Đây là kỹ thuật đơn giản nhất nhằm phát hiện khả năng ngưng kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể. Ta sử dụng protein tiết từ sán làm kháng nguyên, phát hiện kháng thể đặc hiệu ở huyết thanh bệnh nhân bị nhiễm bệnh. Sau đó so sánh với kháng nguyên thân của F. gigantica xem loại kháng nguyên nào đặc hiệu hơn với kháng thể của Fasciola sp.
Kháng nguyên thân của F. gigantica được chuẩn bị như sau: 1,288 g sán cho vào thêm 2 ml đệm PBS 1X rồi dùng máy sonicator nghiền. Sán sau khi nghiền, ta đem ly tâm 3500 vòng/50 phút/ 40
C. Rồi thu lấy dịch nổi được xem như kháng nguyên thân.
Kỹ thuật thường được thực hiện trên đĩa thạch agar hoặc trên phiến kính chứa agar, trong đó kháng nguyên và kháng thể khuếch tán tự do về phía nhau và tạo ra các đường cong kết tủa:
Nếu chỉ có một đường kết tủa xuất hiện sẽ cho biết các loại kháng nguyên giống nhau hoặc đồng nhất.
Nếu có hai đường kết tủa xuất hiện bắt chéo nhau và cách biệt, chỉ rõ không có phản ứng chéo, hai kháng nguyên khác nhau.
Nếu tạo thành một đường kết tủa dạng “cựa gà” cho thấy hai loại kháng nguyên có chung một quyết định kháng nguyên nhưng cũng có những quyết định kháng nguyên khác nhau, nghĩa là giống nhau chỉ một phần.
Hình 3.3.5 – Phân tích kết quả từ các miễn dịch khuếch tán kép trên thạch agarose (Ouchterlony) [9]
Cách tiến hành: 1g agarose được làm tan trong 100 ml đệm PBS 1X, pH = 7,2. Đun đến khi agarose tan hoàn toàn. Đổ thạch 6,5 cm x 6 cm, dày 3 mm trên tấm phim trong, tạo các giếng trên thạch. Sau đó cho kháng nguyên và kháng thể vào giếng tương ứng. Đặt thạch vào buồng ẩm ở 40C. Khoảng 24 – 48 giờ sau quan sát đường tủa, ép khô thạch và nhuộm với đỏ Ponceau S 0,2%. Sau đó rửa nước và để khô tự nhiên.