2.2.1.1. X ử lý mẫu dược liệu trước khi phân tích
Dược liệu đem nghiên cứu thường có độ ẩm nhất định. Các mẫu dược liệu trước khi phân tích thường được đo độ ẩm để đảm bảo đã được chế biến và bảo quản tốt. Mặt khác, qua đó ta có thể xác định được hàm lượng chất nghiên cứu trong dược liệu khô thông qua hàm lượng của nó trong dược liệu ẩm và độ ẩm của dược liệu.
Để xác định độ ẩm của dược liệu chúng tôi tiến hành như sau: Dược liệu sau khi lấy về, được sấy khô ở nhiệt độ 50°c trong 8h. Nghiền nhỏ dược liệu bằng máy xay rồi rây để được bột mịn đồng nhất. Cân một lượng dược liệu nhất định, khoảng 2,5 g bột, sau đó đem đo độ ẩm tự động trên máy SARTORIƯS (nhiệt độ:110°C)
Bảng 8. Kết quả đo độ ẩm trong các mẫu dược liệu
STT Tên dược liệu Độ ẩm % STT Tên dược liệu Độ ẩm %
0 1 Hoàng cầm 3.90 1 1 Thiên ma 5.10
0 2 Thiên niên kiện 4.02 1 2 Đương quy 2 . 6 8
03 Bạch truật 4.56 13 Thổ phục linh 4.55
04 Hương phụ 4.97 14 Trư ma căn 4.53
05 Tang bạch bì 5.02 15 Cẩu tích 4.75
06 Ba kích 2.96 16 r p V • 9 •
Tỳ giải 5.18
07 Cam thảo 3.91 17 Đơn bì 4.81
08 Cốt toái bổ 4.86 18 Bạch chỉ 5.66
09 Hoàng bá bắc 5.76 19 Thương truật 4.37
1 0 Tục đoạn 3.45 2 0 Bạch thược 3.80
2.2.1.2. Khảo sát điều kiện đo trên máy quang p h ổ hấp thụ nguyên tử
Với phép đo ETA-AAS thì các quá trình làm khô, tro hóa, nguyên tử hóa có ảnh hưởng rất lớn đến độ nhạy và độ ổn định của máy. Qua quá trình khảo sát trên máy Hitachi Z-5000, chúng tôi đã lựa chọn được các thông số máy phù hợp để định lượng chrom bằng phép đo ETA-AAS như sau:
Bảng 9. Các thông số máy quang p h ổ hấp thụ Hitachi Z-5000
Điều kiện Thông sô
Đèn Cathod rỗng Cr
Cường độ đèn 9 mA
Bước sóng 359,3 nm
Độ rộng khe sáng 1,3 nm
Cuvet A-type
Thể tích bơm mẫu 2 0 ịiL
Bảng 10. Chương trình nhiệt độ đo mẫu
Giai đoạn
Nhiệt độ bắt đầu/Kết thúc (°C)
Thòi gian tăng nhiệt / Thời gian duy trì (s)
Tốc độ khí mang (mL/min) Làm khô 70/140 10/30 200 Tro hóa 500/700 5/20 200 Nguyên tử hóa 2600/2600 0/5 30 Làm sạch lò 2700/2700 0/4 200 Làm nguội lò 0/0 0/17 200
2.2.I.3. Xây dựng đường chuẩn
Dung dịch chuẩn gốc Cr nồng độ lOOOppm ((fig/mL) được pha loãng ra nhiều lần và pha thành các dung dịch có nồng độ 2,5; 5; 10; 15; 20 ppb (ng/mL), trong nền H N 03 0,5%.
Tiến hành đo độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn này và lập đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ ta sẽ có đường chuẩn định lượng.
