2.3.4.I. Khảo sát tính thích hơp của hê thống sắc kv:
Pha một mẫu chuẩn hỗn hợp hai chất Almitrine bimesylat và Raubasine theo chỉ dẫn ở mục 2.3.3b, tiêm 6 lần mẫu chuẩn vào hệ thống HPLC. Tiến hành sắc ký với điều kiện đã lựa chọn. Túih thích hợp của hệ thống được biểu thị qua số đĩa lý thuyết (N), độ phân giải giữa các pic, độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) của 6 phép thử song song đối với diện tích pic và thcd gian lưu. Kết quả biểu thị ở bảng 2 cho thấy sai số tương đối của diện tích pic và thời gian lưu 6 phép thử đối với Almitrine bimesylat và Raubasine đều nhỏ hơn 2%. Điều đó cho thấy các điều kiện sắc ký mà chúng tôi lựa chọn và hệ thống HPLC mà chúng tôi sử dụng là phù hợp và đảm bảo sự ổn định của phép phân tích định lượng Almitrine bimesylat và Raubasine. Kết quả khảo sát được ghi ở bảng 2.
Bảng 2. Kết quả khảo sát tứih thích hợp của hệ thống sắc ký
Hoạt chất SD% của t]Ị RSD% của Spic SỐ đĩa lý thuyết trung bình (N) Độ phân giải trung bình (Rs) Hệ sô bất đối (T) Aliĩiitrine bimesylat 0,26 0,52 16942 20 1,17 Raubasine 0,14 0,31 14535 15 1,20
2.3A2. Khảo sát tính đăc hiêu (choa loc) của phương pháp
Trong phần định tính, chúng tôi đã tiến hành quét phổ UV-VIS của các pic thu được từ mẫu chuẩn và mẫu thử của từng chất và tiến hành chồng phổ để so
sánh, hệ số Match bằng 1 cho thấy các pic thu được đều tinh khiết, không bị lẫn các chất khác, do đó phương pháp đảm bảo tmh đặc hiệu.
2.3A.3. Khảo sát khoảng tuyến tính giữa diên tích pic và nồng đố các chất
chuẩn Almitrine bimesvlat và Raubasine.
Chúng tôi tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tmh giữa nồng độ các chất cần định lượng với diện tích pic trên các chất chuẩn Almitrine bimesylat và Raubasine. Pha một dãy dung dịch chuẩn của hỗn hợp hai thành phần Almitrine bimesylat có nồng độ biến thiên trong khoảng 60,9|^g/ml đến 304,4|ig/ml và Raubasine từ 20,8 ng/ml đến 104 Ịig/ml.
Trong bình định mức 50ml, cân chứủi xác 75mg Almitrine bimesylat chuẩn và 25mg Raubasine chuẩn, thêm 15ml acetonitril và lắc cho đến khi tan hoàn toàn. Thêm lOml dung dịch natri butansulphonat 0,1M; rồi thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều. Từ dung dịch này, sau đó pha loãng với pha động(sử dụng bình định mức 25ml) để có 5 dung dịch chuẩn có nồng độ như sau: bảng 3. Bảng 3: Các nồng độ dung dịch chuẩn Bình 1 2 3 4 5 Almitrine bimesylat (íig/ml) 60,9 1 2 1 , 8 183,0 243,5 304,4 Raubasine (ng/ml) . 2 0 , 8 41,6 62,4 83,2 104,0
Chạy sắc ký lần lượt mỗi dung dịch theo điều kiện nêu ở trên.
Kết quả độ tuyến tmh và khoảng tuyến tmh được trình bày ở bảng 4 và minh hoa ở hình 12 và 13.
