Trình tự gen kháng nguyên HA của virus cúm chủng NIBRG-14 trong sản xuất vắc-xin cúm A/H5N1 tại Việt Nam

Virus cúm A

Hạt virus: Vỏ virus có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của virus, bản chất cấu tạo là màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm, được đặc hiệu hóa gắn các protein màng của virus. Có sự phân bố không đồng đều giữa các phân tử NA và HA (tỉ lệ khoảng 1NA/4HA), đây là hai loại protein kháng nguyên có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus ở tế bào cảm nhiễm [2,17]. - Phân đoạn 7: Kích thước 1027 bp, mã hóa cho protein M1 (Matrix protein), là protein nền, thành phần chính của virion và liên quan đến nhiều sự kiện quan trọng của virus.

- HPAI: là loại virus cúm A có khả năng gây tổn thương nhiều cơ quan nội tạng trong cơ thể nhiễm, trên gia cầm chúng thường gây chết 100% số gia cầm bị nhiễm trong vòng 48 h sau nhiễm. Đây là loại virus lây truyền rộng rãi và tạo nên các ổ bệnh trong tự nhiên của virus cúm A, loại này có thể trao đổi gen với các chủng virus có độc lực cao đồng nhiễm trên cùng một tế sức đề kháng của virus và trở thành loại virus HPAI nguy hiểm [4]. Đặc tính này cho phép HA được nhận biết và phân cắt bởi nhiều loại protease có mặt ở nhiều loại tế bào khác nhau, dẫn đến sự mở rộng giới hạn các mô có thể bị xâm nhiễm bởi virus [14,15].

Nếu không có NA thì virus sẽ bị bất hoạt do gắn chặt vào thụ thể sialic acid của tế bào chủ, không được giải phóng ra khỏi tế bào và dẫn tới mất khả năng gây nhiễm tế bào. Ở dạng NA-N1 của các chủng độc lực cao, trên phân tử protein này có đoạn nhỏ gọi là vùng “đảo ngược” tạo ra một lỗ hổng (hollow pocket), cấu trúc này không có ở N2 và N9.

Một số phương pháp phòng, chống bệnh cúm A/H5N1

NA phân giải thụ thể tế bào màng nhày đường hô hấp bằng cách cắt đứt các liên kết glucosid giải phóng ra Neuramininic acid. Quá trình này cho phép virus đi qua màng nhày và thoát khỏi các chất ức chế không đặc hiệu của cơ thể vật chủ. NA cũng phá hủy các thụ thể dành cho HA trên bề mặt của tế bào hồng cầu, mặc dù các tế bào không phải là đối tượng gây nhiễm.

Cùng với protease của tế bào chủ, NA tham gia tích cực vào quá trình phân cắt phân tử HA và phân cắt mối liên kết giữa thụ thể tế bào với HA. Các đột biến đó đã giúp cho virus trở nên thích nghi và gây bệnh cho nhiều loại vất chủ khác nhau [9]. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng chính cấu trúc này đóng vai trò như một nhân tố ức chế tác dụng của một số thuốc kháng virus [13].

Các vaccine phòng bệnh hiện nay dựa trên cơ sở 2 loại chính là vaccine truyền thống và vaccine thế hệ mới [1]. Vaccine vô hoạt đồng chủng (homonogus) là loại vaccine được sản xuất chứa cùng những virus cúm gà giống như chủng gây bệnh trên thực địa. + Vaccine tái tổ hợp có chứa vecto đậu gia cầm dẫn truyền: Sử dụng virus đậu gia cầm làm vecto tái tổ hơp mang gen H5 và N1 chống virus type H5N1 và H7N1.