Bảng 11. Sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ Cr
Nồng độ (ng/mL) 2,5 5 1 0 15 2 0 Độ hấp thụ 0,0771 0,1320 0,2613 0,3687 0,5052 3- +■» .£0,6 t Ọ . 30,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
ĐỒ thị biểu diễn sự phụ thuộc độ hấp thụ vào nồng độ y = 0,0244x + 0,0133 R2 = 0,9994 25 Nồng độ (ppb) Hình 5. Đồ thị đường chuẩn
Như vậy vói khoảng nồng độ từ 2,5-20ppb thì độ hấp thụ phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ. Trên cơ sở đường chuẩn này, chúng tôi tiến hành định lượng hàm lượng chrom trong các mẫu dược liệu. Đối với một số mẫu có hàm lượng chrom nằm ngoài khoảng nồng độ này, chúng tôi tiến hành pha loãng mẫu đo.
2.2.1.4. Xây dựng điều kiện vô cơ hóa
Quá trình xử lý mẫu ảnh hưởng rất lớn đến kết quả phân tích. Nếu vô cơ hóa không hoàn toàn thì nguyên tố cần phân tích không định lượng được chính xác. Tuy nhiên khi vô cơ hóa ướt mà dùng lượng acid quá nhiều sẽ gây tốn hóa chất và ảnh hưởng đến nền mẫu đo sau này. Chính vì vậy, chúng tôi đã tiến hành khảo sát điều kiện vô cơ hóa ướt như sau.
Chuẩn bị 8 mẫu dược liệu, mỗi mẫu khoảng 0,5g được cho vào cốc Teflon, thêm acid H N 03 đặc, để một lúc cho bọt sủi giảm đi. Sau đó đun cách cát ở nhiệt độ vừa phải đến khi khói vàng nâu bay hết. Thêm tiếp vào acid HCIO4 đặc và đun tiếp cho đến cắn ẩm. Tỷ lệ thể tích acid HNO3 và HCIO4 được khảo sát trong bảng 12. Trong quá trình đun cần chú ý điều chỉnh nhiệt để hỗn hợp trong cốc không sôi, không bị bắn lên thành cốc. Để nguội, thêm vào cắn ẩm 2,5mL HNO3 10% và đun nóng nhẹ để hòa tan cắn ẩm. Lọc qua giấy lọc vào bình định mức 50mL, tráng cốc nhiều lần bằng nước cất 2 lần khử ion và thêm đến vạch. Đem đo độ hấp thụ trên máy và thu được kết quả như sau:
Bảng 12. Khảo sát điều kiện vô cơ hóa ướt
Lượng mẫu dược liệu (g)
Vhno3 (mL) Vnno., (inL) Hàm lượng
Chrom (ppm) 0,5082 5 0 2,235 0,5024 1 0 0 2,809 0,5034 15 2 2,837 0,5078 15 3 3,052 0,5010 15 4 2,828 0,5026 15 5 2,451 0,5052 2 0 0 2,139 0,5045 25 0 2,365
Qua kết quả thu được, chúng tôi nhận thấy, vófi tỉ lệ mẫu dược liệu:HN03:HC104 là 0,5g : 15mL : 3mL có khả năng vô cơ hóa hoàn toàn mẫu và cho kết quả tốt nhất. Trên cơ sở này, chúng tôi tiến hành các khảo sát khác bằng phương pháp vô cơ hóa mẫu dược liệu với tỉ lệ acid như trên.
