Phân tách và xác định trình tự DNA nấm Trichoderma

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Rồi đem lắc với cường độ 150 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng, để sợi nấm tiếp xúc tối đa với môi trường vì thế sợi nấm luôn ở trạng thái sinh trưởng mạnh nên không mọc bào tử. Cách thu lấy sợi nấm: Dùng vải và phễu lọc đã hấp khử trùng và sấy khô để lọc thu lấy phần sợi nấm, vắt kiệt nước rồi bỏ vào giấy bạc, cán mỏng để khi nghiền trong nitơ lỏng đƣợc dễ dàng, bảo quản ở -70 0C. Tham khảo tài liệu của Sambrook và cs (1989), chúng tôi ly trích DNA nấm Trichoderma theo phương pháp Lysis buffer có cải tiến cho phù hợp điều kiện nghiên cứu.

Để kiểm tra kết quả ly trích có thu đƣợc DNA tổng số hay không và DNA pha loãng có nồng độ thích hợp để thực hiện phản ứng PCR hay chƣa, chúng tôi tiến hành điện di sản phẩm ly trích và pha loãng trên gel agarose 1%. Sau đó, bảng gel đƣợc chuyển vào thuốc nhuộm ethidium bromide (1%) trong khoảng 15 phút, rửa sạch và chụp gel bằng tia tử ngoại (UV) của máy Gel doc 2000 (Biorad) và kết quả đƣợc đọc bằng phần mềm Quality One. Từ đó, kết hợp với những hiểu biết về phương pháp định lượng nồng độ DNA bằng phân tử Mass (mục 2.8.3, phần 2 tổng quan tài liệu), chúng tôi có thể ƣớc lƣợng nồng độ DNA ly trích đƣợc và dự đoán đƣợc độ pha loãng.

DNA làm khuôn: thu nhận qua quá trình ly trích DNA bộ gen của nấm Trichoderma, sau đó pha loãng đến nồng độ DNA thích hợp cho phản ứng PCR khoảng 15 – 20 ng/ àl. 1 Sơ đồ phân vùng và vị trí primer trên vùng từ 18S đến 28S – rDNA và vị trí vùng khuếch đại (vùng đánh dấu ellip) với cặp primer ITS4 và ITS5. Các thành phần phản ứng PCR đƣợc phối trộn theo thứ tự đƣợc liệt kê ở bảng bên dưới để đảm bảo hiệu quả cho phản ứng do Taq DNA polymerase khi trộn vào hỗn hợp phản ứng PCR sẽ hoạt động ngay.

Dựa vào độ tương đồng di truyền (%) kết hợp với kết quả định danh bằng hình thái, để từ đó xác định tên loài của 11 dòng Trichoderma khảo sát. Dữ liệu trên NCBI đƣợc chúng tôi so sánh với nhau (bằng phần mềm Clustal X 1.83) trong phạm vi từng loài để chọn ra trình tự ổn định nhất (không có đột biến) và 1 – 2 trình tự đột biến phổ biến (không có đột biến điểm đơn lẻ). Việc làm này nhằm loại bỏ hiện tượng trình tự dòng khảo sát có tỉ lệ tương đồng cao với trình tự đột biến của loài khác, sẽ làm nhiễu kết quả so sánh trình tự.

Phân nhóm xác đi ̣nh mối quan hê ̣ di truyền giữa 11 dòng Trichoderma Với dữ liệu về trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dòng Trichoderma. Chúng tôi tiến hành so sánh các trình tự này với nhau bằng phần mềm Clustal X 1.83 và đọc kết quả bằng phần mềm TreeView 1.6.6 từ đó phân nhóm xác định mối quan hệ di truyền giữa chúng. Trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dòng Trichoderma phân lập ở Việt Nam đƣợc so sánh với dữ liệu của chúng trên NCBI ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới bằng phần mềm Clustal X 1.83 và đọc kết quả bằng phần mềm TreeView 1.6.6, từ đó xác định mối quan hệ di truyền giữa chúng.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

• Kết quả phân nhóm tạo phổ hệ di truyền

Dòng T42: Với kết quả tính độ tương đồng di truyền (%) vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với các loài trên NCBI, kết hợp với kết quả định danh dựa vào hình thái là T. Dòng T38: Với kết quả tính độ tương đồng di truyền (%) vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với các loài trên NCBI, chúng tôi xác định dòng T38 chỉ có thể. Dòng T85: kết hợp kết quả tính độ tương đồng di truyền (%) vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với các loài trên NCBI với kết quả định danh dựa vào hình thái là T.