Bảng 4: Kết quả khảo sát độ tuyến tính
Hoạt chất Almitrine bimesylat Raubasỉne
Dung dịch Nồng độ (ng/ml) Diện tích pic (mAUs) Nồng độ (ng/ml) Diện tích pic (mAUs) 1 60,9 234,7 20,8 85,1 2 121,8 441,3 41,6 169,3 3 183,0 655,8 62,4 250,5 4 243,5 878,2 83,2 311,1 5 304,4 1094,3 104,0 415,8
Hoạt chất Khoảng tuyến
tính Hệ số tương quan Phương trình hồi qui Almitrine bimesylat
60,9-304,4|ig/ml r^O.9999 y=3,546x+1,261
Raubasine 20,8-104,0^g/ml r=0,9999 y=3,953x+0,388
i 1200 n 1000 - 8 0 0 - o 6 0 0 - 4 0 0 - i - 200 - 0 - o 1 0 0 2 0 0 3 0 0 u o 'u g ctổ j u j c ^ / i u l ) 4 0 0
Hình 12. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic của Almitrine bimesylat vào nồng độ
. 400 - < 350 - Ể 300 - * ã N o 250 “ 200 ^ 150 - 100 - 50 - ■3 0 - 0 20 40 60 80 nống đ ộ (mcg/ml) 100 120
Hình 13. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic của Raubasine vào nồng độ
♦ Nhận x é t: Kết quả trình bày (ở bảng 4 và hình 12, hình 13) cho thấy trong khoảng nồng độ của các chất đã khảo sát, diện tích pic đáp ứng thu được trên
sắc đồ tỷ lệ thuận với nồng độ của chúng, khoảng phụ thuộc tuyến tứih giữa nồng độ chất khảo sát và diện tích pic tương ứng khá rộng với hệ số tương quan tương ứng / = 0,9999 (Almitrine bimesylat) và r*‘= 0,9999(Raubasine) chứng tỏ sự phụ thuộc tuyến tmh là chặt chẽ. Trên cơ sở đó, chúng tôi lựa chọn nồng độ để định lượng các thuốc đa thành phần nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát: Almitrine bimesylat là khoảng 183,0|ag/ml, Raubasine là khoảng 62,4|ag/ml.
2.3.4A Khảo sát đổ lăp lai
Các thử nghiệm này được tiến hành trên mẫu thử Kalmitril cùng vói mẫu chuẩn được chuẩn bị như ở mục 2.3.3b. Tiêm lần lượt từng mẫu thử và mẫu chuẩn vào hệ thống HPLC. Tiến hành trong điều kiện sắc ký đã chọn. Tính hàm lượng của Almitrine bimesylat và Raubasine có trong các mẫu thử dựa trên mẫu chuẩn đã biết hàm lượng theo công thức sau:
^ , __. . . . SrXCrXm
X(mg/viên)= ^---- xf
S(. xniQ
Trong đó : và Sc là diện tích pic của dung dịch thử và chuẩn Q : nồng độ chất chuẩn(|xg/ml)
m: là khối lượng trung bình viên(mg) nio: là lượng cân bột viên(mg)
f: là hệ số pha loãng của thử.
Độ lặp lại của phưoỉng pháp được đánh giá bằng sai số tương đối ( e%) của 6
phép thử song song. Khi £ càng nhỏ thì độ lặp lại càng cao. Kết quả độ lặp lại của phương pháp được ghi ở bảng 5.
Bảng 5: Kết quả khảo sát độ lặp lại
Lần
Almitrine
Bimesylat
Raubasine
Thực Hàm lượng Số liệu thống Hàm lượng Số liệu thống
nghiệm (mg/viên) Kê (mg/viên) Kê
1 29,73 X =30,04 10,02 X =10,22 2 29,70 s=0,25 10,01 s=0 , 1 8 3 29,90 S(X)=0,1Ọ2 10,04 S(X)=0,074 4 30,05 8%=0,87% 10,31 £%=1,86% 5 30,10 n=6 10,35 n=6 6 30,30 a=0,05 10,39 a=0,05 ^„=2,571 =2,571 ♦Nhận xét:
Kết quả trình bày ở bảng 5 cho thấy, vói chưofng trình chạy sắc ký đã chọn, phương pháp định lượng đồng thời Almitrine bimesylat và Raubasine có độ lặp lại cao, sai số tưofng đối nhỏ (saị số tưoỉng đối của Almitrine bimesylat là 0,87%; sai số tương đối của Raubasine là 1,86%).
