Tối ưu hóa quy trình tách chiết DNA đậu nành ứng dụng trong sàng lọc đậu nành biến đổi gen bằng phương pháp real time PCR

MỤC LỤC

1 .1.1 Định nghĩa sinh vật biến đổi gene

  • CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN SINH VẬT BIẾN ĐỔI GENE
    • CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT DNA SỬ DỤNG TRONG PHÁT HIỆN GMO
      • ĐÁNH GIÁ DNA SAU TÁCH CHIẾT

        Trong các kỹ thuật phát hiện bằng PCR, kỹ thuật PCR cổ điển xuất hiện từ sớm, tuy nhiên mang nhiều khuyết điểm như độ nhạy không cao, kết quả chỉ phản ánh được lượng sản phẩm cuối cùng thu được trong toàn quy trình, tốn nhiều thời gian và tăng nguy cơ nhiễm chéo do phải tiến hành điện di sau đó để đọc kết quả [44]. Khi bắt đầu có sự xuất hiện hiện sản phẩm khuếch đại đặc hiệu thì Taqman probe sẽ bắt cặp vào sợi khuôn của sản phẩm này ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp và bị enzyme Taq polymerase cắt bỏ để kéo dài mồi tổng hợp nên sợi bổ sung, do vậy mà reporter của Taqman probe sẽ bị cắt rời xa quencher và phát được huỳnh quang.

        Hình 1. 1 Bản đồ các quốc gia trồng, nhập khẩu, và/hoặc tiến hành khảo nghiệm đồng ruộng sinh vật biến đổi gene tại 70 quốc gia trên Thế Giới năm 2014 [45]
        Hình 1. 1 Bản đồ các quốc gia trồng, nhập khẩu, và/hoặc tiến hành khảo nghiệm đồng ruộng sinh vật biến đổi gene tại 70 quốc gia trên Thế Giới năm 2014 [45]

        2.PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

        NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

          - Khảo sát hiệu quả của β- mecaptoethanol trong quy trình tách chiết DNA bằng phương pháp CTAB theo tiêu chuẩn ISO. - Khảo sát tỷ lệ hiện diện của dịch DNA sau ly giải với Guanidine thiocyanate và Ethanol tuyệt đối trong dung dịch binding buffer. - Thử nghiệm khả năng thực hiện phản ứng khuếch đại Real-time PCR của DNA hạt đậu nành sau tách chiết.

          Các vấn đề nghiên cứu này sẽ giúp tôi xây dựng một quy trình tách chiết DNA từ mẫu hạt đậu nành nguyên có hàm lượng và chất lượng DNA thu được tốt hơn so với tách chiết bằng phương pháp CTAB (ISO), phù hợp cho việc sàng lọc đậu nành biến đổi gene bằng Real-time PCR. Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Vi sinh- GMO, Khu thí nghiệm Trung Tâm Tiêu Chuẩn đo Lường Chất Lượng 3, 07 đường số 1, Khu công nghiệp Biên Hòa 1, Đồng Nai. Khảo sát tỷ lệ thể tích của dịch DNA sau ly giải với Guanidine thiocyanate và Ethanol tuyệt đối trong dung dịch binding buffer.

          THÍ NGHIỆM 1

            Kết quả thí nghiệm chúng tôi xác định được cần có các khảo sát hơn nữa nhằm loại bỏ các hợp chất thứ cấp.

            Sơ đồ 2. 1 Sơ đồ quy trình tách chiết DNA bằng phương pháp CTAB (ISO) [19].
            Sơ đồ 2. 1 Sơ đồ quy trình tách chiết DNA bằng phương pháp CTAB (ISO) [19].

            THÍ NGHIỆM 2

              Tiến hành khảo sát thí nghiệm hiệu quả loại bỏ các hợp chất thứ cấp trong hạt đậu nành trên hai quy trình tách chiết DNA được trình bày trong bảng 2.1. - Quy trình 1: Tách chiết DNA bằng phương pháp CTAB (ISO) - Quy trình 2: tách chiết DNA bằng phương pháp cột silica Số lần lặp lại: 4 lần. -Để khô cột có chứa DNA và làm tan lại trong 50μL nước cất siêu sạch 65oC hoặc TE.

              Kết quả thí nghiệm chúng tôi bước đầu xác định được một quy trình tinh sạch có khả năng loại bỏ các hợp chất thứ cấp trong hạt đậu nành nguyên.

              Bảng 2. 1 Quy trình tách chiết DNA thí nghiệm 2
              Bảng 2. 1 Quy trình tách chiết DNA thí nghiệm 2

              THÍ NGHIỆM 3

                - Quy trình 3: Binding buffer chứa Sodium acetate + Ethanol Quy trình thực hiện được trình bày trong bảng 2.2. Kết quả thí nghiệm chúng tôi bước đầu xác định được thành phần binding buffer phù hợp có khả năng loại bỏ các hợp chất thứ cấp trong hạt đậu nành nguyên.