+ Vaccine tái tổ hợp có vecto adenovirus dẫn truyền: Sử dụng plasmit adenovirus dẫn truyền, lắp ghép virus adeno có chứa gen kháng nguyên H5 từ đó làm vecto tái tổ hợp H5 phòng chống virus type H5N1. + Vaccine nhược độc virus cúm nhân tạo: Được sản xuất bằng kỹ thuật di truyền ngược, đó là việc lắp ghép virus cúm nhân tạo chứa đầy đủ hệ gen trong đó gen kháng nguyên H5 có vùng “độc” đã được biến đổi bằng kỹ thuất di truyền. Một số dạng hóa dược đang được dùng trong các thuốc ức chế virus không đặc hiệu tác dụng ngăn cản quá trình giải phóng virus ra khỏi tế bào nhiễm (ức chế NA), hoặc ức chế quá trình thoát vỏ (cởi áo) và bao gói của virus do ức chế vận chuyển protein NP vào nhân tế bào trong quá trình nhân lên của virus trong tế bào nhiễm [7].

Các chế phẩm chủ yếu là Rimantadine, Amantadine A/H5N1 đã xuất hiện sự kháng thuốc với hai thuốc này và Oseltamivir (Tamiflu) hoặc phác đồ hỗn hợp cả hai loại. Trong đó, Oseltamivir ức chế NA của mọi type virus cúm, được sử dụng uống dự phòng trong vòng 48 h sau tiếp xúc với mầm bệnh, và được sử dụng là thuốc dự trữ chiến lược phòng dịch cúm A/. H5N1, tuy nhiên thuốc cũng có một vài tác dụng phụ trên người được ghi nhận như gây rối loạn tâm thần và có thể gây độc sau điều trị liều cao, cần chú ý khi sử dụng [1,7].

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Phương pháp nghiên cứu 1. Tách chiết RNA tổng số

Nguyên tắc của phương pháp dựa vào sự hấp phụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260nm của các bazơ purin và pirimidin. - Pha loóng dung dịch RNA pha loóng 20 lần trong nước vụ trựng (5àl dung dịch RNA trong 95àl nước). - Dùng pipet chuyển dung dịch RNA đã pha loãng sang ống thạch anh của máy quang phổ Shimadzu và đo ở bước sóng 260nm.

Tổng hợp sợi cDNA từ RNA của virus giai đoạn này cần có enzyme Reverse Transcriptase và mồi ngẫu nhiên. Mẫu chứa các sợi cDNA có kích thước khác nhau và cDNA sẽ được dùng làm khuôn để tổng hợp nên những đoạn DNA đặc hiệu bằng phương pháp PCR. Nhân bản gen mã hoá kháng nguyên HA của virus cúm A/H5N1 chủng NIBRG-14 bằng phương pháp PCR.

Phản ứng giai đoạn này cần có đoạn mồi đặc hiệu cho gen mã hoá kháng nguyên HA của virus cúm và sự có mặt của Taq polymerase. Để nguội xuống khoảng 500C rồi đổ dung dịch vào khay agarose điện di có cài sẵn răng lược. - Tra mẫu: Lấy khoảng 5 àl sản phẩm trộn với 3 àl màu loadingdye 10X tra vào các giếng nhỏ trong gel.

- Nhuộm DNA bằng Ethidium bromide: Bản gel được lấy nhẹ ra khỏi khuụn và ngõm vào dung dịch nhuộm này với nồng độ 2àl trong thời gian khoảng 10 phút trên máy lắc nhẹ. - Tách dòng đoạn DNA mã hoá cho kháng nguyên HA của virus cúm H5N1 được tiến hành bằng cách gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng. Cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung Amp và X-gal, sau đó đem mẫu đi ủ ở 370C qua đêm.

Cơ chế biến nạp gồm việc làm thay đổi thành phần cấu trúc thành tế bào của vi khuẩn để DNA plasmit dễ dàng chui vào tế bào thể nhận. Trong kỹ thuật xác định trình tự bằng máy tự động, người ta không đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ mà bằng chất huỳnh quang có màu khác nhau. - Cho chạy phản ứng với các thành phần tham gia sau đó tinh sạch sản phẩm để xác định trình tự.