2.3.4.5. Khảo sát đô đúng của phương pháp
Độ đúng của phưofng pháp được xác định bằng phưoíng pháp thêm chuẩn: thêm một lượng chính xác khoảng 20% Almitrine bimesylat và Raubasine chuẩn so với lượng diất trong mẫu thử vào một lượng mẫu thử đã được xác định hàm lượng Almitrine bimesylat và Raubasine ở mục “Khảo sát độ lặp lai” .
• Dung dịch chuẩn hỗn hợp:
Tiến hành cân và pha chúih xác một hỗn hợp dung dịch của hai chất chuẩn Almitrine bimesylat và Raùbasine bằng hỗn hợp các dung môi acetonitril; natri butansulphonat 0,1M và methanol (tỉ lệ dung môi tương ứng 2:3:5) (trình tự pha tưofng tự như pha dung dịch chuẩn đã mô tả ở mục 2.3.3b) để thu được một hỗn hợp dung dịch chuẩn trong đó Almitrine bimesylat có nồng độ là 15mg/ml và Raubasine có nồng độ là 5mg/ml.
• Cách tiến hành: + Mẫu thử:
Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng khoảng 25mg Raubasine cho vào bình định mức 50ml, thêm Iml dung dịch chuẩn hỗn hợp, thêm 15ml acetonitril và lắc kỹ trong 15 phút. Thêm lOml dung dịch natri butansulphonat 0,1M, rồi thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc bỏ 20ml dịch lọc đầu. Lấy 3ml dịch lọc thu được cho vào bình định mức 25ml, thêm pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều. Sau đó tiến hành đo HPLC song song với mẫu chuẩn,lặp lại thực nghiệm 6 lần. Dựa trên diện tích pic và hàm lưcmg của mẫu chuẩn và mẫu thử ta sẽ túih được tỉ lệ thu hồi của chất chuẩn. Kết quả khảo sát được trình bày trong bảng 6.
‘ Bảng 6: Kết quả khảo sát độ đúng Hoạt chất Lần thực nghiệm Lượng có sẵn trong mẫu(mg) Lượng chuẩn thêm vào(mg) Lượng chuẩn tìm thấy (mg) % tìm lại Almitrine 1 75,6 15,2 14,84 97,6 bimesylat 2 75,6 15,2 15,02 98,8 3 75,6 15,2 14,91 98,1 4 75,6 15,2 15,0 98,7 5 75,6 15,2 14,94 98,3 6 75,6 15,2 14,93 98,2 Trung bình 98,28% Raubasine 1 25,2 5,02 4,88 97,2 2 25,2 5,02 4,98 99,2 3 25,2 5,02 4,97 99,05 4 25,2 5,02 4,93 98,4 5 25,2 5,02 4,95 98,6 6 25,2 5,02 4,92 98,01 Trung bình 98,41% ♦Nhận xét:
Các kết quả thực nghiệm cho thấy khả năng tìm lại được khá tốt đối với hai hoạt chất nghiên cứu: với Almitrine bimesylat đạt 98,28%; vói Raubasine đạt 98,41%. Khả năng tìm thấy hai hoạt chất này cao có nghĩa là phương pháp có độ đúng cao, kết quả định lượng chấp nhận được.
2.3.4.Ó. Khảo sát áp dung
Áp dụng phương pháp để định lượng đồng thòi Almitrine bimesylat và Raubasine trong các lô sản xuất khác của viên nén bao phim Kalmitiil và trên hai chế phẩm tương tự.