                Bảng 2. 2 Quy trình tách chiết DNA thí nghiệm 3
                Bảng 2. 2 Quy trình tách chiết DNA thí nghiệm 3

                THÍ NGHIỆM 4

                  Tiến hành khảo sát tỷ lệ thể tích của dịch DNA sau ly giải với Guanidine thiocyanate và Ethanol trong dung dịch binding buffer. Kết quả thí nghiệm chúng tôi xác định được một quy trình tách chiết tốt có khả năng loại bỏ các hợp chất thứ cấp trong hạt đậu nành nguyên.

                  Bảng 2. 3 Tỷ lệ khảo sát dịch DNA: GuSCN: Ethanol
                  Bảng 2. 3 Tỷ lệ khảo sát dịch DNA: GuSCN: Ethanol

                  THÍ NGHIỆM 5

                    Đoạn DNA được di chuyển với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào nồng độ của Agarose. Tùy thuộc vào độ dài của đoạn DNA mà sử dụng nồng độ agarose khác nhau (bảng 2.4). - Lau sạch và để khô bồn điện di, lắp lược vào các vị trí thích hợp - Pha loãng dung dịch đệm TAE 10X thành dung dịch đệm 0,5X.

                    - Đổ dung dịch agarose vào bồn điện di đã lắp lược (chiều sâu khoảng 3- 5mm) - Để nguội cho gel đông đặc, cẩn thận tháo lược. - Bơm 10 μL dung dịch DNA của mỗi mẫu vào giếng - Sử dụng thang chuẩn thích hợp. - Tắt nguồn, lấy miếng gel và đặt vào buồng chụp ảnh điện di - Chụp hình.

                    Bảng 2. 4 Nồng độ agarose sử dụng tương ứng với chiều dài đoạn DNA sản phẩm
                    Bảng 2. 4 Nồng độ agarose sử dụng tương ứng với chiều dài đoạn DNA sản phẩm

                    THÍ NGHIỆM 6

                      Rã đông các ống Master mix, Primer mix, chứng dương ở nhiệt độ phòng tối thiểu 30 phút. Trộn đều hỗn hợp trong ống Master mix bằng Micropipette (không trộn bằng máy vortex). Trộn đều dung dịch DNA xét nghiệm, dung dịch đối chứng dương bằng cách vortex nhẹ.

                      Hút lần lượt 5μl dung dịch nước cất 2 lần (đối chứng âm), DNA mẫu thử, chứng dương vào các ống phản ứng đã được chuẩn bị sẵn. - Mẫu được xem là dương tính khi đường huỳnh quang FAM vượt lên khỏi ngưỡng tín hiệu. Trong một số trường hợp, cần thiết lập lại ngưỡng tín hiệu cho phù hợp dựa vào kinh nghiệm của.

                      Bảng 2. 6 Chu kỳ luân nhiệt trên máy PCR
                      Bảng 2. 6 Chu kỳ luân nhiệt trên máy PCR

                      PHẦN III: KẾT QUẢ

                        Vì thế, với mong muốn thu được DNA với chất lượng tốt hơn, chúng tôi tiến hành tách chiết DNA từ mẫu hạt đậu nành thô bằng phương pháp cột silica và kết quả về hàm lượng và độ tinh sạch của DNA được đánh giá sơ bộ qua chỉ số A260, A260/A280 và A260/A230. Kết quả cho thấy rằng, lượng DNA thu được khi sử dụng binding buffer chỉ chứa GSCN thấp (< 40ng/ μl), thấp hơn nồng độ cần thiết cho phản ứng PCR theo yêu cầu của Accupid Kit (Bộ kit thương mại được sử dụng trong Realtime PCR mẫu DNA sau tách chiết). Vì thế, để tìm ra tỷ lệ phù hợp giữa dịch DNA sau ly giải và các thành phần trong binding buffer giúp tăng khả năng bám cột của DNA, đồng thời, hạn chế sự tương tác giữa các thành phần không mong muốn với silica hay với DNA được giữ lại trong silica, chúng tôi thực hiện thí nghiệm khảo sát tỷ lệ dịch DNA sau ly trích bằng CTAB, thể tích muối GuSCN và EtOH ở các tỷ lệ được trình bảy trong bảng 3.4.