2.2.1.5. Khảo sát độ lặp lại của phương pháp
Để đánh giá độ lặp lại của phương pháp, chúng tôi tiến hành thực nghiệm ngẫu nhiên trên 2 mẫu dược liệu. Cân mỗi mẫu dược liệu vào 6 cốc. Cách tiến hành vô cơ hóa giống như mục 2.2.1.4 với tỉ lệ mẫu dược liệu:HN03:HC104 là 0,5g:15mL:3mL và đo trên máy. Kết quả thu được trong bảng sau:
Bảng 13. Khảo sát độ lặp lại của phương pháp
Mâu dược liệu Lượng cân (g) Hàm lượng chrom (ppm)
Sô liệu thống kê
1
0,5351 0,473 Trung bình: X = 0,474
Độ lệch chuẩn: s = 11,24.10'3 Phương sai: s2= 126,27.10'6
Độ lệch chuẩn tương đối: RSD(%) = 2,37 Khoảng tin cậy: 0,474+0,0118
0,5014 0,475 0,5076 0,487 0,5052 0,470 0,5007 0,456 0,5129 0,485 2 0,4913 0,978 Trung bình: X = 0,938 Độ lệch chuẩn: s = 5,78.10'2 Phương sai: s2= 33,4.10' 4
Độ lệch chuẩn tương đối: RSD(%) = 6,16 Khoảng tin cậy: 0,474± 0,0607
0,5254 0,896
0,5328 1,012
0,5091 0,968
0,5088 0,918 0,5040 0,857
Như vậy, phương pháp có độ lặp lại tốt, RSD (%) từ 2,37% đến 6,16%. Do đó có thể áp dụng phương pháp này để định lượng chrom trong các mẫu dược liệu tiếp theo.
2.2.I.6. Khảo sát độ thu hồi của phương pháp
Khi tiến hành vô cơ hóa mẫu và pha chế dung dịch thì khả năng bị mất chất phân tích là rất hay gặp. Để đánh giá khả năng mẫu có bị mất trong quá trình xử lý mẫu hay không, chúng tôi tiến hành khảo sát trên mẫu dược liệu như sau:
Cân 6 mẫu dược liệu rồi vô cơ hóa như mục 2.2.1.4 với tỉ lệ mẫu dược liệu:HN03:HC104 là 0,5g : 15mL : 3mL và đo trên máy. Tính toán hàm lượng trung bình của chrom trong mẫu dược liệu đem phân tích.
Cân tiếp 6 mẫu thử, mỗi mẫu thêm lmL dung dịch Cr chuẩn nồng độ 250ppb, rồi tiến hành vô cơ hóa như mục 2.2.1.4 với tỉ lệ mẫu dược liệu:HN03:HC104 là 0,5g:15mL:3mL và đo trên máy. Cách tính độ thu hồi được dựa vào công thức sau:
x.m.1 0 3
H% = — --- ¥ — . 100% Cc
Trong đó:
H%: Độ thu hồi của phương pháp
Ctc: Nồng độ Cr trong mẫu đã thêm chuẩn ppb (ng/mL)
X: Hàm lượng Cr trang bình trong mẫu dược liệu ppm (ịig/g). m: Khối lượng mẫu dược liệu đã được thêm chuẩn Cr (g). V: Thể tích định mức (V = 50mL).
Cc: Nồng độ Cr chuẩn thêm vào mỗi mẫu (Cc = 5 ppb).
Bảng 14. Khảo sát độ thu hồi của phương pháp Lượng cân: m (g) Hàm lượng Cr trong mẫu thử và thêm chuẩn: Ctc (ppb) Độ thu hồi (H%) Số liệu thống kê 0,5011 9,9762 89,28 Trung bình: H% = 95,48% Độ lệch chuẩn: s = 6,90 Phương sai: s2= 47,72793667
Độ lệch chuẩn tương đối: RSD(%) = 0,072 Khoảng tin cậy: 95,48±7,25
0,5087 10,797 104,01
0,5043 10,630 101,65
0,5039 9,9035 88,61
0,5076 10,543 99,19
0,5004 1 0 , 0 1 2 90,15
Qua bảng trên, ta thấy quá trình xử lý mẫu có độ thu hồi khá tốt (H% = 95,48% ), điều đó chứng tỏ quá trình xử lý mẫu không gây mất mẫu. Do vậy, phương pháp vô cơ hóa ướt và phép đo ETA-AAS có độ đúng cao và thích hợp cho định lượng chrom trong mẫu dược liệu.