Trên cơ sở các điều kiện sắc ký đã xây dựng, chọn nồng độ định lượng của chuẩn và mẫu nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát. Sau đó tiến hành định lượng bằng phưoỉng pháp ngoại chuẩn, có nghĩa là so sánh diện tích pic mẫu chuẩn và mẫu thử được thực hiện trên cùng điều kiện sắc ký, từ đó tính ra hàm lượng Almitrine bimesylat và Raubasine trong chế phẩm cần phân tích theo công thức:
S r x C r X m ^
X(mg/viên)=
S(. xtMq
Trong đó : và Sc là diện tích pic của dung dịch thử và chuẩn Cq: nồng độ chất chuẩn(Ịxg/ml)
/n: là khối lượng trung bình viên(mg) nio: là lượng cân bột viên(mg)
f: là hệ số pha loãng của thử.
Phương pháp này được tiến hành thực nghiệm tương tự như phần khảo sát độ lặp lại. Kết quả thu được trình bày ở bảng 7.
Bảng 7: Kết quả định lượng đồng thời hai chất bằng phưoỉng pháp sắc ký đã xây dựng trên một số mẫu lưu hành
STT Mẫu thử SKS Noi sản xuất Hàm lượng (mg/viên)
Almitrine Bimesylat Raubasine 1 Kalmitril 100805 CTDP Khánh Hoà 28,34 9,60 2 Kalmitril 091005 CTDP Khánh Hoà 29,32 9,45 3 Kalmitril 071205 CTDP Khánh Hoà 29,67 1 0 ,0 1 4 Duxil 100206 Hãng Servier-Pháp 30,01 10,05 5 Comazin 150905 CTDLTWI 29,54 9,78
2.3.4. Đánh giá ưu, nhược điểm của phương pháp HPLC * ư u điểm:
_ Tiến hành nhạnh.
_ Kết quả định lượng chmh xác.
_ Định lượng đồng thời các thành phần trong hỗn hợp mà không cần qua giai đoạn chiết tách .
_ Tránh được sai số hệ thống do máy móc có thể chuẩn hoá được. * Nhươc điểm:
_ Hiện nay các trang thiết bị HPLC có giá thành rất cao.
_ Các dung môi dùng trong HPLC thường dùng loại tinh khiết sắc ký do đó giá thành cao.
2.3.5. Bàn luận
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp phân
t í c h h i ệ n đ ạ i đ ư ợ c s ử d ụ n g k h á r ộ n g r ã i t r o n g p h â n t í c h v à k i ể m n g h i ệ m d ư ợ c
phẩm, ư u điểm chung của phưcmg pháp là có sự ổn định và độ chọn lọc cao,
tiến hành nhanh chóng, có thể áp dụng để định tính và định lượng đồng thòd nhiều hoạt chất mà không cần phải chiết tách riêng b iệ t.
Kết quả thực nghiệm của chúng tôi với việc phân tích đồng thời hai thành phần Almitrine bimesylat và Raubasine qua xử lý thống kê cho thấy phương pháp định lượng có thể chấp nhận được. Trên sắc ký đồ, các pic có độ phân giải rõ ràng. Hệ số tương quan tuyến tính 1^ 0 , 9 9 9 9 với khoảng khảo sát khá rộng cho phép áp dụng với nhiều chế phẩm tương tự có tỷ lệ các thành phần khác nhau. Độ lặp lại với sai số tương đối của Almitrine bimesylat là 0,87%; của Raubasine là 1,86% và độ đúng từ 98,28% đến 98,41%. Phương pháp xử lý mẫu đơn giản phân tách tốt các chất trong hỗn hợp, dễ thực hiện trong thời gian ngắn. Tuy diện tích pic của các hoạt chất thu được có độ chênh lệch lớn do hàm lượng các hoạt chất có tỷ lệ khác nhau và có độ hấp thụ tử ngoại khác nhau. Nhưng các pic cách xa nhau nên không có sự ảnh hưởng lẫn nhau khi định lượng. Kết quả thực nghiệm cũng chứng tỏ chưoỉng trình sắc ký chúng tôi vừa xây dựng có độ tin cậy cao, độ lặp lại và độ đúng tốt, kỹ thuật tiến hành đcfn giản, nhanh chóng và dễ thực hiện.