                        Vì thế, để đánh giá DNA thu được bằng phương pháp cột silica gel có đạt chuẩn để làm khuôn cho phản ứng PCR, chúng tôi tiến hành kiểm tra độ nguyên vẹn của DNA thu được từ mẫu RRS 10% sử dụng quy trình mang bộ thông số đã được chọn trong quá trình khảo sát bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%. Từ kết quả các thí nghiệm trước, chúng tôi nhận thấy phương pháp tách chiết DNA bằng cột silica với thành phần binding buffer gồm GSCN và EtOH, tỷ lệ thể tích dịch DNA sau ly trích: GSCN: EtOH = 1:1:2 cho phép thu được DNA đạt yêu cầu về hàm lượng, độ tinh sạch và độ nguyên vẹn. Vì thế, chúng tôi nhận xét rằng quy trình tách chiết được chọn trong nội dung khóa luận này cho phép thu được DNA có hàm lượng, độ tinh sạch cũng như độ nguyên vẹn phù hợp để làm nguyên liệu đầu vào cho phản ứng Real-time PCR, hướng tới ứng dụng trong phân tích thực phẩm biến đổi gen từ hoặc có nguồn gốc từ đậu nành.

                        Hình 3. 1 Số lượng và độ tinh sạch của DNA thu nhận ở các nồng độ BME khác nhau.
                        Hình 3. 1 Số lượng và độ tinh sạch của DNA thu nhận ở các nồng độ BME khác nhau.

                        4.PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

                        ĐỀ NGHỊ

                        - Kết quả khảo sát tối ưu hóa quy trình tách chiết DNA trên nền mẫu hạt đậu nành bằng phương pháp CTAB bổ sung BME không hiệu quả trong việc loại bỏ các hợp chất thứ cấp. Trong quy trình tách chiết DNA hạt đậu nành bằng phương pháp cột silica, dung dịch binding bao gồm Guanidine thiocyanate và Ethanol cho kết quả DNA thu được có độ tinh sạch cao nhất thông qua tỷ lệ và A260/A280 vàA260/A230. Tỷ lệ thể tích dịch DNA: GuSCN: EtOH 100% = 1:1:2 cho phép thu được DNA tinh sạch, nguyên vẹn, không bị nhiễm protein, ít nhiễm các hợp chất thứ cấp như hợp chất phenol,.

                        DNA thu được từ mẫu đậu nành RRS 10% bằng phương pháp cột silica với bộ thông số được chọn đủ độ nguyên vẹn và không chứa các chất ức chế phản ứng Real- time PCR ở nồng độ cho kết quả âm tính giả. Như vậy, với quy trình tách chiết tối ưu trong nội dung khóa luận này cho phép thu được DNA từ hạt đậu nành thô đủ chất lượng, phù hợp để thực hiện các phân tích tiếp theo như sàng lọc đậu nành biến đổi gene.

                        Tài liệu Tiếng Anh

                        European Union Reference Laboratory for GM food and feed, Definition of Minimum Performance Requirements for Analytical Methods of GMO Testing European Network of GMO Laboratories (ENGL), 2015. Shattuck,(1983), An effective method of DNA isolation from the mature leaves of Gossypium species that contain large amounts of phenolic terpenoids and tannins, Preparative Biochemistry, 13 (4), pp 347–359. Jun-jie- Poh, Samuel Ken-En Gan, (2014), The Determination of Factors Involved in Column-Based Nucleic Acid Extraction and Purification, Poh and Gan, J Bioproces Biotechniq, 4, pp 3-3.

                        Lever, Andrea Torti , Philip Eickenbusch, (2015), A modular method for the extraction of DNA and RNA, and the separation of DNA pools from diverse environmental sample types, Frontiers in Microbiology, 6 (476), pp 1-25. Nelly Datukishvili, Tamara Kutateladze, Inga Gabriadze, Kakha Bitskinashvili, Boris Vishnepolsky, (2015), New multiplex PCR methods for rapid screening of genetically modified organisms in foods. Ronald Jenkins, (2010), Review: Influence of DNA extraction methods, PCR inhibitors and quantification methods on real-time PCR assay of biotechnology-derived traits, Anal Bioanal Chem, 396, pp 1977–1990.

                        Tài liệu Internet

                        P Sharma, S D Purohit, (2012), An improved method of DNA isolation from polysaccharide rich leaves of Boswellia serrata Roxb, Indian Journal of Biotechnology, 11, pp 67-71. Siun Chee Tan, BeowChin Yiap, (2009), Review Article DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present, Journal of Biomedicine and Biotechnology, Article 2009,pp 1-10. Flournoy,(1996), Inhibition of random amplified polymorphic DNAs (RAPDs) by plant polysaccharides, PlantMolecular Biology Reporter, 14( 1), pp 17–22.

                        Baum, (1997), Modification of a CTAB DNA Extraction Protocol for Plants Containing High Polysaccharide and Polyphenol Components, Plant Molecular Biology Reporter , 15 (1), pp 8-15.