Dòng T6: kết hợp kết quả tính độ tương đồng di truyền (%) vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với các loài trên NCBI, chúng tôi khẳng định tên loài chính xác của dòng T6 là Trichoderma asperellum. (*): tên loài được định danh chính xác bằng cách kết hợp kết quả định danh bằng hình thái với trình tự vùng ITS – rDNA.(**): tên loài được xác định dựa vào hình thái và trình tự vùng ITS – rDNA. Kết quả định danh dƣ̣a vào hình thái không hoàn toàn chính xác do hệ thống định danh và phân loại dựa vào hình thái của Trichoderma vẫn chƣa hoàn chỉnh (Gary J. Samuels, 2004) và một vài loài Trichoderma có đặc điểm hình thái khá giống nhau, chỉ khác nhau vài đặc điểm rất khó xác định.

Trình tự vùng bảo tồn ITS – rDNA kết hợp với kết quả định danh dựa vào hình thái không phải lúc nào cũng có thể khẳng định chính xác tên loài của Trichoderma (T. Do giƣ̃a Trichoderma và các teleomorph của nó (Gliocladium hoặc Hypocrea) có tỉ lệ tương đồng di truyền vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 là ít có sự khác biệt , đồng thờ i trong quá trình sinh sản vô tính có thể xảy ra hiện tƣợng đột biến nên di truyền lại cho thế hệ sau hoặc sai sót từ quá trình phân chia tế bào và tác động của điều kiện sinh thái, địa lý, môi trường sống khác nhau nên sẽ dẫn đến nhiều sai khác và đa dạng trong kiểu gen của cùng loài Trichoderma. Kết quả phân nhóm từ trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 Với dữ liệu về trình tự vùng ITS – rDNA (11 dòng) và một phần vùng tef1 (8 dòng) nằm trong 5 loài Trichoderma: longibrachiatum, asperellum, virens, harzianum, atroviride.

Chúng tôi tiến hành so sánh các trình tự này với nhau bằng phần mềm Clustal X 1.83, kết quả đƣợc đọc bằng phần mềm TreeView 1.6.6, từ đó phân nhóm và xác định mối quan hệ di truyền giữa chúng. Chứng tỏ, đặc điểm về hình thái có mối quan hệ mật thiết với trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1, do đó, trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 có tác động lớn đến biểu hiện về kiểu hình. Kết quả phân nhóm trên 2 vùng ITS1 và ITS2 – rDNA cho thấy vùng ITS2 có kết quả phân nhóm đúng với kết quả phân nhóm của toàn vùng ITS – rDNA và phù hợp với mối quan hệ về đặc điểm hình thái hơn so với vùng ITS1.

So sánh vùng ITS1 và ITS2 – rDNA với dữ liệu của chúng trên NCBI Vùng ITS – rDNA 11 dòng Trichoderma phân lập ở Việt Nam đƣợc so sánh với dữ liệu của chúng trên NCBI ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới bằng phần mềm Clustal X 1.83 và đọc kết quả bằng phần mềm TreeView 1.6.6. Chứng tỏ, trình tự vùng ITS2 có sự phân hóa di truyền đặc trƣng cho từng loài hơn vùng ITS1 và một lần nữa chứng minh kết quả phân nhóm vùng ITS2 đáng tin cậy hơn vùng ITS1 và vùng ITS2 là vùng quyết định kết quả phân nhóm vùng ITS – rDNA. Kết quả so sánh trên cho thấy các dòng có mối quan hệ di truyền phù hợp ở mức độ loài nên có thể khẳng định kết quả định danh của chúng tôi là đúng so với kết quả định danh dựa vào vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 trên thế giới.

Do đó, trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dòng Trichoderma sẽ hổ trợ cho việc định danh và so sánh sự đa dạng di truyền giữa các dòng Trichoderma Việt Nam với các dòng Trichoderma trên thế giới. Điều này mở ra triển vọng nhằm sử dụng vùng ITS – rDNA và nhất là một phần vùng tef1 để phân biệt giữa dòng Trichoderma bản địa (Việt Nam) với các dòng ngoại lai nhằm ngăn ngừa ô nhiễm sinh học có thể xảy ra trong tương lai và xác định nguồn gốc dòng Trichoderma.