Yêu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic trong quá trình lên men lactic từ mật rỉ đường

Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic có nhu cầu về dinh dƣỡng rất phức tạp, không một đại diện nào thuộc nhóm này có thể phát triển đƣợc chỉ có chứa glucose và NH4+. Vì thế người ta thường nuôi cấy chúng trên các môi trường phức tạp chứa một số lượng tương đối lớn cao nấm men, dịch cà chua hoặc thậm chí máu. Vi khuẩn lactic có thể sử dụng đƣợc nhiều carbohydrate nhƣ glucose, fructose, maltose, saccharose…các nguồn carbon này dùng để cung cấp năng lƣợng và tham gia vào hầu hết các cấu trúc của tế bào.

Đa số vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp đƣợc các hợp chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ, chỉ có một số loài có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất nitơ hữu cơ từ nguồn vô cơ. Tuy nhiên, để sinh trưởng và phát triển bình thường thì ngoài nitơ dưới dạng hỗn hợp các acid amin, vi khuẩn lactic còn cần những cơ chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ nhƣ: cao thịt, cao nấm men, pepton, casein…[13]. Ngoài các nguồn dinh dƣỡng trên, vi khuẩn lactic còn có nhu cầu rất lớn về các hợp chất hữu cơ khác cần cho sự phát triển của chúng nhƣ purine, pyrimidine.

Các muối amôn không thể đƣợc dùng làm nguồn nitơ duy nhất song hình nhƣ chúng gây một ảnh hưởng nhất định lên sự chuyển hóa một số acid amin. Sự vắng mặt glucose thì Mg2+ không ảnh hưởng đến sự ổn định của Lactobacillus delbrueckii nhƣng khi có glucose thì nó làm ổn định quá trình thủy phân (Rees và Pirt, 1979).

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men

Cơ chế của sự ổn định này chƣa đƣợc xác định, nhƣng tất cả các các trình tự thủy phân của kinase xem Mg2+ nhƣ là đồng nhân tố. Vì vậy, ta cần bổ sung các nguồn dinh dƣỡng trên với liều lƣợng thích hợp nhất giúp vi khuẩn lactic phát triển tốt, nâng cao hiệu suất lên men. Với vi khuẩn lên men lactic đồng hình, pH môi trường thường không ảnh hưởng đến các sản phẩm đặc trƣng của quá trình lên men, còn đối với vi khuẩn lactic dị hình, pH môi trường có ảnh hưởng đến việc tạo thành các sản phẩm lên men.

Khi pH môi trường cao thì sản phẩm tạo ra chủ yếu là acid lactic, còn khi pH môi trường thấp thì ngoài acid lactic còn có thêm acid acetic và nhiều sản phẩm phụ khác. Khi acid lactic được hình thành và nồng độ tăng dần trong quá trình lên men thì pH sẽ giảm và nồng độ acid lactic đạt khoảng 2,2% sẽ ức chế vi khuẩn lactic [15]. Để giúp vi khuẩn lactic phát triển bình thường không bị chính sản phẩm do hoạt động của chúng tạo ra ức chế, người ta cho vào môi trường các chất đệm thích hợp với một lượng đủ để trung hòa lượng acid sinh ra thông thường chất đệm này là CaCO3.

Trong quá trình lên men tạo sinh khối thường dựa trên cơ sở nuôi cấy một chủng thuần khiết, vì vậy việc đảm bảo cho tất cả các quá trình nuôi cấy từ giữ giống trong ống nghiệm, nhân giống trong bình erlen…đều phải đảm bảo vô trùng tuyệt đối. Hệ vi sinh vật tạp mhiễm, thường ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men ở những mức độ khác nhau có thể phá hủy các tế bào giống hoặc phá vỡ tế bào quá trình trao đổi chất cần thiết cho sự tạo thành các sản phẩm lên men.

Vật liệu

Thành phần và tỉ lệ của thuốc nhuộm và thuốc thử đƣợc trình bày ở mục 2 phần phụ lục.

Phương pháp thí nghiệm 1. Phân lập và sơ chọn giống

• Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo acid tổng và đặc điểm sinh hóa 1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo acid tổng
• Sản xuất acid lactic từ mật rỉ 1. Định lượng đường khử [10]

- Nguyên tắc: Hàm lƣợng acid trong dịch lên men có thể định lƣợng đƣợc bằng dung dịch kiềm chuẩn nhờ có sự đổi màu của dung dịch thuốc thử phenolphtalein. Đặc điểm sinh hóa - Thử phản ứng catalase - Kiểm tra khả năng sinh indol - Xem khả năng di động - Khả năng khử nitrate - Khả năng phân giải gelatin - Khả năng đông vón sữa. + Nguyên tắc: Có một vài tác nhân được sử dụng để định lượng đường nhờ các đặc tính khử của đường.

- Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Cách tiến hành: (xem mục 3.4 phần phụ lục). - Thiết lập mối tương quan giữa mật độ tế bào và OD 610 nm của dịch huyền phù tế bào. + Nguyên tắc của máy đo mật độ quang: vi sinh vật trong môi trường nuôi cấy có thể vừa hấp thu hoặc vừa phân tán ánh sáng làm cho ánh sáng truyền suốt bị giảm.

Nhƣ vậy, số lƣợng ánh sáng đƣợc hấp thu hoặc phân tán có quan hệ tỉ lệ thuận với số lƣợng vi sinh vật trong dịch nuôi cấy. + Tương quan giữa mật độ tế bào và OD 610 nm : Để hạn chế thao tác đếm số tế bào mỗi khi lấy mẫu, mật độ tế bào sẽ đƣợc suy ra từ độ đục của dịch nuôi cấy bằng cách dựa vào đồ thị tương quan giữa mật độ tế bào và độ đục của dịch huyền phù ở các OD khác nhau khi đo ở bước sóng 610 nm. * Dựng đồ thị tương quan tuyến tính giữa log mật độ tế bào (trục y) và độ đục của dịch huyền phù ở các OD khác nhau (trục x).

Khuấy liên tục trong 1giờ, sau đó để lắng thu đƣợc phần dịch và pha loãng dung dịch xuống phù hợp với tỉ lệ mật rỉ đã chọn, cho 0,5. % cao nấm men vào (điều chỉnh pH sau khi khử trùng bằng pH tối ƣu của khuẩn lạc đem sản xuất acid lactic). + Cho 10 % giống sản xuất vào môi trường chuẩn bị lên men, tiến hành lên men ở pH, nhiệt độ tối ƣu trong thời gian 7 ngày.

Trong thời gian lên men, lƣợng acid tạo ra liên tục nên ta phải trung hòa bằng CaCO3 để cho pH ổn định cho khuẩn lạc đó. Sau khi kết thúc quá trình lên men, loại bỏ dịch trên, thu đƣợc phần lactat canxi. Đem trung hòa lƣợng lactat canxi bằng H2SO4 , thu đƣợc phần dịch, đem lọc bằng than hoạt tính thu đƣợc dung dịch acid lactic.