40 : 1.
- Xử lý phản ứng:
Cất thu hồi bớt dung môi bằng máy cất quay ở nhiệt độ 40oC. Thêm từ từ 20ml dung dịch acid HCl 5% đã đƣợc làm lạnh vào hỗn hợp phản ứng, dùng đũa thủy tinh khuấy đều, xuất hiện tủa màu vàng nhạt. Lọc tủa qua phễu thủy tinh, rửa 4 lần với 15ml nƣớc cất đến khi dịch lọc trung tính (thử với giấy quỳ vạn năng). Sấy khô tủa ở 60oC trong khoảng 48h. Thu đƣợc chất 3a.
- Kết quả: Khối lƣợng chất 3a: 0.41g. Cảm quan: màu trắng. Hiệu suất: 79%. Nhiệt độ nóng chảy: 130.5-131.20 C. b. Tổng hợp N-(2-(4-formylphenoxy)ethyl)-2-clorobenzensulfonamid (3b)
Dẫn chất 3b đƣợc tổng hợp từ 0.60g (2mmol) N-(2-bromoethyl)-2- clorobenzensulfonamid (2b) và 240mg (2 mmol) p-hydroxybenzaldehyd. Quá trình tiến hành phản ứng và xử lý tƣơng tự nhƣ tổng hợp dẫn chất 3a. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: Khối lƣợng dẫn chất 3b: 0.46g. Cảm quan: màu vàng nhạt Hiệu suất: 68%. Nhiệt độ nóng chảy: 130-1320C. c. Tổng hợp N-(2-(4-formylphenoxy)ethyl)-3-clorobenzensulfonamid (3c) Dẫn chất 3c đƣợc tổng hợp từ 0.60g (2mmol) N-(2-bromoethyl)-3- clorobenzensulfonamid (2c) và 240mg (2 mmol) p-hydroxybenzaldehyd. Quá trình tiến hành phản ứng và xử lý tƣơng tự nhƣ tổng hợp dẫn chất 3a. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: Khối lƣợng dẫn chất 3c: 0.50g. Cảm quan: màu vàng nhạt Hiệu suất: 73%. Nhiệt độ nóng chảy: 131-1320C. d. Tổng hợp N-(2-(4-formylphenoxy)ethyl)-4-clorobenzensulfonamid (3d)