Và qua đây, chúng tôi đã đưa ra một hệ dung môi pha động có thể tách các chất tốt, pha chế đơn giản, thành phần trong đó dễ kiếm và tiết kiệm chi p h í.
Phần 3
Kết luận và đề xuất
3.1. Kết luận
Trong quá ttình tiến hành thực hiện khoá luận tôi đã thu được một số kết quả sau: _ Đã xây dựng được một chương trình sắc ký để định lượng đồng thời hỗn hợp hai thành phần Almitrine bimesylat và Raubasine bằng phương pháp HPLC như sau:
+ Máy HPLC
+ Cột Lichrosorb RP18 (250x4mm; 5|j,m) + Detector UV đặt ở bước sóng 254nm
+ Pha động: 850ml methanol+ 20ml acid acetic+ 2ml diethylamin+ nước cất vừa đủ llít.
+ Tốc độ dòng l,2ml/phút + Thể tích tiêm 20|il + Nhiệt độ phòng.
Và kết quả cho thấy phưofng pháp đặc hiệu và có độ tuyến túih, độ chúih xác cao và hệ thống sắc ký thích hợp .
_ Vận dụng được các kiến thức đã học để tiến hành nghiên cứu một đề tài, nâng cao kỹ năng thực hành và tra cứu tài liệu.
_ Nắm được lý thuyết cơ bản của phương pháp HPLC, một phương pháp phân tích hiện đại được ứng dụng nhiều trong kiểm nghiệm thuốc.
- Biết vận hành và sử dụng một số thiết bị hiện đại trong kiểm nghiệm thuốc. 3.2. Đề xuất
Tiếp tục khảo sát hoàn chỉnh để có thể thu được phương pháp định lượng tối ưu và hoàn chỉnh qui trình thành thường quy kỹ thuật vói mục đích ứng dụng định túih, định lượng cho các thuốc khác có thành phần tưoỉng tự góp phần vào công tác đảm bảo chất lượng thuốc cho ngành.
Tài liệu tham khảo
1. Phạm Gia Huệ, Trần Tử An (1998), Hoá phân tích, Trường đại học Dược Hà Nội, tập II, chương 5, 6.
2. Trần Tử An (2004), Kiểm nghiệm thuốc, Trường đại học Dược Hà Nội chưcíng 3.
3. Phan Thị Thuỳ Chi (2005), “Nghiên cứu định lượng Riboflavin natri
phosphat, Naphazolin nitrat, Qopheniramin maleat, Pyridoxin
hydroclorid và Dexpanthenol trong thuốc nhỏ mắt Naphacollyre B- complex bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao”, Luận văn thạc sĩ Dược học, Trường đại học Dược Hà Nội.
4. DS. Phạm Thiệp-DS. Vũ Ngọc Thuý (2001), Thuốc Biệt Dược và cách sử dụng, Nhà xuất bản Y Học.
5. Thái Phan Quỳnh Như (2001), ứng dụng các phương pháp chia tách trong kiểm nghiệm thuốc, Viện kiểm nghiệm, Bộ Y tế.
6. Tiêu chuẩn cơ sở viên nén Duxil của Viện công nghiệp bào chế Servier- Pháp.
7. The merck index 30, An encyclopedia of Chemicals, Drugs, and biologicals, Thirtenth edition, Phần II, p.298, 8205.
8. http://www.chemindustry.com/chemicals/823790.html
9 . h t t p : / / w w w . w r o n g d i a g n o s i s . c o m / m e d i c a l / a l m i t r i n e . h t m