2.2.1.7. So sánh phương pháp đường chuẩn và phương pháp thêm chuẩn
Trong phân tích định lượng, người ta hay dùng phương pháp đường chuẩn và phương pháp thêm đường chuẩn. Mỗi phương pháp đều có ưu, nhược điểm riêng và tùy điều kiện trang thiết bị, hóa chất mà người phân tích có thể lựa chọn phương pháp phù hợp.
Để đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu đo đến kết quả phân tích và để lựa chọn phương pháp định lượng thích hợp, chúng tôi tiến hành định lượng trên cùng một mẫu dược liệu bằng cả phương pháp thêm chuẩn và đường chuẩn.
Cân 5 mẫu dược liệu, mỗi mẫu khoảng 0,5g, tiến hành vô cơ hóa như mục 2.2.1.4 với tỉ lệ mẫu dược liệu:HN03:HC104 là 0,5g : 15mL : 3mL, đem đo trên máy rồi định lượng bằng phương pháp đường chuẩn.
Sau đó chuẩn bị 5 bình định mức 25mL: lấy lOmL mẫu thử và thêm vào lần lượt 2, 4, 6 , 8 , lOmL dung dịch Cr chuẩn nồng độ 25ppb và thêm nước đến vạch. Đem đo trên máy và tính toán, thu được kết quả như sau:
Bảng 15. Khảo sát hàm lượng Cr theo phương pháp đường chuẩn và phương pháp thêm chuẩn
Lượng cân (g)
Hàm lượng chrom (ppm) (tính theo phương pháp đường
chuẩn)
Hàm lượng chrom (ppm) (tính theo phương pháp thêm
chuẩn) 0,5037 3,051 3,148 0,5078 3,175 2,902 0,5026 2,968 3,104 0,5110 3,102 3,115 0,5170 3,077 3,200
Từ kết quả thu được ở bảng trên, áp dụng thống kê toán học, chúng tôi so sánh độ chính xác của hai phương pháp trong bảng 16:
Bảng 16. So sánh phương pháp đường chuẩn và phương pháp thêm chuẩn
Các đại lượng thống kê
Phương pháp đường chuẩn Phương pháp thêm chuẩn Trung bình: X (ppm) 3,075 3,094 Độ lệch chuẩn: s 7,5.10' 2 1 1,3-1 0 ' 2 Phương sai: s2 56,89.10-4 128,89.10-4
Độ lệch chuẩn tương đối: RSD (%) 2,44 3,65
Khoảng tin cậy (ppm) 3,075+0,094 3,094±0,141
So sánh độ chính xác của hai phương pháp
Kết quả thu được ở bảng trên cho thấy giá trị Ftn đều nhỏ hơn Flt ở độ tin cậy p = 0,95. Điều đó chứng tỏ cả hai phương pháp đều có độ chính xác tương đương nhau. Do đó cả hai phương pháp đều có thể áp dụng để định lượng chrom trong các mẫu dược liệu. Trong luận văn này, chúng tôi dùng phương pháp đường chuẩn vì phương pháp này tiến hành nhanh và không tốn chất chuẩn khi định lượng đổng thời nhiều mẫu dược liệu.
Từ các kết quả thu được, chúng tôi đưa ra qui trình phân tích chrom trong mẫu dược liệu như sau:
Từ qui trình thu được ở trên, chúng tôi tiến hành định lượng chrom trong 20 mẫu dược liệu như sau:
- Mẫu dược liệu lấy từ hiệu thuốc y học dân tộc, được xác định tên khoa học, tác dụng dược lý, kết quả đã được ghi ở bảng 7.
- Các mẫu dược liệu đều được xử lý, đo độ ẩm trước khi phân tích. Kết quả đo độ ẩm của các mẫu đã được nêu trong bảng 8 .
- Tiến hành vô cơ hóa ướt các mẫu dược liệu theo qui trình với tỉ lệ mẫu dược liệu:HN03:HC104 là 0,5g : 15mL : 3mL.
Kết quả định lượng chrom trong 20 mẫu dược liệu được nêu ở bảng 16.